抑制性差减杂交SSH技术

1、抑制性差减杂交SSH技术SSH(SuppressionSubtractiveHybridization)技术是可用大规模比较或是分离差异表达基因的-种有效的方S(DiaichenkoLetal,1999、是曲加卅大学旧金山分校、CLONTECH公司和俄国科学曉于1996年联合开发的(DiatachenkoLet肚,19%).其生要原理是以抑制PCR为基础.cDNA的差减杂交.抑制PCR技术是利用非目标序列片段两端长方向重复的序列在退火时产生的类似发卡互补的结构无法作为其模扳与引物之间配对，进而选择性的抑制非目性基因片段的扩WL差减杂交之后，依据帰性动力学原理，浓度相对较高的車链cDNA分子迅速

2、进If复性.诫度相对低的单链cDNA的分子仍然以单链的形式存在，使得杂交之后不仅目的基因片段间的丰度差异几乎消除，并且富築了目的査异基因。SSH技术基本过程屆提取同种物种的2种不同细胞的(T即ter和Driver)mRN扎由反转录形成cDNA,并采用Rsal限市惟内切酶切割成为小片段，再将TestercDNA分成2份，分别连接不相同的接头.各自与DrivercDNA进行杂交"然后再混合成两份杂交样品，同时加入新的过直的变性drivercDNA来第二枕差减杂交在杂交完全之片补平粘性末端.之后加入引慟(即接头I和接头II的单链寡核甘酸片段)进而琲行第2轮的PCR扩瓠第一次PCR是基于抑制

3、反应，只在两端连有两个不同的接头双错cDNA片段才能得以指数扩増。第二轮PCR实际为集式PCR,其极大提高了扩增特异性，最终差异表达的目的基因片大量富集。1.32抑制性差减杂交技术的特点与以往的差减杂交技术相比较而宫，SSH技术巧妙的利用了抑制性PCR扩增技术,一定程度上克服了其它差减杂交技术的峡陷，其优点具体表现在以下的几个方面:第一,由杂交动力学原理的第1步杂交可使不同丰度mRNA分子基本趋于一致，有效克服r由不同mRNA分子拷贝数冃的不同而产生对杂交结果的影响，大大地提高了抑制芳减灵敏度，保证了低丰度mRNA的检出。第二，速度快，效率高.SSH技术既无需采取任何中间步骤分离单链或双链cD

4、NA,又仅需一轮的差减杂交，就可对差异性表达的cDNA分了片段进行上千倍地富集，定程度上简化了操作步骤。第二，假阳性大大降低，这也是SSH技术相对于其他技术的最大优点，其两步杂交和两次PCR过程可以保证阳性克隆率高达94%(VonSteinODeraZ,1997).另外,SSH技术也有一定的缺点：首先，该技术至少需要2ug的mRNA.若mRNA数1：不足或质量不高，很可能检测不到低丰度差异表达基因的cDNA,而如此数量的mRNA有时不易获得。并且，在差减杂交开始前，虽然可通过将Driver和TestercDNA扩增得到足够的cDNA样品，但有时也会因此而丧失一些序列，所以对mRNA数量的要求已

5、经成为其普遍应用中的一大障碍。其次，由于差减杂交文库中的cDNA已经过限制性内切酶的消化，因此，不再是全长cDNA。再次，该技术不能同时在数个材料之间进行比较，有时材料之间存在过多的差异及小片段缺失也不能被有效地检测到.1.33抑制性差减杂交技术的应用SSH技术自1996年提出以來就倍受关注，到目前为止该方法己成功的应用到细胞分化、发育、再生和衰老等研究之中。同时也应用在分离不同的器官组织间、个体的不同发育阶段及受到外界因子的作用而差异表达基因等方面的一些研究。目前该技术已涉及的作物包括小麦(骆蒙等，2002)、玉米(CaoPern/,2003)、棉花(刘军等，2000)、水稻(王永胜等，20

6、00)>大麦(BahnSCer07,2001X马铃曹(BrichPRJe/M.,1999)、拟南芥(KangHGefM,2003)等，近毎来，该技术己广泛应用于分离不同生物胁迫或非生物胁迫诱导下的差异表达基因(黄鑫等，2006)oMi等从水稻愈伤组织SSH文库中分离出了MDCD5基因，该基因在低温或盐胁迫下呈上调表达；李付广尊(2009)构建了棉花在干旱胁迫条件下的SSH文库，并从中获得了大量与棉花抗早相关的ESTs；Liao等(2003)构建了大豆在盐胁迫条件下的SSH文库，并从中克隊了酸性确酸酶基因GmB4P3：严小龙等(2007)以普通菜豆为材料，沟建了低磷胁迫诱导的CD7A叢减文

7、库.并克降了3个与磷管养代谢相关的基因Pv/DWTiH,PvPS2,PvP77刘春燕竿(2005)构建了富集大豆抗花叶病毒病初期基因的cDNA文库，通过对文库进行测序，初步分析了参与抗病反应的墓因种类、数量及相关生化代谢和信号传导途径.唐建新等(2009)利用SSH技术，分离鉴定了16个硅藻缺氮胁迫诱导的上调表达基因，为阐明硅藻利用氯源分子机制提供了依据。另外，YiKK(2005)、吴忠长等(2004)通过筛选和分析水稻SSH文库，发现了磷高效转录因子OsPTFl.该基因增强表达可使水稻植株干物重和磷含量离出野生型30%以上.赵静等(2004)以具有确高效、根构型适应性变化大的大豆品种为材料，

8、以幼苗在低磷条件下的植袜地上部为驰动子(Driver),地下那为检测子(Tester),建立了低磷条件下大豆根部cDNA差减文库。通过序列分析及同源性比较，最终发现21个已知功能基因和9个未知功能基因，这些基因涉及到植物生长发育、营养吸收和代谢、对逆境抗性及其它一些适应性反应共4个方面.由此可见.通过构建和分析不同胁迫诱导下的SSH文库，可为转基因育种提供有价值的功能基因。T*S«ondhyDridtratton:mlisamplM,.addfresndenatureddrtver.andannealJFtUintheends1M34RNA1M34RNAPotyARNAConditi

9、onalcDNAtynthewsConditionalcDNAtynthewsSMART*7如申lrc0NA&溯A*"®tirMrcMUAmIdiowtfion>cONAw*hAdaptor1DrivercONA(inxcm)1«t>rcDNAwithAdaptor2RAddprim亠AmplifyfryPCRa.anoampancawnDfDnoampttflcatcncHwuampUQgneMponertialin)phflc4rtion图l抑制ifl减杂交技术的浪程Fig-lThePCR-SclecteDNAsubtractiontech

10、nique甜瓜又为称甘瓜或者呑瓜。甜瓜因其味甜而得名.因其清香诱人故又名香瓜.甜瓜足夏季消署的瓜果，它的替养价值可与西瓜相她羌。拯測定，甜瓜含有的水分和蛋白质含量稍低于西瓜外，其他的营养成分均不少于西瓜，而其芳香物质、糖分和维生素C、矿物质的含量则明显的商于西瓜。据研究多食甜瓜，有利于人们体心脏和肝脏及肠道系统的活动，能促进造血机能和内分泌。据医学确认，甜瓜具有“解烦泯，消暑热，利小便”的显著功效。目前，在蔬菜的生产中，甜瓜以高产高效成为筒丸和保护地的主栽黄菜之一.因而，甜瓜的品质和产量成为我们育种研究的重点内容.瓜类黄菜在设施栽培中足亟要类的蔬菜，其中甜瓜为典型之一，在我国设矗栽培中所占的面

11、积较大。瓜类蔬菜是以果实为主要经济器官，其果实的早熟和品质与广大农民的经济利益息息相关。然而由丁我国设施栽培相对简陋造成的低温，离遢和弱光等囚索会严重影响果实的座果和发育.因比，分析甜瓜果实发育中的形态、生理和分子调整机理等方面的变化有助于我们了解果实调控发育的机理，寻找解决一些当前问題的方法和手段。近年来，果实的生长和发育一直都是研究领域的热门课题，但是，随着生物化学、牛理学和分子生物学及直交叉学科的快速发展.我们发现在果实发育中还有许多值得商榷和置疑的地方。多年来，人们大多围绕芨菜果实发育的研究对彖主耍以黄瓜和帚茄为模式，分析了杲实在发育的不同阶段形态和生理方面的些变化及其内在刃了调控机制在得出大最的关于果实成菸阶段的关犍性结论Z外，还发现在果实发肓前期的座果、纸胞分裂及细胞膨大等方面在果实生长发育中也起了重要的作用，这些研究表明，果实的座果率主要足由植物生长物质來决定，在果实发育的前期在很大程度上决定了果实生长的最终的形态.细胞分裂存在于开花后的一个星期之内，但是细胞膨大是从绍凰分裂结束Z后开始的，一直延续至果实成熟.所以，果实授粉之后幼果的发育成为我们研究的重点所在.尽管关于和用