RPN4的生理功能及其降解研究

1、yiT论女第表匸家RPN4 的生理功能及其降解研究【摘要】：泛素-蛋白酶体降解系统一直是胞内用来清除异常的蛋白质 和选择性降解各种生化过程中调控蛋白的执行者，它可以降解错误折叠的蛋白也可以及时更新细胞周期过程中的调控因子，对细胞的各种生化过程进行精密的调节，从而可以将胞内的蛋白质总量维持在一个 相对恒定的水平，保证正常生命活动的规律性。芽殖酵母的RPN4(RegulatingParticleNoneATPase-4 基因，亦称 S0N1 禾口 UFD5，最开始是作为温度敏感株的抑制子 Suppressor 被发现的，即 PRN4 的 失活突变可以恢复 sec63-101 在限制温度下的生长缺陷

2、。后来发现， RPN4基因的突变还可以稳定泛素融合底物(UFDpathway 的底 物)UB-V-Bgal在不影响其多聚泛素化的情况下，阻碍 26S 蛋白酶体 对它的降解，因此亦被命名为 UFD5。以前的研究表明在蛋白酶体的 32 个亚基中有 26 个基因的上游启动子区域含有 PACE(Proteasome-associatedcontrolelemer 序列，而 RPN4 正是这段 顺式转录元件的反式转录因子，并且其自身的降解也必须靠蛋白酶体 来实现。这暗示了一种负反馈调控机制的存在：RPN4 上调蛋白酶体亚基的水平，上调的亚基组装成有活性的蛋白酶体又反过来降解自身 的转录激活因子，从而将其

3、下游转录产物一一蛋白酶体亚基维持在一 个相对恒定的水平，保证细胞正常的生命活动。本论文的结果提供了 直接的证据证明负反馈调控机制的存在，首先在两种不同的蛋白酶体活性受损的菌株内观察到 RPN4 蛋白的半衰期大大延长，稳定性明显升高，随后检测受其调控的下游蛋白酶体亚基的水平，发现与野生型相比，在蛋白酶体活性受损的突变型酵母菌株内其各个亚基的丰度都 有大幅度提高，Northern 检测证实这种升高是由转录水平的增强引起 的并且随着 RPN4 稳定性的增加而增加。 这些结果都表明在蛋白酶体 活性受损的菌株内由于对 RPN4 的降解能力减弱，增加了 RPN4 在细 胞内的丰度，上调了其各个亚基的转录水

4、平，从而在数量上对胞内受 损的蛋白酶体给与补充，使其达到新的动态平衡，维持细胞正常的蛋 白酶体活力水平。之后我们做了大量的酵母菌株表型测试试验， 结果 与预想的一致，在蛋白酶体单亚基突变造成的活性受损菌株中酵母的 存活率与生长速度都与野生型相差无几， 但是当在实验中同时损伤蛋 白酶体的活性并去除 RPN4 介导的负反馈调控机制之后，菌株就表现 出强烈的合成致死效果，存活率大大降低，生长速度也十分缓慢，可 见在 RPN4 缺失的情况下，受损的蛋白酶体无法在数量上得到补给， 给菌株的生长带来了毁灭性的灾害。此外，为了研究蛋白酶体【关键 词】：RPN4 蛋白酶体泛素依赖性降解 UBR2RAD6负反馈

5、调控【学位授予单位】：华东师范大学【学位级别】：博士【学位授予年份】：2006【分类号】：Q936C 易发表用yiT论女第表匸冢【目录】 ： 中文摘要 9-12 英文摘要 12-17 第一章 RPN4 对 26S 蛋白酶 体的负反馈调控 17-34 摘要 17-18 前言 18-19 材料与方法 19-23 结果23-261.26S 蛋白酶体活性受损稳定了 RPN4 并导致其下游基因 PRE6 表达量上升 232.26S 蛋白酶体活性受损导致其自身亚基的转录水平上 升23-243.26S 蛋白酶体活性受损的菌株内亚基表达量的升高是RPN4依赖性的244.RPN4稳定性的增强可以直接诱导蛋白酶体

6、亚基表达量 升高24-26讨论 26-27版图与说明 27-34第二章 RPN4-蛋白酶体负反 馈调控对蛋白酶体突变株存活和生长的影响34-45 摘要 34-35 前言35-36 材料与方法 36-37 结果 37-391 在蛋白酶体活性受损的菌株内同 时缺失 RPN4 会导致强烈的合成致死 37-382.在 RPN4 基因缺失的菌 株内表达末端带有TAG的蛋白酶体亚基PRE2同样导致强烈的合成 致死38-393.精确测量上述不同基因型的子代酵母和亲本酵母在生长 速度和存活率方面的差异 39 讨论 39-42 版图与说明 42-45 第三章 DNA 损伤修复中的RPN4-蛋白酶体反馈调控 45

7、-57 摘要 45-46 前言 46-47 材料与方法 47-49结果 49-501 在 DNA 损伤试剂 MMS 作用下, 蛋白酶体表达量的上升是RPN4 依赖的 49-502 验证在 DNA 损伤试剂 MMS 作用下,RPN4-蛋白酶体反馈调控机制的存在 50 讨论 50-52 版图 与说明 52-57 第四章 RPN4 泛素依赖的降解途径的 E3-UBR2的发现 57-68摘要 57-58前言 58材料与方法58-59 结果 59-611 在所有已知的E3 中，只有 UBR2 的缺失才能稳定 RPN4(11-229)59-602UBR2 的缺失 使得全长 RPN4 的稳定性增强 60-6

8、1 讨论 61-62 版图与说明 62-68 第 五章RPN4 多聚泛素化反应中 E2 的发现以及体外重建整个泛素化反应过程 68-81 摘要 68-69 前言 69-70 材料与方法 70-73 结果 73-751 可 以与 UBR2 结合的蛋白 RAD6 的缺失使 RPN4U -10 稳定 73-742 底物 蛋白RPN4X1-10 和 RPN4U-10/10R 都可以与 E3-UBR2 结合 743 只 有在UBR2,RAD6同时存在的情况下,RPN411-531才可以发生多聚泛 素化反应74-75 讨论 75-77 版图与说明 77-81 第六章蛋白酶体活性受 损的情况下,RPN4 在胞内累积对酵母细胞生长状况的影响 81-96 摘要 81-82 前言82-83 材料与方法 83-85 结果 85-881UBR2 缺失的菌株内蛋 白酶体亚基PRE1 的表达量上升 85-862UBR2 缺失的菌株内过量表达 RPN4 对酵母的生长没有显著的影响 863 在蛋白酶体活性受损的菌株 内过量表达 RPN4严重影响菌株的存活 86-874 在蛋白酶体活性受损 的菌株内过量表达丧失了转录活性的RPN4 对酵母