第六章-动植物细胞培养

1、生物反应工程原理生物反应工程原理李艳李艳 教授教授生物科学与工程学院生物科学与工程学院第六章第六章 动植物细胞培养动植物细胞培养v动植物细胞培养技术：动植物细胞培养技术：将动植物组织、器官在适当将动植物组织、器官在适当的培养基上进行离体培养的技术。的培养基上进行离体培养的技术。v组织：组织：指由结构和功能相似的细胞和细胞间质组成，指由结构和功能相似的细胞和细胞间质组成，具有一定形态和生理功能的聚集体。具有一定形态和生理功能的聚集体。v器官：器官：指机体中具有特殊结构和完成特殊功能的分指机体中具有特殊结构和完成特殊功能的分化部分。化部分。v组织与器官培养：组织与器官培养：在人工条件下，使它们得以

2、继续在人工条件下，使它们得以继续生存或发展的一种培养方法。生存或发展的一种培养方法。第一节第一节 动植物细胞培养的特性动植物细胞培养的特性v一、动物细胞培养的特性一、动物细胞培养的特性v技术发展历史：技术发展历史：v19071907年，美国，年，美国，HarrisonHarrison首次将蛙的神经组织在试管内培养首次将蛙的神经组织在试管内培养成功。成功。v19501950年，年，EndersEnders及同事发表第一篇在培养细胞中生长病毒的及同事发表第一篇在培养细胞中生长病毒的报告。报告。v19721972年，年，KnazekKnazek等创立中空纤维细胞培养技术，使细胞体外等创立中空纤维细胞

3、培养技术，使细胞体外培养扩展为大规模培养。培养扩展为大规模培养。v19861986年，年，DemoDemo生物公司用微囊化技术大规模培养杂交瘤细胞生物公司用微囊化技术大规模培养杂交瘤细胞生产单克隆抗体获得成功。生产单克隆抗体获得成功。v随后，动物细胞培养技术日趋完善。随后，动物细胞培养技术日趋完善。与微生物培养相比动物细胞培养特性：与微生物培养相比动物细胞培养特性：v1 1、动物细胞无细胞壁，机械强度低，适应环境能力差；、动物细胞无细胞壁，机械强度低，适应环境能力差；v2 2、生长速度缓慢，易受微生物污染，培养时需要抗生素。、生长速度缓慢，易受微生物污染，培养时需要抗生素。大多数哺乳动物细胞需

4、附着在固体或半固体的表面才能生长；大多数哺乳动物细胞需附着在固体或半固体的表面才能生长；v3 3、对营养要求严格；、对营养要求严格；v4 4、大规模培养时，不可简单地套用微生物培养的经验。、大规模培养时，不可简单地套用微生物培养的经验。v5、动物细胞培养基配方复杂，需补充血清和蛋白胨。动物细胞培养基配方复杂，需补充血清和蛋白胨。大规模细胞培养的主要危害是微生物污染。大规模细胞培养的主要危害是微生物污染。v设备、培养基、悬浮系统和操作方法等的复杂性是设备、培养基、悬浮系统和操作方法等的复杂性是引起微生物污染的主要原因。引起微生物污染的主要原因。v支原体的感染能力强，且不易检出，对动物细胞培支原体

5、的感染能力强，且不易检出，对动物细胞培养的威胁最大。养的威胁最大。v大规模细胞培养需要有一个设备精良的细胞库（大规模细胞培养需要有一个设备精良的细胞库（cell cell bankbank）。）。v动物细胞的脆性是导致培养控制复杂化的关键。动物细胞的脆性是导致培养控制复杂化的关键。动物细胞培养动物细胞培养生产的产品生产的产品疫苗疫苗干扰素干扰素单克隆抗体单克隆抗体遗传重组产品遗传重组产品动物细胞培养过程中的特征：动物细胞培养过程中的特征：v生长速度慢，易受微生物污染，但可采用在培养生长速度慢，易受微生物污染，但可采用在培养过程中加入抗生素等措施来解决。过程中加入抗生素等措施来解决。v细胞个体大

6、且无壁，对环境敏感，因此应慎重解细胞个体大且无壁，对环境敏感，因此应慎重解决供氧（搅拌与通风）与细胞脆弱的矛盾。决供氧（搅拌与通风）与细胞脆弱的矛盾。v设备放大是一新课题，不能完全按照微生物反应设备放大是一新课题，不能完全按照微生物反应过程的经验。过程的经验。v反应过程成本高，主要用于高附加值产物的生产。反应过程成本高，主要用于高附加值产物的生产。二、植物细胞培养特性二、植物细胞培养特性v植物细胞培养发展历史植物细胞培养发展历史v19021902年，出生于奥地利的德国植物学家年，出生于奥地利的德国植物学家G.HaberlandtG.Haberlandt预言植物细胞培养的可能性。预言植物细胞培养

7、的可能性。v19371937年，法国和美国科学家成功进行胡萝卜和烟草年，法国和美国科学家成功进行胡萝卜和烟草的组织培养。的组织培养。v19541954年，年，MuirMuir等第一次进行植物细胞悬浮培养。等第一次进行植物细胞悬浮培养。v19661966年，年，KleinKlein指出利用植物细胞培养生产生化产品。指出利用植物细胞培养生产生化产品。与微生物相比植物细胞的特性：与微生物相比植物细胞的特性：v1 1、细胞个大，细胞壁以纤维素为主要成分，耐拉不、细胞个大，细胞壁以纤维素为主要成分，耐拉不耐扭，抗剪切能力低。耐扭，抗剪切能力低。v2 2、生长速率慢，为防止培养过程中染菌，需加抗、生长速率

8、慢，为防止培养过程中染菌，需加抗生素。生素。v3 3、细胞培养需氧，但培养液黏度大，且不能强力、细胞培养需氧，但培养液黏度大，且不能强力通风搅拌。通风搅拌。v4 4、产物在细胞内，且产量低。、产物在细胞内，且产量低。v5 5、培养中细胞常生长成各种大小的团块，增加了、培养中细胞常生长成各种大小的团块，增加了悬浮培养的难度。悬浮培养的难度。植物细胞培养的工业化产品：植物细胞培养的工业化产品：v朝鲜参皂角苷、桉树油、生物碱等。朝鲜参皂角苷、桉树油、生物碱等。v兰花等名贵花卉、紫杉醇等兰花等名贵花卉、紫杉醇等v植物细胞培养技术：植物细胞培养技术：v诱导子、前体饲喂、两相法培养、质体转化、诱导子、前体

9、饲喂、两相法培养、质体转化、毛状根、冠瘿瘤组织培养，固定化技术。毛状根、冠瘿瘤组织培养，固定化技术。第二节第二节 动物细胞大规模培养动物细胞大规模培养v一、动物细胞的形态一、动物细胞的形态v二、动物细胞培养基二、动物细胞培养基v三、动物细胞培养方法三、动物细胞培养方法v四、动物细胞培养技术和工艺四、动物细胞培养技术和工艺一、动物细胞的形态一、动物细胞的形态v1 1、成纤维细胞型、成纤维细胞型v2 2、上皮细胞型、上皮细胞型v3 3、游走细胞型、游走细胞型v4 4、多形性细胞型、多形性细胞型v5 5、悬浮型细胞、悬浮型细胞1 1、成纤维细胞型、成纤维细胞型v这种细胞形态与体内成纤维细胞形态相似故

10、这种细胞形态与体内成纤维细胞形态相似故而得名。细胞体呈梭形或不规则三角形，中而得名。细胞体呈梭形或不规则三角形，中央有圆形核，胞质向外伸出央有圆形核，胞质向外伸出2 23 3个长短不同个长短不同的突起。如血管内皮、心肌、平滑肌、成骨的突起。如血管内皮、心肌、平滑肌、成骨细胞等。细胞等。2 2、上皮细胞型、上皮细胞型v细胞呈扁平的不规则三角形，中央有圆形核，生长细胞呈扁平的不规则三角形，中央有圆形核，生长时常彼此紧密连接单层细胞片，起源于外胚层和内时常彼此紧密连接单层细胞片，起源于外胚层和内胚层组织的细胞，如皮肤表皮及衍生物（汗腺、皮胚层组织的细胞，如皮肤表皮及衍生物（汗腺、皮脂腺等）。肠管上皮

11、、肝、胰和肺泡上皮细胞。脂腺等）。肠管上皮、肝、胰和肺泡上皮细胞。 3 3、游走细胞型、游走细胞型v细胞的培养需要在支持物上生长，一般不连接成片，细胞的培养需要在支持物上生长，一般不连接成片，细胞胞质经常出现伪足和突起，呈活跃的游走和变细胞胞质经常出现伪足和突起，呈活跃的游走和变形运动，速度快而且方向不规则。形运动，速度快而且方向不规则。 4 4、多形性细胞型、多形性细胞型v除上述三种细胞外，还有一些组织和细胞，如神经除上述三种细胞外，还有一些组织和细胞，如神经组织的细胞等，难以确定它们的稳定形态，可统归组织的细胞等，难以确定它们的稳定形态，可统归多形性细胞。多形性细胞。5 5、悬浮型细胞、悬

12、浮型细胞v这类细胞常呈圆形，不贴附在支持物上，呈现悬浮这类细胞常呈圆形，不贴附在支持物上，呈现悬浮状态生长。如血液细胞，淋巴组织细胞及肿瘤细胞。状态生长。如血液细胞，淋巴组织细胞及肿瘤细胞。培养这类细胞也可采用微生物培养的方法进行悬浮培养这类细胞也可采用微生物培养的方法进行悬浮物培养。物培养。二、动物细胞培养基二、动物细胞培养基v1 1、动物细胞培养的环境要求、动物细胞培养的环境要求v2 2、培养基组成、培养基组成v3 3、常用的合成培养基、常用的合成培养基v4 4、培养基制备应考虑的因素、培养基制备应考虑的因素1 1、动物细胞培养的环境要求、动物细胞培养的环境要求v温度温度v来源不同的动物细

13、胞，其最适的生长温度是不尽相来源不同的动物细胞，其最适的生长温度是不尽相同的，同的，昆虫昆虫细胞的最适温度是细胞的最适温度是 25252828，人和哺人和哺乳动物乳动物细胞的最适温度细胞的最适温度3737。鸟类鸟类细胞在细胞在38.538.5时时生长最佳。生长最佳。v动物细胞对低温的耐受力比对高温的耐受力强，如动物细胞对低温的耐受力比对高温的耐受力强，如温度升至温度升至4545时，时，1h1h内人和哺乳动物细胞将被杀死；内人和哺乳动物细胞将被杀死；相反，降低温度把细胞置于相反，降低温度把细胞置于25253535时，细胞仍能时，细胞仍能生长，但速度减慢，并维持长时间不死。生长，但速度减慢，并维持

14、长时间不死。vpHpH值值v动物细胞合适的动物细胞合适的pHpH值一般在值一般在7.27.27.47.4，低于，低于6.86.8或或高于高于7.67.6时都对细胞产生不利的影响，严重时可导时都对细胞产生不利的影响，严重时可导致细胞退变或死亡。原代培养细胞对致细胞退变或死亡。原代培养细胞对pHpH值的变化耐值的变化耐受性差，传代细胞对受性差，传代细胞对pHpH值变化的耐受性较强。对于值变化的耐受性较强。对于大多数细胞来说，偏酸性环境比碱性环境更有利于大多数细胞来说，偏酸性环境比碱性环境更有利于细胞的生长。细胞的生长。v营养成分营养成分v营养物质包括碳源、氮源、氨基酸、无机盐、微量营养物质包括碳源

15、、氮源、氨基酸、无机盐、微量元素、生长因子等。元素、生长因子等。v渗透压等其它因素渗透压等其它因素v渗透压对动物细胞也有影响。其他因素如血清、剪渗透压对动物细胞也有影响。其他因素如血清、剪切力等对细胞也有很大的影响。切力等对细胞也有很大的影响。v支持物支持物v体外培养的大多数动物细胞需在人工支持物上单层体外培养的大多数动物细胞需在人工支持物上单层生长，常用支持物有：玻璃、塑料制品、微载体生长，常用支持物有：玻璃、塑料制品、微载体（聚苯乙烯、交联葡萄糖、聚丙烯酰胺、纤维素衍（聚苯乙烯、交联葡萄糖、聚丙烯酰胺、纤维素衍生物、几丁质、明胶等）。生物、几丁质、明胶等）。v气体气体v氧气：气相中最重要的

16、成分是氧气和二氧化碳。大氧气：气相中最重要的成分是氧气和二氧化碳。大多数动物细胞培养适合于大气中的氧含量或更低些。多数动物细胞培养适合于大气中的氧含量或更低些。据报道，对培养基硒含量的要求与氧浓度有关，硒据报道，对培养基硒含量的要求与氧浓度有关，硒有助于除去呈自由基状态的氧。在大规模细胞培养有助于除去呈自由基状态的氧。在大规模细胞培养中，氧可能成为细胞密度的限制因素。中，氧可能成为细胞密度的限制因素。vCOCO2 2 ：气相中：气相中的的COCO2 2浓度直接调节溶解态浓度直接调节溶解态COCO2 2的浓度，的浓度，溶解态的溶解态的COCO2 2受温度影响，受温度影响， COCO2 2溶于培养

17、基中形成溶于培养基中形成H H2 2COCO3 3，它又能再解离：，它又能再解离：v由于由于HCOHCO3 3- -与多数阳离子的解离数很小，趋于结合态，与多数阳离子的解离数很小，趋于结合态，故使培养基变酸。提高气相中故使培养基变酸。提高气相中COCO2 2 含量的结果是降含量的结果是降低培养液低培养液pHpH值，值，2 2、培养基的组成、培养基的组成v培养基是维持体外细胞生存和生长的基本溶液，是培养基是维持体外细胞生存和生长的基本溶液，是组织细胞培养最重要的条件。用于动物细胞培养的组织细胞培养最重要的条件。用于动物细胞培养的培养基可以分为天然培养基和合成培养基两大类。培养基可以分为天然培养基

18、和合成培养基两大类。v天然培养基：天然培养基：是使用最早、最为有效的动物细胞培是使用最早、最为有效的动物细胞培养基，它主要取自于动物体液或从动物组织分离提养基，它主要取自于动物体液或从动物组织分离提取而得，其取而得，其优点优点是营养成分丰富、培养效果良好；是营养成分丰富、培养效果良好；缺点缺点是成分复杂、个体差异大、来源有限。是成分复杂、个体差异大、来源有限。v天然培养基的种类很多，包括生物性体液（如血天然培养基的种类很多，包括生物性体液（如血清）、组织浸出液（如胚胎浸出液）、凝固剂（如清）、组织浸出液（如胚胎浸出液）、凝固剂（如血浆）等。血浆）等。v血清：血清：组织培养中最常用的天然培养基是

19、血清，血组织培养中最常用的天然培养基是血清，血清中含有包括大分子的蛋白质和核酸等丰富的营养清中含有包括大分子的蛋白质和核酸等丰富的营养物质，对促进细胞生长繁殖、黏附及中和某些物质物质，对促进细胞生长繁殖、黏附及中和某些物质的毒性起着一定的作用。用于组织培养的血清种类的毒性起着一定的作用。用于组织培养的血清种类很多，其来源主要是动物，有小牛血清、胎牛血清、很多，其来源主要是动物，有小牛血清、胎牛血清、马血清、兔血清以及人血清等，最广泛使用的是小马血清、兔血清以及人血清等，最广泛使用的是小牛血清和胎牛血清。牛血清和胎牛血清。v血浆：血浆：血浆不仅可用来支持培养组织块，而且还供血浆不仅可用来支持培养

20、组织块，而且还供给细胞生长的营养物质，但由于血浆很容易发生液给细胞生长的营养物质，但由于血浆很容易发生液化，目前已很少单独使用。一般使用的是禽类血浆。化，目前已很少单独使用。一般使用的是禽类血浆。v组织浸出液：组织浸出液：组织浸出液常用的是胚胎浸出液（如组织浸出液常用的是胚胎浸出液（如鸡胚浸出液），它的主要成分含有大分子的氨基酸，鸡胚浸出液），它的主要成分含有大分子的氨基酸，有促进细胞生长的作用。有促进细胞生长的作用。v水解乳蛋白：水解乳蛋白：是常用的一种天然培养基，是由乳白是常用的一种天然培养基，是由乳白蛋白经水解而制得，氨基酸的含量较高。一般配制蛋白经水解而制得，氨基酸的含量较高。一般配制

21、成成0.5%0.5%的溶液，或与合成培养基以的溶液，或与合成培养基以1 1：1 1共同使用。共同使用。v合成培养基合成培养基是根据天然培养基的成分，用化学物质是根据天然培养基的成分，用化学物质对细胞体内生存环境中各种已知物质在体外人工条对细胞体内生存环境中各种已知物质在体外人工条件的模拟，经过反复实验筛选、强化和重新组合后件的模拟，经过反复实验筛选、强化和重新组合后形成的培养基。合成培养基的种类虽然很多，但一形成的培养基。合成培养基的种类虽然很多，但一般都含有氨基酸、维生素、糖类、无机离子和一些般都含有氨基酸、维生素、糖类、无机离子和一些其他辅助性成分。其他辅助性成分。v氨基酸：氨基酸：是合成

22、培养基的主要成分，合成培养基中是合成培养基的主要成分，合成培养基中的氨基酸是以必需氨基酸为主。几乎所有的细胞对的氨基酸是以必需氨基酸为主。几乎所有的细胞对谷氨酰胺都有较高的要求。细胞需要谷氨酰胺合成谷氨酰胺都有较高的要求。细胞需要谷氨酰胺合成核酸和蛋白质。核酸和蛋白质。v维生素：维生素：是维持细胞生长的一种生物活性物质，它是维持细胞生长的一种生物活性物质，它们在细胞中大多形成酶的辅基或辅酶，对细胞的代们在细胞中大多形成酶的辅基或辅酶，对细胞的代谢有重大的影响。谢有重大的影响。v糖类：糖类：多数合成培养基都含有葡萄糖，它主要由糖多数合成培养基都含有葡萄糖，它主要由糖酵解作用代谢形成丙酮酸，并可转

23、化乳酸或乙酰乙酵解作用代谢形成丙酮酸，并可转化乳酸或乙酰乙酸进入柠檬酸循环形成酸进入柠檬酸循环形成COCO2 2。对胚胎细胞和转化细胞，。对胚胎细胞和转化细胞，乳酸在培养基中的积累特别明显。乳酸在培养基中的积累特别明显。v无机离子：无机离子：是细胞的重要组成部分之一，参与了细是细胞的重要组成部分之一，参与了细胞的代谢活动。培养基中的无机离子除胞的代谢活动。培养基中的无机离子除K K+ +、NaNa+ +等外，等外，还含有还含有FeFe2+2+、ZnZn2+2+、CuCu2+2+等微量离子。等微量离子。v其他成分：其他成分：在一些合成培养基中还含有一些代谢的在一些合成培养基中还含有一些代谢的中间

24、产物、氧化还原剂、三磷酸腺苷、辅酶中间产物、氧化还原剂、三磷酸腺苷、辅酶A A等成等成分。分。v尽管现在的合成培养基成分和含量已经较为复杂，尽管现在的合成培养基成分和含量已经较为复杂，但仍然不能完全满足体外培养细胞生长的需要，合但仍然不能完全满足体外培养细胞生长的需要，合成培养基中还是需要加入一定量的天然培养基予以成培养基中还是需要加入一定量的天然培养基予以补充。补充。3 3、常用的合成培养基、常用的合成培养基v目前合成培养基的种类已有数十种，大多数培养基目前合成培养基的种类已有数十种，大多数培养基都是为适应某种组织细胞的生长而在某种合成培养都是为适应某种组织细胞的生长而在某种合成培养基的基础

25、上改良而来的。目前较为常用的有基的基础上改良而来的。目前较为常用的有199199培培养液、养液、EagleEagle（MEMMEM、DMEMDMEM）培养液、）培养液、RPMI1640RPMI1640培养培养液、液、HAMHAM培养液等培养液等。v无血清培养基无血清培养基一般由基础培养液和替代血清的补充一般由基础培养液和替代血清的补充因子组成：因子组成：v基础培养基：基础培养基：是各种营养物质的混合物，是维持组是各种营养物质的混合物，是维持组织或细胞生长、发育、遗传、繁殖等一系列生命活织或细胞生长、发育、遗传、繁殖等一系列生命活动比不可少的物质，基础培养基的成分是完全已知动比不可少的物质，基础

26、培养基的成分是完全已知的，而且可以按照细胞的不同营养要求增加或减少的，而且可以按照细胞的不同营养要求增加或减少某些组分。某些组分。v补充因子：补充因子：是用来替代血清的各种因子的总称。其是用来替代血清的各种因子的总称。其种类很多，包括大分子、小分子物质和微量元素等。种类很多，包括大分子、小分子物质和微量元素等。补充因子又可分为必需补充因子和特殊补充因子。补充因子又可分为必需补充因子和特殊补充因子。v三类无血清培养基：三类无血清培养基：类型类型确定程度确定程度优点优点缺点缺点1 12 23 3无蛋白质，所有无蛋白质，所有成分明确成分明确含有纯化蛋白和含有纯化蛋白和激素激素非确定性生物添非确定性生

27、物添加剂取代血清加剂取代血清化学成分完化学成分完全明确全明确应用较广应用较广价格低廉，价格低廉，可以灭菌可以灭菌只适用于一些只适用于一些确立细胞系确立细胞系相对比较昂贵相对比较昂贵化学成分不太化学成分不太明确明确4 4、培养基制备应考虑的因素、培养基制备应考虑的因素v（1 1）pHpH值：值：一般正常的成纤维细胞系以一般正常的成纤维细胞系以pH=7.4pH=7.47.77.7最好，转化细胞以最好，转化细胞以7.07.07.47.4更合适，上皮细胞更合适，上皮细胞5.55.5合适。合适。v（2 2）缓冲能力：）缓冲能力：碳酸盐缓冲系统由于毒性小、成碳酸盐缓冲系统由于毒性小、成本低，对培养物有营养

28、作用，因此比其他缓冲系统本低，对培养物有营养作用，因此比其他缓冲系统用得多。但在生理用得多。但在生理pHpH值条件下的缓冲能力差。值条件下的缓冲能力差。 v（3 3）渗透压：）渗透压：一般常用冰点降低或蒸汽压升高测一般常用冰点降低或蒸汽压升高测定。定。v（4 4）黏度：）黏度：培养基黏度受血清含量影响，在多数培养基黏度受血清含量影响，在多数情况下，对细胞生长没有什么影响。情况下，对细胞生长没有什么影响。三、动物细胞培养方法三、动物细胞培养方法动物细胞培养方法悬浮培养贴壁培养固定化培养1 1、悬浮培养、悬浮培养v悬浮培养是指细胞在培养器中自由悬浮生长悬浮培养是指细胞在培养器中自由悬浮生长的过程，

29、主要用于非帖壁依赖性细胞的培养。的过程，主要用于非帖壁依赖性细胞的培养。v悬浮培养对设备的要求简单，但是悬浮培养悬浮培养对设备的要求简单，但是悬浮培养的细胞密度较低，转化细胞悬浮培养有潜在的细胞密度较低，转化细胞悬浮培养有潜在致癌危险，培养病毒易失去病毒标记而降低致癌危险，培养病毒易失去病毒标记而降低免疫能力。免疫能力。2 2、贴壁培养、贴壁培养v贴壁培养是指必须贴附在固体介质表面上生贴壁培养是指必须贴附在固体介质表面上生长的细胞培养，主要用于非淋巴组织和多异长的细胞培养，主要用于非淋巴组织和多异倍体等贴壁依赖性细胞的培养。由于大多数倍体等贴壁依赖性细胞的培养。由于大多数动物细胞属于贴壁依赖性

30、细胞，贴壁培养是动物细胞属于贴壁依赖性细胞，贴壁培养是动物细胞培养的一种重要方法。动物细胞培养的一种重要方法。v细胞贴壁一般分为贴壁因子吸附于培养表面、细胞贴壁一般分为贴壁因子吸附于培养表面、细胞与表面接触、细胞贴壁于培养表面和壁细胞与表面接触、细胞贴壁于培养表面和壁细胞在培养表面上扩展等几个步骤。细胞在培养表面上扩展等几个步骤。3 3、固定化培养、固定化培养v固定化培养是既适用于帖壁依赖性细胞，有固定化培养是既适用于帖壁依赖性细胞，有适用于非帖壁依赖性细胞的包埋培养方式，适用于非帖壁依赖性细胞的包埋培养方式，具有细胞生长密度高、抗剪切力和抗污染能具有细胞生长密度高、抗剪切力和抗污染能力强等优

31、点。一般对于贴壁依赖性细胞通常力强等优点。一般对于贴壁依赖性细胞通常采用胶原包埋，而对于非贴壁依赖性细胞则采用胶原包埋，而对于非贴壁依赖性细胞则常用海藻酸钙包埋。常用的细胞固定化的方常用海藻酸钙包埋。常用的细胞固定化的方法主要有吸附、共价帖附、离子法主要有吸附、共价帖附、离子/ /共价交联、共价交联、包埋和微囊化等。包埋和微囊化等。四、动物细胞培养技四、动物细胞培养技术和工艺术和工艺v大规模动物细胞培养的工大规模动物细胞培养的工艺流程艺流程v工艺过程中，先将组织切成碎工艺过程中，先将组织切成碎片，然后用溶解蛋白质的酶处片，然后用溶解蛋白质的酶处理而得到单个细胞，再用离心理而得到单个细胞，再用离

32、心法收集细胞。将细胞植入营养法收集细胞。将细胞植入营养培养基，使细胞在培养基中增培养基，使细胞在培养基中增殖到覆盖瓶壁表面，用酶把细殖到覆盖瓶壁表面，用酶把细胞从瓶壁上消化下来，再接种胞从瓶壁上消化下来，再接种到若干培养瓶中进行扩大培养，到若干培养瓶中进行扩大培养，将培养所得的细胞将培养所得的细胞“种子种子”冷冷藏于液氮中，从液氮中取出一藏于液氮中，从液氮中取出一部分细胞部分细胞“种子种子”进行解冻、进行解冻、复活培养，进行扩大培养以获复活培养，进行扩大培养以获得足够的细胞量，将细胞接种得足够的细胞量，将细胞接种于大规模生物反应器中进行大于大规模生物反应器中进行大规模培养，按照产物的不同形规模

33、培养，按照产物的不同形式进行产物分离纯化。式进行产物分离纯化。第三节第三节 植物细胞的培养植物细胞的培养v一、植物细胞培养流程一、植物细胞培养流程v二、植物细胞培养基的组成二、植物细胞培养基的组成v三、植物细胞培养的方法三、植物细胞培养的方法v四、植物细胞的大规模培养技术四、植物细胞的大规模培养技术v五、影响植物细胞培养的因素五、影响植物细胞培养的因素v植物细胞培养是指在离体条件下培养植物植物细胞培养是指在离体条件下培养植物细胞的方法。将愈创组织或其他易分散的细胞的方法。将愈创组织或其他易分散的组织置于液体培养基中，进行振荡培养，组织置于液体培养基中，进行振荡培养，使组织分散成游离的悬浮细胞，

34、通过继代使组织分散成游离的悬浮细胞，通过继代培养使细胞增殖，获得大量的细胞群体。培养使细胞增殖，获得大量的细胞群体。小规模的悬浮培养在培养瓶中进行，大规小规模的悬浮培养在培养瓶中进行，大规模可利用发酵罐生产。模可利用发酵罐生产。v植物细胞培养能生产一些微生物所不能合成植物细胞培养能生产一些微生物所不能合成的特有代谢产物，如生物碱类（尼古丁、阿的特有代谢产物，如生物碱类（尼古丁、阿托品、番茄碱等）、色素（叶绿素、类胡萝托品、番茄碱等）、色素（叶绿素、类胡萝卜素、叶黄素等）、类黄酮和花色苷、苯酚、卜素、叶黄素等）、类黄酮和花色苷、苯酚、皂角苷、固醇类、萜类、某些抗生素和生长皂角苷、固醇类、萜类、某

35、些抗生素和生长控制剂（赤霉素等）、调味品和香料等。控制剂（赤霉素等）、调味品和香料等。v细胞培养用于种苗生产，如兰花等名贵花卉细胞培养用于种苗生产，如兰花等名贵花卉和谷物良种的培育，可不受外界环境的影响。和谷物良种的培育，可不受外界环境的影响。工业化生产的植物细胞培养产物工业化生产的植物细胞培养产物一、植物细胞培养流程一、植物细胞培养流程v植物细胞培养与微生物培养类似，可采用液体培植物细胞培养与微生物培养类似，可采用液体培养基进行悬浮培养。植物组织细胞的分离，一般养基进行悬浮培养。植物组织细胞的分离，一般采用次氯酸盐的稀溶液、福尔马林、酒精等消毒采用次氯酸盐的稀溶液、福尔马林、酒精等消毒剂对植

36、物体或种子进行灭菌消毒。剂对植物体或种子进行灭菌消毒。v种子消毒后在无菌状态下发芽，将其组织的一部种子消毒后在无菌状态下发芽，将其组织的一部分在半固体培养基上培养，随着细胞增殖形成不分在半固体培养基上培养，随着细胞增殖形成不定形细胞团（愈创组织），将此愈创组织移入液定形细胞团（愈创组织），将此愈创组织移入液体培养基振荡培养，愈创化时间随植物种类和培体培养基振荡培养，愈创化时间随植物种类和培养基条件而异，慢的需几周以上，一旦增殖开始，养基条件而异，慢的需几周以上，一旦增殖开始，就可用反复继代培养加快细胞生殖。就可用反复继代培养加快细胞生殖。v继代培养可用试管或烧瓶等，大规模的悬浮培养继代培养可用

37、试管或烧瓶等，大规模的悬浮培养可用传统的机械搅拌罐、气升式发酵罐。可用传统的机械搅拌罐、气升式发酵罐。植物细胞大量培养流程及培养系统植物细胞大量培养流程及培养系统二、植物细胞培养基的组成二、植物细胞培养基的组成v植物细胞培养与动物细胞培养相比，其最大植物细胞培养与动物细胞培养相比，其最大的优点是植物细胞能在简单的合成培养基上的优点是植物细胞能在简单的合成培养基上生长。其培养基的成分由碳源、有机氮源、生长。其培养基的成分由碳源、有机氮源、无机盐类、维生素、植物生长激素和有机酸无机盐类、维生素、植物生长激素和有机酸等其他物质组成。等其他物质组成。常用的植物细胞培养基配比常用的植物细胞培养基配比v1

38、 1、碳源：蔗糖或葡萄糖是常用的碳源，果糖、碳源：蔗糖或葡萄糖是常用的碳源，果糖比前二者差。其他的碳水化合物不适合作为单比前二者差。其他的碳水化合物不适合作为单一的碳源。通常增加培养基中蔗糖的含量，可一的碳源。通常增加培养基中蔗糖的含量，可增加培养细胞的次生代谢产物量。增加培养细胞的次生代谢产物量。v2 2、有机氮源：通常采用的有机氮源有蛋白质、有机氮源：通常采用的有机氮源有蛋白质水解物（包括酪蛋白质水解物）、谷氨酸胺或水解物（包括酪蛋白质水解物）、谷氨酸胺或氨基酸混合物。有机氮源对细胞的初级培养的氨基酸混合物。有机氮源对细胞的初级培养的早期生长阶段有利。早期生长阶段有利。L-L-谷氨酰胺可代

39、替或补充谷氨酰胺可代替或补充某种蛋白质水解物。某种蛋白质水解物。v3 3、无机盐类：、无机盐类：通常在培养基中无机盐的浓度通常在培养基中无机盐的浓度应在应在25mmol25mmol左右。硝酸盐浓度一般采用左右。硝酸盐浓度一般采用252540mmol/L40mmol/L，虽然硝酸盐可以单独成为无机氮，虽然硝酸盐可以单独成为无机氮源，但是加入铵盐对细胞生长有利，如果添源，但是加入铵盐对细胞生长有利，如果添加一些琥珀酸或其他有机酸，铵盐也能单独加一些琥珀酸或其他有机酸，铵盐也能单独成为氮源。培养基中必须添加钾元素，其浓成为氮源。培养基中必须添加钾元素，其浓度为度为20mmol/L20mmol/L，磷

40、、镁、钙和硫元素的浓度，磷、镁、钙和硫元素的浓度在在1 13mmol/L3mmol/L之间。之间。v4 4、植物生长激素：大多数植物细胞培养基中、植物生长激素：大多数植物细胞培养基中都含有天然的和合成的植物生长激素。激素都含有天然的和合成的植物生长激素。激素分成两类既生长素和分裂素。分成两类既生长素和分裂素。v生长素在植物细胞和组织培养中可促使根的生长素在植物细胞和组织培养中可促使根的形成，最有效和最常用的有吲哚丁酸（形成，最有效和最常用的有吲哚丁酸（IBAIBA）、）、吲哚乙酸和奈乙酸。吲哚乙酸和奈乙酸。v分裂素通常是腺嘌呤衍生物。使用最多的是分裂素通常是腺嘌呤衍生物。使用最多的是6-6-卞

41、基氨基嘌呤（卞基氨基嘌呤（BABA）和玉米素（）和玉米素（Z Z）。分裂）。分裂素和生长素通常是一起使用，促使细胞分裂、素和生长素通常是一起使用，促使细胞分裂、生长。其使用量在生长。其使用量在0.10.110mg/L10mg/L之间，根据不之间，根据不同细胞株而异。同细胞株而异。v5 5、有机酸：加入丙酮酸或者三羧酸循环中间、有机酸：加入丙酮酸或者三羧酸循环中间产物如柠檬酸、琥珀酸、苹果酸、能够保证产物如柠檬酸、琥珀酸、苹果酸、能够保证植物细胞在以铵盐作为单一氮源的培养基上植物细胞在以铵盐作为单一氮源的培养基上生长，并且耐受钾盐的能力至少提高到生长，并且耐受钾盐的能力至少提高到10mmol10

42、mmol。v6 6、复合物质：通常作为细胞的生长调节剂如、复合物质：通常作为细胞的生长调节剂如酵母抽提液、麦芽抽提液、椰子汁和水果汁。酵母抽提液、麦芽抽提液、椰子汁和水果汁。但在许多例子中发现，有些抽提液对细胞有但在许多例子中发现，有些抽提液对细胞有毒性。目前仍在广泛使用的是椰子汁，在培毒性。目前仍在广泛使用的是椰子汁，在培养基中浓度是养基中浓度是1 115mmol/L 15mmol/L 。植物细胞培养基的制备植物细胞培养基的制备v培养基中使用的无机盐、碳源、维生素、有培养基中使用的无机盐、碳源、维生素、有机酸和植物生长激素都应该采用最高纯度级机酸和植物生长激素都应该采用最高纯度级的试剂和药品

43、。的试剂和药品。v难溶的激素，配制时可先溶于难溶的激素，配制时可先溶于2 25ml5ml的酒精的酒精中。配制培养基的用水应严格采用蒸馏水或中。配制培养基的用水应严格采用蒸馏水或高纯度的去离子水。高纯度的去离子水。v配制好的培养基按要求装入三角瓶或试管中，配制好的培养基按要求装入三角瓶或试管中，121121下灭菌下灭菌20min20min，待冷却后就可使用。对，待冷却后就可使用。对于一些热敏性化合物，灭菌时不可采用加热于一些热敏性化合物，灭菌时不可采用加热法，而应该采用过滤法灭菌，然后无菌操作法，而应该采用过滤法灭菌，然后无菌操作加入到已灭菌的培养基。加入到已灭菌的培养基。三、植物细胞培养的方法

44、三、植物细胞培养的方法v1 1、单倍体细胞培养、单倍体细胞培养v2 2、原生质体培养、原生质体培养v3 3、固体培养、固体培养v4 4、液体培养、液体培养v5 5、悬浮培养、悬浮培养v6 6、固定化培养、固定化培养1 1、单倍体细胞培养、单倍体细胞培养v主要用花药在人工培养基上进行培养，可以主要用花药在人工培养基上进行培养，可以从小孢子（雄性生殖细胞）直接发育成胚状从小孢子（雄性生殖细胞）直接发育成胚状体，然后长成单倍体植株；或者是通过愈创体，然后长成单倍体植株；或者是通过愈创组织诱导分化出芽和根，最终长成植株。组织诱导分化出芽和根，最终长成植株。2 2、原生质体培养、原生质体培养v植物的体细

45、胞（二倍体细胞）经过纤维素酶植物的体细胞（二倍体细胞）经过纤维素酶处理后可去掉细胞壁，获得的去壁细胞称为处理后可去掉细胞壁，获得的去壁细胞称为原生质体。原生质体。v该原生质体在良好的无菌培养基中可以生长、该原生质体在良好的无菌培养基中可以生长、分裂，最终可以长成植株。实际过程中，也分裂，最终可以长成植株。实际过程中，也可以用不同植物的原生质体进行融合与体细可以用不同植物的原生质体进行融合与体细胞杂交，由此可获得体细胞杂交的植株。胞杂交，由此可获得体细胞杂交的植株。3 3、固体培养、固体培养v固体培养是在微生物培养的基础上发展起来固体培养是在微生物培养的基础上发展起来的植物细胞培养方法。固体培养

46、基的凝固剂的植物细胞培养方法。固体培养基的凝固剂除特殊研究外，几乎都使用琼脂，浓度一般除特殊研究外，几乎都使用琼脂，浓度一般为为6 610%10%。接种材料放在培养基上，原生质。接种材料放在培养基上，原生质体固体培养则需混入培养基内进行嵌合培养，体固体培养则需混入培养基内进行嵌合培养，或者使原生质体在固体或者使原生质体在固体- -液体之间进行双相培液体之间进行双相培养。养。4 4、液体培养、液体培养v液体培养也是在微生物培养的基础上发展起液体培养也是在微生物培养的基础上发展起来的植物细胞培养方法。液体培养基可分为来的植物细胞培养方法。液体培养基可分为静止培养和振荡培养等两类。静止培养不需静止培

47、养和振荡培养等两类。静止培养不需要任何设备，适合于某些原生质体的培养。要任何设备，适合于某些原生质体的培养。振荡培养需要摇床等设备使培养物和培养基振荡培养需要摇床等设备使培养物和培养基保持充分混合以利于气体交换。保持充分混合以利于气体交换。5 5、悬浮培养、悬浮培养v悬浮培养是一种使组织培养物分离成单细胞悬浮培养是一种使组织培养物分离成单细胞并不断扩增的方法。在进行细胞培养时，需并不断扩增的方法。在进行细胞培养时，需要提供容易破裂的愈创组织进行液体振荡培要提供容易破裂的愈创组织进行液体振荡培养，愈伤组织经过悬浮培养可以产生比较纯养，愈伤组织经过悬浮培养可以产生比较纯一的单细胞。用于悬浮培养的愈

48、伤组织应该一的单细胞。用于悬浮培养的愈伤组织应该是易碎的，这样在液体培养条件下能获得分是易碎的，这样在液体培养条件下能获得分散的单细胞，而紧密不易碎的愈伤组织就不散的单细胞，而紧密不易碎的愈伤组织就不能达到上述目的。能达到上述目的。6 6、固定化培养、固定化培养v固定化培养是在微生物和酶的固定化培养基固定化培养是在微生物和酶的固定化培养基础上发展起来的植物细胞培养方法。该法与础上发展起来的植物细胞培养方法。该法与固定化酶或微生物细胞类似，应用最广泛的、固定化酶或微生物细胞类似，应用最广泛的、能够保持细胞活性的固定化方法是将细胞包能够保持细胞活性的固定化方法是将细胞包埋于海藻酸盐或卡拉胶中。埋于

49、海藻酸盐或卡拉胶中。四、植物细胞的大规模培养技术四、植物细胞的大规模培养技术v1 1、植物细胞的大规模悬浮培养、植物细胞的大规模悬浮培养v2 2、植物细胞或原生质体的固定化培养、植物细胞或原生质体的固定化培养v3 3、植物细胞培养方式、植物细胞培养方式1 1、植物细胞的大规模悬浮培养、植物细胞的大规模悬浮培养v悬浮培养通常采用水平振荡，可变速率为悬浮培养通常采用水平振荡，可变速率为3030150r/min150r/min，振荡，振荡2 24cm4cm，温度，温度24243030。适合于愈伤组织培养的培养基不一定适合悬适合于愈伤组织培养的培养基不一定适合悬浮细胞培养，实际过程中就需要寻找适合于浮

50、细胞培养，实际过程中就需要寻找适合于悬浮培养物快速生长、有利于细胞分散和保悬浮培养物快速生长、有利于细胞分散和保持分化再生能力的培养基。持分化再生能力的培养基。v（1 1）、悬浮培养中的植物细胞特性）、悬浮培养中的植物细胞特性v与微生物细胞相比，植物细胞大的多，平与微生物细胞相比，植物细胞大的多，平均直径比微生物细胞大均直径比微生物细胞大3030100100倍。植物细胞倍。植物细胞很少以单一细胞形式悬浮生长，而通常以细很少以单一细胞形式悬浮生长，而通常以细胞数在胞数在2 2200200之间、直径之间、直径2mm2mm左右的非均相集左右的非均相集合细胞团的方式存在。合细胞团的方式存在。v植物细胞

51、的纤维素细胞壁使得其外骨架相植物细胞的纤维素细胞壁使得其外骨架相当脆弱，这样植物细胞虽有很强的抗性强度，当脆弱，这样植物细胞虽有很强的抗性强度，但抗剪切能力相当弱，使得传统搅拌微生物但抗剪切能力相当弱，使得传统搅拌微生物反应器中高剪切力很容易损坏植物细胞的细反应器中高剪切力很容易损坏植物细胞的细胞壁。胞壁。v由于植物细胞生长速度慢，操作周期就很由于植物细胞生长速度慢，操作周期就很长，即使间歇操作也要长，即使间歇操作也要2 23 3周，半连续或连周，半连续或连续操作更是可长达续操作更是可长达2 23 3个月，因此，在植物个月，因此，在植物细胞培养过程中，保持无菌有一定难度，但细胞培养过程中，保持

52、无菌有一定难度，但是相当重要。是相当重要。v（2）植物细胞培养液的流变特性）植物细胞培养液的流变特性v由于植物细胞常趋于成团，且不少细胞在培由于植物细胞常趋于成团，且不少细胞在培养过程中容易产生粘多糖等物质，使传氧速养过程中容易产生粘多糖等物质，使传氧速率等降低，影响了细胞的生长。人们常用黏率等降低，影响了细胞的生长。人们常用黏度来描述培养液的流变特征。度来描述培养液的流变特征。v（3）植物细胞培养过程中的氧传递）植物细胞培养过程中的氧传递v所有的植物细胞都是好气性的，需要连续供所有的植物细胞都是好气性的，需要连续供氧。由于植物细胞培养时对溶氧的变化非常氧。由于植物细胞培养时对溶氧的变化非常敏

53、感，太高太低都会对培养过程产生不良的敏感，太高太低都会对培养过程产生不良的影响，因此，大规模植物细胞培养对供氧和影响，因此，大规模植物细胞培养对供氧和尾气氧的监控十分重要。与微生物培养过程尾气氧的监控十分重要。与微生物培养过程相反，植物细胞培养过程并不需要高的气液相反，植物细胞培养过程并不需要高的气液传质速率，而是要控制供氧量，以保持较低传质速率，而是要控制供氧量，以保持较低的溶氧水平。的溶氧水平。2 2、植物细胞或原生质体的固定化培养、植物细胞或原生质体的固定化培养v（1 1）植物细胞固定化）植物细胞固定化v海藻酸盐固定化海藻酸盐固定化v卡拉胶固定化卡拉胶固定化v琼脂糖固定化琼脂糖固定化v琼脂固定化琼脂固定化v（2 2）原生质体固定化）原生质体固定化3 3、植物细胞培养方式、植物细胞培养方式v间歇培养：间歇培养：v流加间歇培养流加间歇培养v两级或多级间歇培养两级或多级间歇培养v连续培养：连续培养：v