上海交通大学微生物实验课件实验七污水中噬菌体的分离与效价测定

1、实验七实验七 污水中噬菌体的分离与效价测定污水中噬菌体的分离与效价测定 实验目的掌握噬菌体分离的基本原理和方法学会观察噬菌斑了解噬菌斑的效价测定方法 大肠菌群的鉴定（EMB培养基上的典型菌落的革兰氏染色）噬菌体是专性寄生物，必需寄生细菌才能繁殖，伴随细菌的分布而分布，只要有细菌的地方，就有噬菌体噬菌体颗粒可以在环境中独立存活，但不能繁殖噬菌体对宿主的寄生通常具有特异性温和噬菌体和烈性噬菌体烈性噬菌体在液体中，可以使浑浊的菌液变为澄清烈性噬菌体在固体琼脂平板，可以形成透明的噬菌斑利用噬菌体斑的特征可以分离、纯化、效价滴定基本原理基本原理噬菌斑的形成噬菌斑的形成 在固体琼脂培养基上，噬菌体感染细菌

2、后，在宿主细胞内进行核酸和蛋白质的生物合成，最后装配成噬菌体完整的颗粒，通过裂解宿主细胞释放出来，使感染的细菌不能生长，从而形成肉眼可以观察到的透明或浑浊的空斑，称为噬菌斑。如何进行噬菌体的纯化如何进行噬菌体的纯化挑取单一清晰可见的单个噬菌斑，接种液体培养基，并加入相同指示菌，铺平板,得噬菌斑重复多次，可以得到由一个噬菌体的后代形成的噬菌斑，即获得了纯化的噬菌斑。观测噬菌斑的特征如何测定噬菌体的效价如何测定噬菌体的效价效价指1ml培养液中所含有活的噬菌体的数量采用双层琼脂平板法，进行噬菌斑的计数，计量单位为pfu，即plaque forming unit(噬菌斑形成单位）。获得的噬菌体滤液作1

3、0倍的倍比递减稀释取每个稀释度噬菌体0.1ml加入0.9ml的指示菌，混匀后，加入到上层琼脂，倾注平皿，选择30300个pfu的平皿计算每毫升未稀释的噬菌体原液的效价。噬菌体的分离操作程序噬菌体的分离操作程序于100ml 3倍浓缩肉汤加入污水样本污水样本200ml和大肠杆菌指示菌2ml 37C培养8小时取上述混悬液5ml接种到20ml的新鲜的LB液体培养基，并加入125ul丝裂霉素，37 C培养18小时。无菌取上述培养液1ml于1.5ml Eppendrof管中，加入200ul氯仿后振荡15min，4 C 4000g离心20min，0.22um滤膜过滤。滤液收集在一个无菌的滤液收集在一个无菌的

4、1.5ml Eppendrof管中，获得获得噬菌体的滤液噬菌体的滤液培养指示菌大肠杆菌MC1061 18小时（已经培养）LB 培养基(在试管中)操作程序操作程序每组取4个个1.5ml 的Eppendrof离心管，分别标注 100、10-1、 10-2 、 10-3 。4个个Eppendrof离心管分别各加900ul LB，从噬菌体裂解液中取100ul 于100离心管中，混匀后，取100ul 于10-1离心管中，依次类推10倍倍比递减稀释至10-3 。（一个移液枪头用到底）另取4支支无菌的Eppendrof离心管，分别标记10-3 、 10-2、10-1、 100 （注意次序）（注意次序），从上

5、述相对应的各稀释管中分别取300ul 噬菌体液，然后各管加200ul 指示菌MC1061，CaCl2 50ul混匀后，37 C温箱孵育20min。（每组可以使用3个个移液枪头，注意次序，不能混淆 ）操作程序操作程序取上层琼脂，融化并孵育在取上层琼脂，融化并孵育在48C（已经融化），（已经融化），每人每人1支，加入上述支，加入上述10-3 、 10-2、10-1、 100其中一其中一个稀释度的噬菌体与细菌的混悬液，轻轻混匀。个稀释度的噬菌体与细菌的混悬液，轻轻混匀。（特别注意琼脂不能离开水浴时间太长，否则琼脂（特别注意琼脂不能离开水浴时间太长，否则琼脂会凝固，但琼脂不能太烫，不能剧烈振荡）会凝固

6、，但琼脂不能太烫，不能剧烈振荡）立即倒入底层琼脂平板，室温立即倒入底层琼脂平板，室温510分钟，待上层分钟，待上层凝固后，将平板倒置，作好标记。凝固后，将平板倒置，作好标记。37 C 18小时观察结果小时观察结果,结果观察时间为明天结果观察时间为明天11:30-12:30记录噬菌斑的数量记录噬菌斑的数量与先前的噬菌体裂解液的稀释度相对应，计算噬菌与先前的噬菌体裂解液的稀释度相对应，计算噬菌体的含量体的含量每个初次分离的噬菌斑可能含有多种噬菌体，要获每个初次分离的噬菌斑可能含有多种噬菌体，要获得单一的噬菌体，必需进行噬菌体的纯化得单一的噬菌体，必需进行噬菌体的纯化污水中大肠菌群的测定污水中大肠菌

7、群的测定接种乳糖胆盐发酵管接种乳糖胆盐发酵管产酸产气的试管接种产酸产气的试管接种EMB培养基培养基典型菌落的革兰氏染色典型菌落的革兰氏染色 描述菌落和细菌的特征描述菌落和细菌的特征革兰氏染色步骤革兰氏染色步骤涂片：载玻片中心加水一滴，无菌操作挑菌，涂片：载玻片中心加水一滴，无菌操作挑菌，混于水中，从中心涂开混于水中，从中心涂开自然干燥自然干燥火焰固定：玻片在酒精灯上加热火焰固定：玻片在酒精灯上加热初染剂结晶紫染色：结晶紫液初染剂结晶紫染色：结晶紫液1分钟水洗分钟水洗碘液媒染：加碘液碘液媒染：加碘液1分钟水洗分钟水洗革兰氏染色步骤革兰氏染色步骤乙醇脱色：滴洗至玻片下端刚不显紫色止水洗乙醇脱色：滴洗至玻片下端刚不显紫色止水洗（关键）（关键）复染剂复染剂(如番红如番红)复染：番红染液复染：番红染液1分钟水洗吸分钟水洗吸干显微镜观察。干显微镜观察。经此方法染色后，细胞保留初染剂蓝紫色的细菌经此方法染色后，细胞保留初染剂蓝紫色的细菌为革兰氏阳性菌；如果细胞中初染剂被脱色剂洗为革兰氏阳性菌；如果细胞中初染剂被脱色剂洗脱而使细菌染上复染剂的颜色脱而使细菌染上复染剂的颜色(红色红色)，该菌属于革，该菌属于革兰