牛病毒性腹泻与粘膜病

1、 牛病毒性腹泻，又称牛病毒性腹泻牛病毒性腹泻，又称牛病毒性腹泻/ /粘膜病，是由粘膜病，是由BVDVBVDV引起的，主要侵害牛、羊、鹿、牦牛等反刍动物及引起的，主要侵害牛、羊、鹿、牦牛等反刍动物及猪的一种重要传染病。临床主要表现为发热、粘膜糜烂猪的一种重要传染病。临床主要表现为发热、粘膜糜烂、溃疡、白细胞减少、持续感染、咳嗽及怀孕母牛流产、溃疡、白细胞减少、持续感染、咳嗽及怀孕母牛流产或产生畸形胎儿或产生畸形胎儿。同一种病原引起的多种病状的传染病同一种病原引起的多种病状的传染病 我国我国19801980年年李佑民首李佑民首从从国外国外进口奶牛分离出进口奶牛分离出BVBVDVDV；上世纪上世纪9

2、090年代郑志刚等在全国范围内调查，年代郑志刚等在全国范围内调查，BVDVBVDV平均阳平均阳性率为性率为19.56%19.56%，近年来本病在国内阳性检出率呈逐年上，近年来本病在国内阳性检出率呈逐年上涨的趋势。涨的趋势。本病给养牛业造成明显损失（产乳本病给养牛业造成明显损失（产乳、重、重、流产等）。流产等）。牛病毒性腹泻牛病毒性腹泻1BVDVBVDV的流行病学的流行病学 2BVDVBVDV的病原学的病原学 3BVDVBVDV的基因结构及其蛋白的基因结构及其蛋白4BVDVBVDV的研究进展的研究进展 内容摘要内容摘要56BVDVBVDV的防治的防治 BVDVBVDV的主要诊断方法的主要诊断方法

3、 BVDVBVDV的流行病学的流行病学传传 染染 源：病牛和带毒牛是主要传染源。源：病牛和带毒牛是主要传染源。传播途径：主要通过传播途径：主要通过消化道消化道和和呼吸道呼吸道传播传播；直接或；直接或间接间接接触接触也可以传播；也可以传播；吸血昆虫吸血昆虫也是重要的传播也是重要的传播媒介。媒介。易感动物：主要感染牛（肉牛、奶牛），也可感染易感动物：主要感染牛（肉牛、奶牛），也可感染猪。猪。 本病多发于寒冷季节，过分拥挤可促进本病本病多发于寒冷季节，过分拥挤可促进本病发生。发生。BVDVBVDV的病原学的病原学 属属黄黄病毒科、病毒科、瘟病毒属瘟病毒属 有囊膜，直径有囊膜，直径2525- -303

4、0nmnm，正链正链RNARNA 胎牛肾、睾丸、猪肾、胎羊睾丸可增殖胎牛肾、睾丸、猪肾、胎羊睾丸可增殖传代传代 BVDV BVDV。BVDV BVDV 可以分成致细胞病变可以分成致细胞病变型（型（CPCP）和非致细胞病变型（）和非致细胞病变型（NCPNCP）。）。BVDVBVDV的基因结构及其蛋白的基因结构及其蛋白 5-Npro 5-Npro（P20P20）-C(P14)-Erns(gp48)-E1 (gp25)-C(P14)-Erns(gp48)-E1 (gp25)-E2(gp53)-P7- NS2-3 (P125)-NS4A (P10)- NS4B E2(gp53)-P7- NS2-3 (

5、P125)-NS4A (P10)- NS4B (P30)- NS5A (P58)- NS5B (P75)-3(P30)- NS5A (P58)- NS5B (P75)-3, ,其中其中C C，E ERNSRNS，E1E1，E2E2是病毒的结构蛋白。其余为非结构蛋白是病毒的结构蛋白。其余为非结构蛋白。BVDVBVDV的主要基因、蛋白研究进展的主要基因、蛋白研究进展BVDV核衣壳组成成核衣壳组成成分，具有免疫分，具有免疫原性原性 BVDV BVDV 基因组基因组具有较高的保具有较高的保守性守性瘟病毒属内高度瘟病毒属内高度保守，在病毒复保守，在病毒复制、病毒制、病毒RNARNA转转译或者病毒多聚译或

6、者病毒多聚蛋白加工过程中蛋白加工过程中具有重要作用具有重要作用5-UTR5-UTRC CNS3NS3E ERNSRNS内有一高度保内有一高度保守结构域守结构域，可，可用于研究亚单用于研究亚单位疫苗，也可位疫苗，也可作为基因工程作为基因工程诊断抗原诊断抗原E2与抗与抗BVDV抗体结合、抗体结合、介导免疫中和反应及介导免疫中和反应及与宿主细胞识别、吸与宿主细胞识别、吸附的主要部位附的主要部位Npro具有自体蛋白酶活性具有自体蛋白酶活性，有较高的保守，可以对有较高的保守，可以对瘟病毒进行种、群或型瘟病毒进行种、群或型的鉴定的鉴定v5-UTR5-UTR：55末端无甲基化的末端无甲基化的“帽子帽子”结构

7、，结构，5-5-UTRUTR序列在序列在BVDVBVDV的各毒株间有较高的保守性，因的各毒株间有较高的保守性，因此常根据此常根据5-UTR5-UTR的序列设计引物来检测的序列设计引物来检测 BVDVBVDV或或对对 BVDV BVDV 进行分型进行分型。5-UTR 5-UTR 在病毒转录、翻译在病毒转录、翻译过程中起重要的作用。过程中起重要的作用。v20102010年张兴娟等分别用年张兴娟等分别用5-UTR5-UTR设计一对引物，设计一对引物，预扩增片段预扩增片段125bp125bp；20102010年孟雨等人也利用年孟雨等人也利用5-5-UTRUTR设计一对引物，预扩增片段设计一对引物，预扩

8、增片段218bp218bp，实验证明，实验证明利用利用5-UTR5-UTR设计引物具有很好的特异性和敏感性。设计引物具有很好的特异性和敏感性。vE2E2：是是BVDVBVDV的主要保护性抗原，能诱导机体产生中的主要保护性抗原，能诱导机体产生中和抗体，所以新型疫苗都是针对和抗体，所以新型疫苗都是针对E2E2结构蛋白的。结构蛋白的。也是也是与抗与抗 BVDV BVDV 抗体结合、介导免疫中和反应及与宿主细抗体结合、介导免疫中和反应及与宿主细胞识别、吸附的主要部位胞识别、吸附的主要部位，E2 E2 基因一直是国内外学者基因一直是国内外学者研究瘟病毒的重点研究瘟病毒的重点。vE2 E2 是形成是形成

9、BVD BVD 基因工程疫苗的最好的选择基因工程疫苗的最好的选择。vBVDV E2 DNA BVDV E2 DNA 疫苗是近年来疫苗是近年来 BVDV BVDV 免疫研究的热点。免疫研究的热点。如如20072007吴明福吴明福等构建真核表达质粒等构建真核表达质粒 pcDNA3.1(+)-E2 pcDNA3.1(+)-E2 并免疫小鼠，可诱导小鼠产生一定程度的体液和细胞并免疫小鼠，可诱导小鼠产生一定程度的体液和细胞免疫应答。免疫应答。vNS-3NS-3：NS3NS3区域与病毒的毒力，生长特性有区域与病毒的毒力，生长特性有关。关。NS3NS3在瘟病毒属内高度保守，在病毒复制、在瘟病毒属内高度保守，

10、在病毒复制、病毒病毒RNARNA转译或者病毒多聚蛋白加工过程中具转译或者病毒多聚蛋白加工过程中具有重要作用。有重要作用。NS3NS3的表达与宿主细胞的表达与宿主细胞CPECPE的产生的产生有密切关系有密切关系。v20092009年魏伟等用年魏伟等用BVDV NS3 BVDV NS3 蛋白中有免疫反蛋白中有免疫反应性的重组片段作为包被抗原，建立了一个应性的重组片段作为包被抗原，建立了一个 BVDV BVDV 抗体检测的间接抗体检测的间接 ELISA ELISA 方法。方法。血清学诊断血清学诊断免疫学诊断免疫学诊断诊断方法的进展诊断方法的进展分子生物学诊断分子生物学诊断1 12 23 3血清学诊断

11、血清学诊断 常见的方法为主要包括血清中和试验常见的方法为主要包括血清中和试验和琼脂扩散试验两种。和琼脂扩散试验两种。 琼脂扩散试验准确性较低，检出的结果琼脂扩散试验准确性较低，检出的结果常常有假阳性。常常有假阳性。 血清中和试验重复性高，准确性好，已作血清中和试验重复性高，准确性好，已作为为 BVDV BVDV 诊断的诊断的“金标准金标准”，但血清中和试，但血清中和试验在基层使用时，常遇到费时、费力，需要验在基层使用时，常遇到费时、费力，需要细胞培养等试验室技术问题，无法得到推广细胞培养等试验室技术问题，无法得到推广。免疫学诊断免疫学诊断酶联免疫吸酶联免疫吸附试验附试验（ELISAELISA）

12、免疫荧光技免疫荧光技术（术（IFAIFA）免疫过氧化免疫过氧化物酶技术物酶技术（IPIP）免疫荧光技术（免疫荧光技术（IFAIFA） 免疫荧光技术（免疫荧光技术（IFAIFA）又称荧光抗体技）又称荧光抗体技术，可用于检测细胞培养物以及病变组织术，可用于检测细胞培养物以及病变组织的冰冻切片中的冰冻切片中 BVDV BVDV 感染情况。感染情况。 免疫荧光抗体技术特异、敏感、快速，免疫荧光抗体技术特异、敏感、快速，但它需要荧光显微镜，使得此技术无法得但它需要荧光显微镜，使得此技术无法得到推广应用。到推广应用。ELISA ELISA ELISA 常被用于检测组织器官培养物中常被用于检测组织器官培养物

13、中 BVDVBVDV，监测牛群中，监测牛群中 BVD BVD 抗体水平，评估潜伏抗体水平，评估潜伏感染情况。其中最常用的是双抗夹心感染情况。其中最常用的是双抗夹心 ELISA ELISA 和间接和间接 ELISA ELISA，也有使用，也有使用 BVDV BVDV 单克隆抗体与单克隆抗体与 ELISA ELISA 联合诊断联合诊断 BVD BVD。 研究较多的研究较多的IBRVIBRV诊断蛋白有诊断蛋白有NS3NS3，E2E2蛋白蛋白酶联免疫吸附试验（酶联免疫吸附试验（ELISAELISA） 免疫过氧化物酶技术免疫过氧化物酶技术（IPIP）诊断）诊断 BVDV BVDV 准确、准确、可靠，可用

14、于了解可靠，可用于了解 BVD BVD 的总体分布情况。链酶亲的总体分布情况。链酶亲和素和素- -生物素过氧化物酶生物素过氧化物酶检测方法，可以用来检测检测方法，可以用来检测福尔马林固定、石蜡包埋福尔马林固定、石蜡包埋组织切片中的组织切片中的BVDVBVDV。 近年来，为了避近年来，为了避免非特异性染色反免非特异性染色反应，则可以使用单应，则可以使用单克隆抗体克隆抗体+ +生物素化生物素化抗鼠抗体抗鼠抗体- -链酶亲和链酶亲和素过氧化物酶检测素过氧化物酶检测方法方法。免疫过氧化物酶技术（免疫过氧化物酶技术（IPIP）分子生物学诊断分子生物学诊断RT-PCR核酸探针检测核酸探针检测1 12 2R

15、T-PCR RTPCR RTPCR 是目前广泛应用的分是目前广泛应用的分子生物学技术，对于检测子生物学技术，对于检测 BVDV BVDV 的的 RNA RNA 是一个合适的方法。根据是一个合适的方法。根据 BVDV BVDV 基因组序列合成一对或几对特异性基因组序列合成一对或几对特异性引物，可以高度特异、敏感的检测引物，可以高度特异、敏感的检测出器官、组织、细胞培养物中的出器官、组织、细胞培养物中的 BVDVBVDV，并可区别，并可区别 CSFV CSFV、BDVBDV，还可，还可对对 BVDV BVDV 的基因型和生物型作进一的基因型和生物型作进一步的鉴定步的鉴定 PCRPCR引物多数选在引

16、物多数选在BVDVBVDV保守区保守区5-UTR5-UTR和和NS3NS3基因内，尤其基因内，尤其5UTR5UTR是是BVDVBVDV进行鉴定进行鉴定、基因分型的首选区域。、基因分型的首选区域。 20072007年年王伟利建立了王伟利建立了 BVDV BVDV 荧光荧光 RT- RT-PCR PCR 检测方法并进行了初步应用，检测方法并进行了初步应用，20072007年年国家质量监督检验检疫局制定了牛病毒性国家质量监督检验检疫局制定了牛病毒性腹泻腹泻/ /黏膜病反转录聚合酶链反应操作规程黏膜病反转录聚合酶链反应操作规程核酸探针检测（核酸探针检测（NAH） 与传统方法相比，该技术敏感，特异性强，

17、而与传统方法相比，该技术敏感，特异性强，而且应用很广泛，且应用很广泛，NAH NAH 可直接检测脏器组织和血细胞可直接检测脏器组织和血细胞中的中的 BVDV BVDV。NAH NAH 技术应用最广泛的是核酸标记法技术应用最广泛的是核酸标记法，按核酸探针标记物不同可分为两类：一类是放射，按核酸探针标记物不同可分为两类：一类是放射性同位素（如性同位素（如 32P 32P，35S35S）标记的）标记的 DNA DNA 探针，另一探针，另一类是用如地高辛、生物素标记的类是用如地高辛、生物素标记的 DNA DNA 探针。核酸探针。核酸探针技术标记简单，特异性好，可长期保存，并且探针技术标记简单，特异性好，可长期保存，并且可以回收利用，制成试剂盒，是一种安全、快速、可以回收利用，制成试剂盒，是