dnaran琼脂糖凝胶电泳ppt课件

1、 核酸的提取及琼脂糖凝胶电泳 目录目录l核酸核酸l 组成组成l 理化性质理化性质l核酸分别、纯化的原那么核酸分别、纯化的原那么l核酸提取的根本步骤核酸提取的根本步骤l 资料预备资料预备l 细胞裂解细胞裂解l 分别、纯化分别、纯化l 沉淀溶解沉淀溶解lDNADNA提取的常用方法提取的常用方法lRNARNA提取的常用方法提取的常用方法l核酸的保管核酸的保管l琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳核酸核酸DNARNAGenomic DNA ( 原核、真核、病毒原核、真核、病毒 )细胞器细胞器DNA ( 叶绿体、线粒体等叶绿体、线粒体等)质粒质粒DNA ( 细菌、放线菌等细菌、放线菌等 )mRNA ( 1%-5

2、% )mRNA ( 1%-5% )rRNA (80%-85%)rRNA (80%-85%)tRNA(tRNA(小分子小分子RNA) (15%-20%)RNA) (15%-20%)l核 酸(nucleic acid)核酸的提取是分子生物学实验技术中最核酸的提取是分子生物学实验技术中最重要、最根本的操作重要、最根本的操作 。核酸的理化性质核酸的理化性质l理化性质理化性质l DNA DNA化学性质稳定，物理上易碎，粘度大化学性质稳定，物理上易碎，粘度大l RNA RNA化学性质比化学性质比DNADNA活泼，易受活泼，易受RNARNA酶的污染酶的污染l溶解性溶解性l 均溶于水均溶于水l 不溶于普通有机

3、溶剂不溶于普通有机溶剂, ,在在70%70%乙醇中构成乙醇中构成沉淀沉淀 l 核酸分别、纯化原那么核酸分别、纯化原那么 1、坚持核酸分子一级构造的完好性、坚持核酸分子一级构造的完好性 温度不要太高温度不要太高 控制控制pH值范围值范围(pH值值5-9) 坚持一定离子强度坚持一定离子强度 减少物理要素对核酸的机械剪切力减少物理要素对核酸的机械剪切力核酸分别、纯化原那么核酸分别、纯化原那么l核酸酶能消化核酸链中的磷酸二酯键，破坏核核酸酶能消化核酸链中的磷酸二酯键，破坏核酸一级构造。酸一级构造。l所用器械和一些试剂需高温灭菌所用器械和一些试剂需高温灭菌l提取缓冲液中需加核酸酶抑制剂提取缓冲液中需加核

4、酸酶抑制剂l金属离子螯合剂：金属离子螯合剂：l DNA酶需求金属二价离子酶需求金属二价离子Mg2+、Ca2+的激活，的激活，常用常用EDTA(乙二胺四乙酸乙二胺四乙酸)离子螯合剂，可抑制离子螯合剂，可抑制DNA酶活性。酶活性。l阴离于型外表活性剂阴离于型外表活性剂l SDS除对核酸酶有抑制造用外，还能使蛋白量除对核酸酶有抑制造用外，还能使蛋白量变性，并与变性蛋白结合成带负电荷的复合物，变性，并与变性蛋白结合成带负电荷的复合物，该复合物有核酸酶抑制剂作用。该复合物有核酸酶抑制剂作用。lDEPC(二乙基焦碳酸盐二乙基焦碳酸盐) 粘性液体，很强的核粘性液体，很强的核酸酶抑制剂。与蛋白质中酸酶抑制剂。

5、与蛋白质中His 结结 合使蛋白变合使蛋白变性。性。l 运用留意：运用留意：l 1.DEPC也能破坏单链核酸中大部分腺嘌呤也能破坏单链核酸中大部分腺嘌呤环。环。l 2.容易降解，保管在容易降解，保管在4 或液氮中；或液氮中；l 3.剧毒。剧毒。 1：手指头 2：枪头 3：水/缓冲液 4：实验台面 5：内源 Rnase 6：RNA 样品 7：质粒抽提 8：RNA 保管 9：阳离子 (Ca, Mg) 10：后续实验所用的酶 Rnase 污染的10大来源DNADNA提取的根本步骤提取的根本步骤I.I.资料预备资料预备II.II.裂解裂解III.III.分别、纯化分别、纯化IV.IV.沉淀或吸附核酸沉

6、淀或吸附核酸V.V.溶解溶解资料预备运用新颖资料，样品资料不要反复冻融运用新颖资料，样品资料不要反复冻融提取血液基因组提取血液基因组DNADNA时，要选择有核细胞白细胞时，要选择有核细胞白细胞含病毒的液体资料含病毒的液体资料DNADNA含量较少，提取前先富集含量较少，提取前先富集基因组基因组DNADNA的提取的提取细胞裂解细胞裂解 裂解液裂解液经典的裂解液几乎都含有去污剂和盐，可以抑制经典的裂解液几乎都含有去污剂和盐，可以抑制样品中的核酸酶样品中的核酸酶含蛋白酶的裂解方法：基因组含蛋白酶的裂解方法：基因组DNADNA高浓度蛋白变性剂的裂解方法：高浓度蛋白变性剂的裂解方法：RNARNA含含CTA

7、BCTAB的裂解法：富含多糖的样品的基因组的裂解法：富含多糖的样品的基因组 DNA DNA含含SDSSDS碱裂解法：质粒碱裂解法：质粒DNADNA核酸分别、纯化核酸分别、纯化蛋白质的去除：蛋白质的去除：酚酚/氯仿抽提氯仿抽提运用变性剂变性运用变性剂变性SDS、异硫氰酸胍等、异硫氰酸胍等高盐洗涤高盐洗涤 核酸核酸-蛋白质参与蛋白质参与NaCl后，破坏静电吸力，后，破坏静电吸力，使氢键破坏，核蛋白解聚；使氢键破坏，核蛋白解聚；蛋白酶处置蛋白酶处置核酸分别、纯化核酸分别、纯化 多糖的去除：多糖的去除：高盐法：用乙醇沉淀时，在待沉淀溶液中参与高盐法：用乙醇沉淀时，在待沉淀溶液中参与1/2体积的体积的5

8、M NaCl，高盐可溶解多糖。，高盐可溶解多糖。用多糖水解酶将多糖降解。用多糖水解酶将多糖降解。在提取缓冲液中加一定量的氯苯，氯苯可以与多在提取缓冲液中加一定量的氯苯，氯苯可以与多糖的羟基作用，从而去除多糖糖的羟基作用，从而去除多糖 。核酸沉淀、溶解核酸沉淀、溶解重新调整核酸的浓度；重新调整核酸的浓度；去除溶液中某些盐离子与杂质。去除溶液中某些盐离子与杂质。乙醇乙醇 优点：优点： 对盐类沉淀少，沉淀中所含乙醇易挥发除去，不影响以后对盐类沉淀少，沉淀中所含乙醇易挥发除去，不影响以后实验。实验。 缺陷：缺陷： 需求量大，普通要求低温操作。需求量大，普通要求低温操作。异丙醇异丙醇 优点：优点： 需体

9、积小，速度快，适于浓度低、体积大的需体积小，速度快，适于浓度低、体积大的DNADNA样品沉淀。样品沉淀。普通不需低温。普通不需低温。 缺陷：缺陷： 易使盐类、蔗糖与易使盐类、蔗糖与DNADNA共沉淀异丙醇难以挥发除去。所以，共沉淀异丙醇难以挥发除去。所以，最后用最后用7070乙醇漂洗。乙醇漂洗。有机沉淀剂有机沉淀剂核酸的保管(1) (1) 对对DNADNA DNA DNA样品溶于样品溶于pH8.0pH8.0的的TETE，4 4 或或-20 -20 保保管；管； 长期保管样品中可参与长期保管样品中可参与1 1滴氯仿。滴氯仿。(2) (2) 对对RNA RNA RNA RNA样品溶于样品溶于0.3

10、 mol/L NaAc (pH5.2)0.3 mol/L NaAc (pH5.2)或或双蒸灭菌水中，双蒸灭菌水中，-70 -70 保管保管; ; 长期保管可以沉淀方式贮于乙醇中长期保管可以沉淀方式贮于乙醇中; ; DNADNA提取的常用方法提取的常用方法q基因组基因组DNADNA的提取的提取 SDS法其它q原理原理SDSSDS在高温在高温55556565条件下能裂解条件下能裂解细胞，使染色体离析，蛋白变性，释放细胞，使染色体离析，蛋白变性，释放出核酸；出核酸；上清液中的上清液中的DNADNA用酚用酚/ /氯仿抽提，反复抽氯仿抽提，反复抽提后用乙醇沉淀水相中的提后用乙醇沉淀水相中的DNADNA。

11、 组份组份 Tris-HCl （pH8.0）EDTA （pH8.0）NaCl SDS 终浓度终浓度 100mM 20 mM1.4M2%(W/V)SDSSDS提取缓冲液的配方提取缓冲液的配方Tris-HCl pH8.0提供一个缓冲环境，防提供一个缓冲环境，防止核酸被破坏；止核酸被破坏；EDTA螯合螯合Mg2+或或Mn2+离子，抑制离子，抑制DNase活性；活性；NaCl 提供一个高盐环境，使提供一个高盐环境，使DNA充分溶解，充分溶解，存在于液相中；存在于液相中；SDS 裂解细胞，使蛋白变性，染色体离析；裂解细胞，使蛋白变性，染色体离析；吸附资料结合法：吸附资料结合法：q根据核酸分别纯化方式的不

12、同有：根据核酸分别纯化方式的不同有：高盐低高盐低pHpH值结合核酸，低盐高值结合核酸，低盐高pHpH值洗脱。值洗脱。快捷高效。快捷高效。低盐高低盐高pHpH值结合核酸，高盐低值结合核酸，高盐低pHpH值洗脱。值洗脱。适用于纯度要求高的实验。适用于纯度要求高的实验。磁性微粒挂上不同基团可吸附不同的目的磁性微粒挂上不同基团可吸附不同的目的物，从而到达分别目的。物，从而到达分别目的。其他方法其他方法l硅质资料硅质资料阴离子交换树脂阴离子交换树脂l磁珠磁珠低盐高低盐高pHpH值结合核酸，高盐低值结合核酸，高盐低pHpH值洗脱。值洗脱。适用于纯度要求高的实验。适用于纯度要求高的实验。阴离子交换树脂阴离子

13、交换树脂l磁珠磁珠低盐高低盐高pHpH值结合核酸，高盐低值结合核酸，高盐低pHpH值洗脱。值洗脱。适用于纯度要求高的实验。适用于纯度要求高的实验。阴离子交换树脂阴离子交换树脂磁性微粒挂上不同基团可吸附不同的目的磁性微粒挂上不同基团可吸附不同的目的物，从而到达分别目的。物，从而到达分别目的。l磁珠磁珠低盐高低盐高pHpH值结合核酸，高盐低值结合核酸，高盐低pHpH值洗脱。值洗脱。适用于纯度要求高的实验。适用于纯度要求高的实验。阴离子交换树脂阴离子交换树脂l磁珠磁珠l硅质资料硅质资料高盐低高盐低pHpH值结合核酸，低盐高值结合核酸，低盐高pHpH值洗脱。值洗脱。快捷高效。快捷高效。l硅质资料硅质资

14、料低盐高低盐高pHpH值结合核酸，高盐低值结合核酸，高盐低pHpH值洗脱。值洗脱。适用于纯度要求高的实验。适用于纯度要求高的实验。阴离子交换树脂阴离子交换树脂高盐低高盐低pHpH值结合核酸，低盐高值结合核酸，低盐高pHpH值洗脱。值洗脱。快捷高效。快捷高效。l硅质资料硅质资料阴离子交换树脂阴离子交换树脂低盐高低盐高pHpH值结合核酸，高盐低值结合核酸，高盐低pHpH值洗脱。值洗脱。适用于纯度要求高的实验。适用于纯度要求高的实验。阴离子交换树脂阴离子交换树脂阴离子交换树脂阴离子交换树脂低盐高低盐高pHpH值结合核酸，高盐低值结合核酸，高盐低pHpH值洗脱。值洗脱。适用于纯度要求高的实验。适用于纯

15、度要求高的实验。阴离子交换树脂阴离子交换树脂l磁珠磁珠磁性微粒挂上不同基团可吸附不同的目的磁性微粒挂上不同基团可吸附不同的目的物，从而到达分别目的。物，从而到达分别目的。l磁珠磁珠lTrizol是直接从细胞或组织中提取总RNA 的试剂，内含异硫氰酸胍，酚等物质，异硫氰酸胍能迅速溶解蛋白质，导致细胞构造破碎。l核酸由于核蛋白二级构造的破坏而解离下来。l异硫氰酸胍同时抑制细胞释放出的核酸酶，坚持RNA 的完好性。TRIZOL法提法提RNA 目前有不少商业化的核酸抽提目前有不少商业化的核酸抽提试剂盒可供选用，详细操作步骤参试剂盒可供选用，详细操作步骤参考各种产品阐明书。考各种产品阐明书。问题一：DN

16、A降解核酸提取常见的问题核酸提取常见的问题问题二： DNA样品不纯 RNARNA提取常见问题一：样品不纯提取常见问题一：样品不纯 RNARNA提取常见问题二：得率低提取常见问题二：得率低 RNARNA提取常见问题三：降解提取常见问题三：降解 为了检测提取核酸的浓度和内参，需求继续为了检测提取核酸的浓度和内参，需求继续做琼脂糖凝胶电泳实验做琼脂糖凝胶电泳实验实验原理1DNA分子在碱性缓冲液中带负电荷，在外分子在碱性缓冲液中带负电荷，在外加电场作用下向正极泳动。分子质量越小跑得越加电场作用下向正极泳动。分子质量越小跑得越快，严密构型快于松散型开环分子或线性分子，快，严密构型快于松散型开环分子或线性

17、分子，从而可以分别大小不同的从而可以分别大小不同的DNA或或RNA分子。分子。 2 2琼脂糖是一种线性多糖聚合物，可以构成具有琼脂糖是一种线性多糖聚合物，可以构成具有刚性的滤孔，凝胶孔径的大小决议于琼脂糖的浓度。刚性的滤孔，凝胶孔径的大小决议于琼脂糖的浓度。浓度越高，孔隙越小，其分辨才干就越强。浓度越高，孔隙越小，其分辨才干就越强。琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶缓冲液琼脂糖凝胶缓冲液1制备凝胶和胶板：制备凝胶和胶板： 100ml(1TBE)+1g琼脂糖琼脂糖 三角三角瓶瓶 ， 煮胶，溶解，冷却至煮胶，溶解，冷却至60(不烫手不烫手)，加，加EB替代物，倒板替代物，倒板(4-6mm)，室

18、温下充分凝固，竖直，室温下充分凝固，竖直拔下梳子拔下梳子 。2 加样：加样： 5l质粒质粒DNA+1l loading buffer ，混匀，混匀 5lPCR产物产物+1l loading buffer，混匀，混匀3 电泳：电压电泳：电压80-120V，留意电极，留意电极 方向方向 15min4 察看：紫外透射分析仪下察看。察看：紫外透射分析仪下察看。电泳常见问题分析lDNA降解：防止核酸酶污染。降解：防止核酸酶污染。 l电泳缓冲液陈旧：电泳缓冲液多次用后，离子强度降电泳缓冲液陈旧：电泳缓冲液多次用后，离子强度降低，低，pH值上升，缓冲才干减弱，从而影响电泳效果。值上升，缓冲才干减弱，从而影响电泳效果。建议经常改换电泳缓冲液。建议经常改换电泳缓冲液。l DNA变性：电泳前勿加热，可以在电泳仪上面放冰变性：电泳前勿加热，可以