第四章基因工程的载体-质粒二

1、一、一、噬菌体的分子生物学噬菌体的分子生物学第三节第三节噬菌体载体噬菌体载体噬菌体的生活史噬菌体的生活史噬菌体基因大致分为噬菌体基因大致分为4 4个区：个区： 结构区结构区A A J19J19个基因，编码头、个基因，编码头、 尾部蛋白质为结构尾部蛋白质为结构区区, ,重组区重组区 attatt（attachmentattachment）、）、intint（intagrateintagrate）及）及xisxis（excissionexcission），调控区启动子、终止子和），调控区启动子、终止子和NuINuI基因，基因， O-R O-R 为裂解区。为裂解区。1 1 噬菌体发育调节噬菌体发育调

2、节 吸附吸附 立即早期转录立即早期转录 延迟早期转录延迟早期转录 溶源溶源和裂解的感染分化和裂解的感染分化 进入裂解生长进入裂解生长 溶源化溶源化 噬菌体的可取代区噬菌体的可取代区 J J 基因与基因与 CroCro 基因之间的基因之间的 DNA DNA 被被 ga1 ga1 基因或基因或 bio bio 基因替换后，不影响基因替换后，不影响 噬菌体裂解生长。这个区噬菌体裂解生长。这个区段约占段约占噬菌体噬菌体 DNA DNA 的的 1/3 1/3 ，主要包含控制，主要包含控制噬菌体噬菌体进入溶源状态的调节基因和功能基因进入溶源状态的调节基因和功能基因 2 2 噬菌体载体的选择标记噬菌体载体的

3、选择标记 2.1 2.1 基因组大小基因组大小 重组重组噬菌体的基因组噬菌体的基因组 DNA DNA 太大或太小太大或太小会影响其存活能力。外源会影响其存活能力。外源 DNA DNA 片段的大小将在片段的大小将在 9-23kb 9-23kb 范围内范围内 2.2 2.2 lacZlacZ 基因基因 lacZlacZ 基因也可用于基因也可用于 噬菌体载体，通过插入或噬菌体载体，通过插入或替换载体中的替换载体中的 -半乳糖苷酶基因片段，在半乳糖苷酶基因片段，在 IPTG/X-IPTG/X-gal gal 平板上可通过噬菌斑的颜色，筛选重组噬菌体平板上可通过噬菌斑的颜色，筛选重组噬菌体 噬菌体载体的

4、选择标记噬菌体载体的选择标记2.3 2.3 基因基因 c c 失活失活 基因基因 c c 是是 噬菌体的抑制基因，全面抑制噬菌体的抑制基因，全面抑制并阻断基因的表达并阻断基因的表达 。如果外源。如果外源 DNA DNA 片段插入基因片段插入基因 c c 中，将高频率地使中，将高频率地使 E.coli E.coli 进入裂解生长状态。进入裂解生长状态。2.4 Spi 2.4 Spi 筛选筛选 通过通过噬菌体载体噬菌体载体 DNA DNA 上的上的 redred 和 / 或 gam 基因的缺失或替换，可在 P2 噬菌体溶源性细菌中鉴别重组和非重组噬菌体。 3.3.代表性代表性噬菌体载体噬菌体载体3

5、.1 插入型载体插入型载体 通过特定的酶切位点允许外源通过特定的酶切位点允许外源 DNA 片段片段插入的载体称为插入型载体。由于插入的载体称为插入型载体。由于 噬菌体噬菌体对所包装的对所包装的 DNA 有大小的限制，因此一般有大小的限制，因此一般插入型载体设计为可插入插入型载体设计为可插入 6kb 外源外源 DNA 片片段，最大段，最大 11kb 。 gt10载体载体大小为大小为 43340bp 43340bp ，是经典的，是经典的 噬菌体载噬菌体载体，主要用作体，主要用作 cDNAcDNA 克隆，允许的插入片段大克隆，允许的插入片段大小为小为 0-6kb0-6kb 。 gt11gt11 载体

6、载体 大小为大小为 43.7kb 43.7kb ，是一个常用的载体。，是一个常用的载体。 gt11 gt11 载体允许插入的载体允许插入的 DNA DNA 片段大小为片段大小为 0 07.2kb 7.2kb 。它用于构建。它用于构建 cDNAcDNA 文库、基因组文库和文库、基因组文库和表达融合蛋白。表达融合蛋白。 该载体最大的特点是在最左侧可替代区该载体最大的特点是在最左侧可替代区置换了一段置换了一段 lac5基因，可编码基因，可编码 -半乳糖苷半乳糖苷酶，在酶，在 IPTG/X-gal 平板上形成兰色噬菌斑。平板上形成兰色噬菌斑。lac5基因编码区终止密码子之前有一基因编码区终止密码子之前

7、有一个个 EcoR 位点（位点（53bp 上游），可用于外上游），可用于外源源 DNA 片段的插入。片段的插入。 筛选时，在筛选时，在lac-宿主菌中非重组噬菌宿主菌中非重组噬菌斑为兰色。当外源斑为兰色。当外源 DNA 片段与片段与 lacZ的阅的阅读框相吻合时，可表达出融合蛋白，可用免读框相吻合时，可表达出融合蛋白，可用免疫学方法筛选阳性重组子。疫学方法筛选阳性重组子。 GEM-2/4 GEM-2 和和 GEM-4都是由都是由 gt10 改造而来，也是改造而来，也是 cDNA 克隆载体克隆载体 ZAP ZAP 整体上与整体上与 gt11 相似，不同的是在基因相似，不同的是在基因 J和和 at

8、t 位点之间用位点之间用 pBluescript SK 质粒片段取代了相应的质粒片段取代了相应的 噬菌体片段，允许插入噬菌体片段，允许插入 0-10kb 的外源片段。因此，该载体具备了的外源片段。因此，该载体具备了 pBluescript SK 质粒的一些特性，如质粒的一些特性，如 -互补以及可通过启动子合成互补以及可通过启动子合成 RNA 探针。探针。 Excell Excell 大小为大小为 45.5kb ，与，与 ZAP 相似。不同的是，在该载体中装载相似。不同的是，在该载体中装载了了 pExCell 质粒载体片段（质粒载体片段（4190bp）。该载体允许外源）。该载体允许外源 DNA

9、插入的大小插入的大小为为 0-6kb ，主要用于，主要用于 cDNA 克隆。克隆。 pExCell 与与 pBluescript 载体相似，除载体相似，除了多克隆位点不同外，插入了一段来自了多克隆位点不同外，插入了一段来自 噬菌体的片段。该片段含有噬菌体的片段。该片段含有 噬噬菌体整合到大肠杆菌染色体所必须的整合位点菌体整合到大肠杆菌染色体所必须的整合位点 att。 3.2 3.2 置换型载体置换型载体 允许外源允许外源 DNA DNA 片段替换非必须片段替换非必须 DNA DNA 片段的载体，称为置换型载体片段的载体，称为置换型载体（replacement replacement vecto

10、rsvectors）。）。一般情况下，置换型载体克隆外一般情况下，置换型载体克隆外源片段的大小范围是源片段的大小范围是 9-23kb 9-23kb ，故而该载，故而该载体主要用来构建基因组文库。体主要用来构建基因组文库。 EMBL3 和和 EMBL4 这两个载体大小为这两个载体大小为 43kb ，其左臂、右臂和填充片段的大小分别，其左臂、右臂和填充片段的大小分别为为 20kb、 9kb 和和 14kb 。从提高克隆效率角度来看，它们克隆。从提高克隆效率角度来看，它们克隆 DNA 片段的大小为片段的大小为 9-23kb 。在填充片段中带有。在填充片段中带有red和和gam基因，当外基因，当外源片

11、段替换填充片段后，重组体将变成源片段替换填充片段后，重组体将变成red-gam-，同时载体上含有，同时载体上含有chiC位点，因此可用位点，因此可用 P2 噬菌体的溶源性大肠杆菌进行噬菌体的溶源性大肠杆菌进行 Spi 筛选重筛选重组体组体 l 2001、 DASH 和和 FIX 载体载体 2001、 DASH 和和 FIX 载体的结构和大小与载体的结构和大小与 EMBL3 载体相似，载体相似，主要不同在于多克隆位点的酶切位点数量、排列和种类不同。主要不同在于多克隆位点的酶切位点数量、排列和种类不同。 DASH 和和 FIX 载体的特点在于，在其多克隆位点中含有载体的特点在于，在其多克隆位点中含

12、有 T7 噬菌体噬菌体启动子和启动子和 T3 噬菌体的启动子。这些噬菌体的启动子可在体外转录合噬菌体的启动子。这些噬菌体的启动子可在体外转录合成成RNA，用作染色体步查（，用作染色体步查（chromosome walking）的探针。）的探针。 l GEM-11 载体载体 GEM-11 载体的左右臂来自载体的左右臂来自 EMBL3 载体，填充片段来载体，填充片段来自自 2001 ，是一个多功能置换载体。其多克隆位点与上，是一个多功能置换载体。其多克隆位点与上述置换载体稍有不同，但保留述置换载体稍有不同，但保留 Xho 位点，同时在填充位点，同时在填充片段的最末端各有一个识别片段的最末端各有一个

13、识别 8 个核苷酸序列的稀有酶切位个核苷酸序列的稀有酶切位点点Sfi 。在获得阳性克隆后，通过。在获得阳性克隆后，通过Sfi 酶切位点可将酶切位点可将外源片段从载体中切割下来进行亚克隆，而在相当大程度外源片段从载体中切割下来进行亚克隆，而在相当大程度上不会切割外源片段。还有一个区别是，在右边的多克隆上不会切割外源片段。还有一个区别是，在右边的多克隆位点中有位点中有 SP6 噬菌体的启动子，而不是噬菌体的启动子，而不是 T3 噬菌体的启动噬菌体的启动子子 二二噬菌体载体的克隆原理及噬菌体载体的克隆原理及步骤步骤 主要用于克隆主要用于克隆DNADNA片段，构建片段，构建cDNAcDNA文库和文库和

14、基因组文库并丛中筛选目的基因。原理同质粒基因组文库并丛中筛选目的基因。原理同质粒载体，只是相对分子量太大不能通过转化法直载体，只是相对分子量太大不能通过转化法直接进入大肠杆菌，要通过包装接进入大肠杆菌，要通过包装DNADNA形成噬菌体形成噬菌体颗粒注射到宿主菌中。颗粒注射到宿主菌中。 步骤；步骤；通过裂解增殖载体通过裂解增殖载体 载体与外源载体与外源DNADNA的酶切的酶切外源外源DNADNA与载体连接与载体连接重组噬菌体重组噬菌体的体外包装的体外包装包装噬菌体颗粒的感染包装噬菌体颗粒的感染 筛选筛选PL第四节、单链丝状噬菌体载体第四节、单链丝状噬菌体载体 方便的制备单链方便的制备单链DNA，

15、用于定点诱变、，用于定点诱变、DNA核苷酸序列测定和制备单链核苷酸序列测定和制备单链DNA探针。探针。一、一、M13M13噬菌体的生物学噬菌体的生物学1 组成和结构 M13 噬菌体的基因组为单链 DNA ，由 6407 的碱基组成 。基因组 90% 以上的序列可编码蛋白质，共有 11 个编码基因，基因之间的间隔区多为几个碱基 M13 噬菌体基因组可编码 3 类蛋白质，包括复制蛋白（基因 ， 和 ），形态发生蛋白（基因， 和 ），结构蛋白（基因 、 和 ）。所有结构蛋白在形态发生之前都插入在宿主细胞的质膜中。基因组 DNA 为正链，按基因 至基因 方向合成，与噬菌体的 mRNA 序列同义。 2

16、M13 2 M13 噬菌体的增殖噬菌体的增殖吸附感染复制组装 3 M133 M13噬菌体载体噬菌体载体 单链单链 DNA DNA 的酶切和连接是比较困难的，因此的酶切和连接是比较困难的，因此 M13 M13 噬菌体在噬菌体在用作载体时是利用其双链状态的用作载体时是利用其双链状态的 RF DNARF DNA。RF DNA RF DNA 很容易从感很容易从感染细胞中纯化出来，可以象质粒一样进行操作，并可通过转化染细胞中纯化出来，可以象质粒一样进行操作，并可通过转化方法再次导入细胞。方法再次导入细胞。 4 4 载体的插入位点载体的插入位点 M13 M13 噬菌体基因组中绝大多数为必需基因，只有两个间

17、隔区噬菌体基因组中绝大多数为必需基因，只有两个间隔区可用来插入外源可用来插入外源 DNADNA（基因（基因 / / 和基因和基因 / / 之间）之间） 。基。基因因 和基因和基因 之间的之间的 508bp 508bp 间隔区是主要的外源片段插入间隔区是主要的外源片段插入位点。在基因位点。在基因 和基因和基因 之间的小间隔区也可用来插入外之间的小间隔区也可用来插入外源片段，但是在操作过程中，需要获得感染细胞的菌落进行影源片段，但是在操作过程中，需要获得感染细胞的菌落进行影印筛选，比利用可见的噬菌斑方法更慢更麻烦。基因印筛选，比利用可见的噬菌斑方法更慢更麻烦。基因 也可也可用来克隆外源片段用来克隆

18、外源片段5 M13 噬菌体载体组成 现在所使用的现在所使用的 M13 M13 噬菌体载体是噬菌体载体是 Messing Messing 及其同事及其同事建立的建立的 mp mp 系列载体，以基因系列载体，以基因 和基因和基因 之间的区域之间的区域作为外源作为外源 DNA DNA 插入区。插入区。 mp mp 载体系列都是从同一个重组载体系列都是从同一个重组 M13 M13 噬菌体噬菌体 （M13mplM13mpl） 改造而来的。在改造而来的。在 M13mpl M13mpl 载体中，间隔区内的载体中，间隔区内的 HaeHae 位位点插入了一小段大肠杆菌点插入了一小段大肠杆菌 DNA DNA ，引

19、入，引入 互补筛选互补筛选 。6M13mpl8 和 M13mpl9 这两个载体含有这两个载体含有 13 13 个不同的酶切位点，可供插入由个不同的酶切位点，可供插入由多种各不相同的限制酶切割而成的多种各不相同的限制酶切割而成的 DNA DNA 片段。片段。 两种载体两种载体只是在只是在 lacZlacZ 区内不对称的多克隆区的方向上有所不同区内不对称的多克隆区的方向上有所不同 。M13噬菌体载体的宿主菌由于由于 M13 噬菌体通过噬菌体通过 F 质粒编码的性纤质粒编码的性纤毛进入宿主细胞内，故只能用雄性细菌来毛进入宿主细胞内，故只能用雄性细菌来增殖病毒。增殖病毒。 Messing 及其同事已经

20、构建了及其同事已经构建了许多携带许多携带 F 质粒并便于质粒并便于 M13 载体进行基载体进行基因操作的多种大肠杆菌菌株。因操作的多种大肠杆菌菌株。丝状噬菌体载体克隆中经常遇到的问题 外源外源DNA区段的部分丢失区段的部分丢失 外源外源DNA总是以单方向插入总是以单方向插入二 噬菌粒 一类由质粒载体和单链噬菌体载体结合而成的新型的载一类由质粒载体和单链噬菌体载体结合而成的新型的载体系列体系列 ，是集质粒和丝状噬菌体的有利特征于一身的载，是集质粒和丝状噬菌体的有利特征于一身的载体，具有体，具有 ColE1 复制起点及抗生素抗性选择标记的质粒，复制起点及抗生素抗性选择标记的质粒，以及丝状体噬菌体的间隔区。以及丝状体噬菌体的间隔区。 pUC118和和pUCll9是一对分别由是一对分别由pUC18和和pUC19质粒与质粒与野生型野生型M13噬菌体的基因间隔区（噬菌体的基因间隔区（