动物细胞培养和核移植技术(上课用)[1]

1、动物细胞培养和核移植技术动物细胞培养和核移植技术第一课时第一课时动物细胞工程常用的技术手段：动物细胞工程常用的技术手段：动物细胞培养、动物细胞培养、 动物细胞核移植、动物细胞核移植、动物细胞融合、动物细胞融合、 单克隆抗体单克隆抗体动物细胞培养技术动物细胞培养技术是其他动物细胞工程技术的是其他动物细胞工程技术的基础。基础。提问：提问：v植物细胞工程常用的技术手段有哪些？植物细胞工程常用的技术手段有哪些？植物组织培养植物组织培养, 植物体细胞杂交植物体细胞杂交10代代细细胞胞50代代细细胞胞不不死死细细胞胞细胞核型细胞核型不变不变动物胚胎或幼龄动动物胚胎或幼龄动物的组织、器官物的组织、器官细胞悬

2、浮液细胞悬浮液胰蛋白酶胰蛋白酶1010代细胞代细胞5050代细胞代细胞细胞株细胞株无限传代（不死无限传代（不死性）性）细胞系细胞系遗传物质遗传物质改变改变遗传物质未遗传物质未改变改变 多细胞动物和人体的细胞都生活在内环境中，多细胞动物和人体的细胞都生活在内环境中，根据你所学的内环境的知识，思考以下问题：根据你所学的内环境的知识，思考以下问题： 1. 1.体外培养细胞时需要提供哪些物质？体外培养细胞时需要提供哪些物质？ 2.2.体外培养的细胞需要什么样的环境条件？体外培养的细胞需要什么样的环境条件？ P46讨讨 论论充足营养（糖、氨基酸、促生长因子、无机盐、微量充足营养（糖、氨基酸、促生长因子、

3、无机盐、微量元素等合成成分及血清、血浆等天然成分。）元素等合成成分及血清、血浆等天然成分。）适宜温度、适宜温度、PHPH和气体环境；无菌无毒环境和气体环境；无菌无毒环境4、动物细胞培养条件：、动物细胞培养条件：1、无菌、无毒的环境、无菌、无毒的环境 （添加一定量的（添加一定量的抗生素抗生素，定期更换培养液），定期更换培养液）2、营养、营养（葡萄糖葡萄糖、氨基酸、无机盐、维生素、氨基酸、无机盐、维生素、动物血清动物血清等。等。）3、温度和、温度和PH 36.5+（-）0.5度, 7.2-7.44、气体环境：、气体环境： O2和和CO2（95%空气和空气和5% CO2 ）保证细胞顺利的保证细胞顺利

4、的生长增殖生长增殖维持培养液的维持培养液的PH5、动物细胞培养应用、动物细胞培养应用 大规模培养生产生物制品（病毒疫苗、干大规模培养生产生物制品（病毒疫苗、干扰素、单克隆抗体）扰素、单克隆抗体） 作为基因工程中的受体细胞作为基因工程中的受体细胞 培养的动物细胞可以用于检测有毒物质，培养的动物细胞可以用于检测有毒物质，判断某种物质的毒性判断某种物质的毒性 为治疗和预防癌症及其他疾病提供理论依为治疗和预防癌症及其他疾病提供理论依据据思考：思考：2、为什么选用动物胚胎或幼龄个体的器官或组织做动物细胞、为什么选用动物胚胎或幼龄个体的器官或组织做动物细胞培养材料？培养材料？1、动物细胞培养液的主要成分是

5、什么？较植物组培培养基有何独、动物细胞培养液的主要成分是什么？较植物组培培养基有何独特之处？特之处？3、为什么培养前要将组织细胞分散成单个细胞？、为什么培养前要将组织细胞分散成单个细胞？4、动物细胞培养能否像绿色植物组织培养那样最终培养成新个、动物细胞培养能否像绿色植物组织培养那样最终培养成新个体？体？主要成分：葡萄糖、氨基酸、无机盐、维生素和动物血清等。主要成分：葡萄糖、氨基酸、无机盐、维生素和动物血清等。独特之处有：独特之处有：1、液体培养基、液体培养基 2、成分中有动物血清等、成分中有动物血清等因为这些组织或器官上的细胞生命力旺盛，分裂能力强因为这些组织或器官上的细胞生命力旺盛，分裂能力

6、强成块组织不利培养，分散了做成细胞悬浮液利于培养成块组织不利培养，分散了做成细胞悬浮液利于培养不能，动物细胞培养只能使细胞数目增多，不能发育成新的不能，动物细胞培养只能使细胞数目增多，不能发育成新的动物个体动物个体细胞的全能性细胞的全能性细胞株、细胞系细胞株、细胞系植物体或组织植物体或组织培养结果培养结果获得细胞获得细胞或细胞分泌蛋白或细胞分泌蛋白快速繁殖、培育快速繁殖、培育无病毒植株等无病毒植株等培养目的培养目的葡萄糖、动物血清葡萄糖、动物血清蔗糖、植物激素蔗糖、植物激素培养基特有成分培养基特有成分液体培养基液体培养基固体培养基固体培养基培养基性质培养基性质细胞增殖细胞增殖原理原理动物细胞培

7、养动物细胞培养植物组织培养植物组织培养比较项目比较项目第二课时第二课时动物细胞培养和核移植技术动物细胞培养和核移植技术 卵母细胞卵母细胞母绵羊母绵羊母绵羊母绵羊乳腺细胞乳腺细胞细胞质细胞质细胞核细胞核细胞核移植细胞核移植早期胚胎早期胚胎卵裂卵裂C母绵羊子宫母绵羊子宫胚胎移植胚胎移植多莉羊多莉羊分娩分娩妊娠妊娠多莉羊的培育过程多莉羊的培育过程融合后的卵母细胞融合后的卵母细胞2 2、体细胞核移植的过程：、体细胞核移植的过程：请看教材请看教材P48P48图图2-212-21思考：思考：1.1.核移植的受体细胞是什么？处在什么时期？用此细核移植的受体细胞是什么？处在什么时期？用此细胞作为受体细胞有什么

8、好处？胞作为受体细胞有什么好处？2.2.通过什么手段激活受体细胞，构建重组胚胎？通过什么手段激活受体细胞，构建重组胚胎？ M M中期卵母细胞中期卵母细胞诱导方法：物理或化学方法激活受体细胞，完成诱导方法：物理或化学方法激活受体细胞，完成细胞分裂和发育进程。细胞分裂和发育进程。卵母细胞体积大，便于操作；含有营养物质丰富，卵母细胞体积大，便于操作；含有营养物质丰富，提供早期胚胎发育所需的营养；含有激活细胞核体提供早期胚胎发育所需的营养；含有激活细胞核体现全能性的物质。现全能性的物质。原理：动物细胞核具有全能性原理：动物细胞核具有全能性显微显微操作操作讨论：讨论：（教材（教材P49）1.在体细胞的细

9、胞核移植到受体卵母细胞之在体细胞的细胞核移植到受体卵母细胞之前，为什么必须先去掉受体卵母细胞的核？前，为什么必须先去掉受体卵母细胞的核？ 为使核移植的胚胎或动物的遗为使核移植的胚胎或动物的遗传物质全部来自有重要利用价值的动传物质全部来自有重要利用价值的动物提供的体细胞，在供体细胞的细胞物提供的体细胞，在供体细胞的细胞核移至受体细胞之前，必须将受体细核移至受体细胞之前，必须将受体细胞的遗传物质去掉或将其破坏。胞的遗传物质去掉或将其破坏。 培养的动物细胞一般当传代至培养的动物细胞一般当传代至10105050代左右时，部分细胞核型可能会发生代左右时，部分细胞核型可能会发生变化，其细胞遗传物质可能会发

10、生突变，变化，其细胞遗传物质可能会发生突变，而而1010代以内的细胞一般能保持正常的二代以内的细胞一般能保持正常的二倍体核型。因此，在体细胞核移植中，倍体核型。因此，在体细胞核移植中，为了保证供体细胞正常的遗传基础，通为了保证供体细胞正常的遗传基础，通常采用传代常采用传代1010代以内的细胞。代以内的细胞。2.2.用于核移植的供体细胞一般都选用传代用于核移植的供体细胞一般都选用传代1010代以内的细胞，想一想，这是为什么？代以内的细胞，想一想，这是为什么？3.3.你认为用上述体细胞核移植方法生产的克隆动你认为用上述体细胞核移植方法生产的克隆动物，是对体细胞供体动物进行了物，是对体细胞供体动物进

11、行了100%100%的复制吗？的复制吗？为什么？为什么？克隆动物绝大部分克隆动物绝大部分DNADNA来自于供体细胞核，但来自于供体细胞核，但其核外还有少量的其核外还有少量的DNADNA，即线粒体中的，即线粒体中的DNADNA是是来自于受体卵母细胞。来自于受体卵母细胞。此外，即便动物的遗传基础完全相同，但动物的一些此外，即便动物的遗传基础完全相同，但动物的一些行为、习性的形成与所处环境有很大关系，核供体动行为、习性的形成与所处环境有很大关系，核供体动物生活的环境与克隆动物所生活的环境不会完全相同，物生活的环境与克隆动物所生活的环境不会完全相同，其形成的行为、习性也不可能和核供体动物完全相同，其形

12、成的行为、习性也不可能和核供体动物完全相同，从这一角度看，克隆动物不会是核供体动物从这一角度看，克隆动物不会是核供体动物100%100%的复的复制。制。1.动物细胞培养取材时，一般是取胚胎组织或幼龄动动物细胞培养取材时，一般是取胚胎组织或幼龄动物的组织或器官，请解释原因。物的组织或器官，请解释原因。细胞的衰老与动物机体的衰老有着密切的关系，细胞细胞的衰老与动物机体的衰老有着密切的关系，细胞的增殖能力与供体的年龄有关，幼龄动物细胞增殖能的增殖能力与供体的年龄有关，幼龄动物细胞增殖能力强，有丝分裂旺盛，老龄动物则相反。所以，一般力强，有丝分裂旺盛，老龄动物则相反。所以，一般来说幼年动物的组织细胞比

13、老年动物的组织细胞易于来说幼年动物的组织细胞比老年动物的组织细胞易于培养。同样，组织细胞的分化程度越低，则增殖能力培养。同样，组织细胞的分化程度越低，则增殖能力越强，所以更容易培养。越强，所以更容易培养。肿瘤组织或细胞肿瘤组织或细胞 正常组织或细胞正常组织或细胞 拓展拓展-动物组织或细胞培养的难易程度动物组织或细胞培养的难易程度幼体组织或细胞幼体组织或细胞 老龄组织或细胞老龄组织或细胞分化程度低的组织或细胞分化程度低的组织或细胞 分化程度高的组织或细胞分化程度高的组织或细胞思考与探究思考与探究（教材（教材P50）思考与探究思考与探究（教材（教材P50）2.2.动物细胞培养要经过脱分化的过程吗？

14、为什么？动物细胞培养要经过脱分化的过程吗？为什么？动物细胞培养不需经过脱分化过程。因高动物细胞培养不需经过脱分化过程。因高度分化的动物细胞发育潜能变窄，失去了度分化的动物细胞发育潜能变窄，失去了发育成完整个体的能力，所以，动物细胞发育成完整个体的能力，所以，动物细胞也就没有类似植物组织或细胞培养时的脱也就没有类似植物组织或细胞培养时的脱分化过程了。要想使培养的动物细胞定向分化过程了。要想使培养的动物细胞定向分化，通常采用定向诱导动物干细胞，使分化，通常采用定向诱导动物干细胞，使其分化成所需要的组织或器官。其分化成所需要的组织或器官。3.19973.1997年，美国威斯康星州的一个奶牛场有一头名

15、叫卢辛达年，美国威斯康星州的一个奶牛场有一头名叫卢辛达（LucindaLucinda）的奶牛，年产奶量为）的奶牛，年产奶量为30.8 t30.8 t，创造了世界奶牛产，创造了世界奶牛产奶量最高新纪录。目前世界各国高产奶牛场奶牛，年平均产奶量最高新纪录。目前世界各国高产奶牛场奶牛，年平均产奶量一般为十几吨，而我国奶牛产奶量年平均水平仅为奶量一般为十几吨，而我国奶牛产奶量年平均水平仅为3 34 4 t t。 （1 1）能利用体细胞核移植技术克隆高产奶牛卢辛达）能利用体细胞核移植技术克隆高产奶牛卢辛达吗？请说明理由。吗？请说明理由。可以。卢辛达的产奶量很高，有高产奶的遗传基础，可以。卢辛达的产奶量很

16、高，有高产奶的遗传基础，利用卢辛达的体细胞克隆的奶牛其遗传物质基本上利用卢辛达的体细胞克隆的奶牛其遗传物质基本上全部来自该奶牛，其克隆牛具有高产的遗传基础，全部来自该奶牛，其克隆牛具有高产的遗传基础，如果精心培育和饲养，有可能在世界范围内推广，如果精心培育和饲养，有可能在世界范围内推广，克隆牛再与高产的公牛自然繁殖，可得到很多高产克隆牛再与高产的公牛自然繁殖，可得到很多高产的后代，从而加快奶牛改良进程。的后代，从而加快奶牛改良进程。该克隆牛不能无限制地推广，其数量不宜过多，尤该克隆牛不能无限制地推广，其数量不宜过多，尤其是在小范围内不能无限的繁殖，以避免奶牛群出其是在小范围内不能无限的繁殖，以

17、避免奶牛群出现近亲繁殖而引起种质衰退。现近亲繁殖而引起种质衰退。（2 2）如果将克隆高产奶牛卢辛达的任务交给你，你将如何）如果将克隆高产奶牛卢辛达的任务交给你，你将如何对它进行克隆？对它进行克隆？从卢辛达耳朵（也可用别的组织、器官，耳朵在活体从卢辛达耳朵（也可用别的组织、器官，耳朵在活体上容易取）上剪取一小块组织，在体外培养获得该组上容易取）上剪取一小块组织，在体外培养获得该组织（如软骨组织）的细胞。从屠宰场取废弃的牛卵巢，织（如软骨组织）的细胞。从屠宰场取废弃的牛卵巢，抽取卵母细胞体外培养成熟。用显微针去除卵母细胞抽取卵母细胞体外培养成熟。用显微针去除卵母细胞的核，再将耳细胞注入卵母细胞，用

18、电刺激方法使卵的核，再将耳细胞注入卵母细胞，用电刺激方法使卵母细胞与体细胞融合，这时供体核就进入了受体卵母母细胞与体细胞融合，这时供体核就进入了受体卵母细胞，再用电刺激或化学物质激活注入了体细胞核的细胞，再用电刺激或化学物质激活注入了体细胞核的卵母细胞，使其完成减数分裂和发育过程。核移植胚卵母细胞，使其完成减数分裂和发育过程。核移植胚胎在体外短时间培养后，挑选正常卵裂的胚胎植入经胎在体外短时间培养后，挑选正常卵裂的胚胎植入经同期发情处理的受体母牛体内。同期发情处理的受体母牛体内。4.4.体细胞核移植技术在研究和应用上还存在什么体细胞核移植技术在研究和应用上还存在什么问题？请你查阅资料，了解这方

19、面的前沿动态。问题？请你查阅资料，了解这方面的前沿动态。研究方面：克隆动物基因组重新编程的机制研究方面：克隆动物基因组重新编程的机制尚不清楚，克隆技术效率低，克隆动物畸形尚不清楚，克隆技术效率低，克隆动物畸形率高、死亡率高、易出现早衰等问题。这些率高、死亡率高、易出现早衰等问题。这些问题尚在研究中。问题尚在研究中。应用上：生产克隆动物费用昂贵，距大规模应用上：生产克隆动物费用昂贵，距大规模应用还有一定距离。应用还有一定距离。知识拓展知识拓展1 1.动物细胞培养技术是如何发展起来的？动物细胞培养技术是如何发展起来的？ 19071907年，哈里森（年，哈里森（HarrisonHarrison）在无

20、菌条件下用淋巴液作培养基，培）在无菌条件下用淋巴液作培养基，培养蛙胚神经组织存活数周，并观察到神经细胞突起的生长过程，由养蛙胚神经组织存活数周，并观察到神经细胞突起的生长过程，由此创建了盖片覆盖凹窝玻璃悬滴培养法，奠定了动物组织体外培养此创建了盖片覆盖凹窝玻璃悬滴培养法，奠定了动物组织体外培养的基础。之后，又有人将悬滴培养法改良为双盖片培养，提高了传的基础。之后，又有人将悬滴培养法改良为双盖片培养，提高了传代效率并减少了污染。代效率并减少了污染。19231923年，卡雷尔（年，卡雷尔（CarrelCarrel）设计了卡氏瓶培）设计了卡氏瓶培养法，扩大了组织生存空间。养法，扩大了组织生存空间。

21、19511951年，年， 厄尔厄尔 （EarleEarle） 发明了发明了体外培养动物细胞的人工合成培养基。体外培养动物细胞的人工合成培养基。19511951年，波米拉（年，波米拉（PomeratPomerat）设计了灌流小室，使细胞生活在不断更新的培养液中，便于作显微设计了灌流小室，使细胞生活在不断更新的培养液中，便于作显微摄影和细胞代谢的研究。摄影和细胞代谢的研究。19571957年，格拉夫（年，格拉夫（GraffGraff）用灌流技术进）用灌流技术进一步提高了细胞悬浮培养的效率。一步提高了细胞悬浮培养的效率。19571957年，杜尔贝科（年，杜尔贝科（DulbeccoDulbecco）等

22、人采用胰蛋白酶消化处理和应用液体培养基的方法，获得了单层等人采用胰蛋白酶消化处理和应用液体培养基的方法，获得了单层细胞培养。单层培养法的出现，对组织培养的发展起了很大的推动细胞培养。单层培养法的出现，对组织培养的发展起了很大的推动作用。此后单层培养成为组织培养普遍应用的技术。作用。此后单层培养成为组织培养普遍应用的技术。2020世纪世纪6060年代年代后，动物细胞大规模培养技术开始起步，并逐步发展。后，动物细胞大规模培养技术开始起步，并逐步发展。2020世纪世纪8080年年代后，随着基因工程和其他细胞工程技术的发展，细胞培养技术已代后，随着基因工程和其他细胞工程技术的发展，细胞培养技术已成为转

23、基因技术、生物制药及其他许多技术的基础，在现代生物技成为转基因技术、生物制药及其他许多技术的基础，在现代生物技术中发挥着重要的作用。术中发挥着重要的作用。知识拓展知识拓展2 2.为什么动物细胞要分散成单个细胞培养？用酶消化的为什么动物细胞要分散成单个细胞培养？用酶消化的是什么物质？是什么物质？ 细胞原代培养时可以分散成单个细胞培养，也可以用细胞细胞原代培养时可以分散成单个细胞培养，也可以用细胞群（团）、组织块培养，经传代培养后，最终都为细胞培群（团）、组织块培养，经传代培养后，最终都为细胞培养。养。分散成单个细胞、细胞群（团）后容易培养，细胞所需的分散成单个细胞、细胞群（团）后容易培养，细胞所

24、需的营养容易供应，其代谢废物容易排出；而用大块组织培养营养容易供应，其代谢废物容易排出；而用大块组织培养时，内部细胞的营养供应和代谢废物的排出都较困难，因时，内部细胞的营养供应和代谢废物的排出都较困难，因此，这些细胞在体外长时间的生存和生长就较困难。同时，此，这些细胞在体外长时间的生存和生长就较困难。同时，分散成单个细胞培养，可使得在细胞水平操作的其他技术分散成单个细胞培养，可使得在细胞水平操作的其他技术得以实现。得以实现。用酶消化的是细胞间基质，细胞间基质主要成分有胶原蛋用酶消化的是细胞间基质，细胞间基质主要成分有胶原蛋白、层粘连蛋白、纤粘连蛋白、弹性蛋白等成分。用蛋白白、层粘连蛋白、纤粘连蛋白、弹性蛋白等成分。用蛋白酶可使其消化，从而使细胞相互分离。酶可使其消化，从而使细胞相互分离。知识拓展知识拓展3 3.体细胞核移植技术为什么要选择体细胞核移植技术为什么要选择MM期的卵母细期的卵母细胞做受体细胞？胞做受体细胞？ 细胞核移植技术中能用作受体细胞的通常有细胞核移植技术中能用作受体细胞的通常有MM期卵母细胞期卵母细胞和受精卵（合子）。早期核移植