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文档简介
1、1蛋白质的分离、纯化和表征蛋白质的分离、纯化和表征第第 7 7 章章P291一、蛋白质的酸碱性质 蛋白质分子中有很多酸性和碱性解离基团,是具有两性解离性质的化合物。各种解离基团的解离度与溶液的pH有关,pH越低,碱性解离度越大,蛋白质分子带正电荷越多,负电荷越少;pH升高,则解离情况相反。 在特定pH条件下,某种蛋白质分子所带正负电荷相等,静电荷为零,这一pH 称为该蛋白质的等电点(pI)。蛋白质的等电点 有中性盐时,蛋白质等电点在一定程度上决定于介质中离有中性盐时,蛋白质等电点在一定程度上决定于介质中离子的组成。如子的组成。如Ca2+、Mg2+、Cl-、等可与蛋白质某些可解离、等可与蛋白质某
2、些可解离基团结合,影响等电点。基团结合,影响等电点。 无盐类干扰时,蛋白质分子本身的质子供体基团解离出来无盐类干扰时,蛋白质分子本身的质子供体基团解离出来的质子数与它的质子受体基团结合的质子数相等时的溶液的质子数与它的质子受体基团结合的质子数相等时的溶液pH称为等离子点称为等离子点(isoionic point,或称等离点或称等离点)。等离子点是。等离子点是每种蛋白质的一个特征常数。每种蛋白质的一个特征常数。几种蛋白质等电点几种蛋白质等电点二、蛋白质的分子大小与分子量的测二、蛋白质的分子大小与分子量的测定定蛋白质的分子量的范围:61031106 Da(一)根据化学组成测定最低相对分子量 用化学
3、分析方法测出蛋白质中某一微量元素的含量。并假设蛋白质分子中含有一个被测元素的原子,则可由此计算出蛋白质的最低分子量。 例:肌红蛋白和血红蛋白含铁量均为0.335%,计算二者的相对分子质量。 最低相对分子量 x 100 =铁的百分含量 铁的原子量0.335 55.8x 100=16700测定蛋白质相对分子量的原理和方法也可以利用蛋白质中含量特少的也可以利用蛋白质中含量特少的aa,用同样的原,用同样的原理计算蛋白质的最低分子量。理计算蛋白质的最低分子量。(二)渗透压法测定相对分子(二)渗透压法测定相对分子量量 渗透压法测定Mr操作简单, Mr在10-100 kDa时较准,但不能区别蛋白质分子是否均
4、一 。 渗透压公式: Mr =RTlimc0c(c=质量浓度,g/mol)(三)沉降分析测定(三)沉降分析测定Mr 超速离心机最大转速超速离心机最大转速: 6000080 000r/min, 相当于位于相当于位于距转轴中心距转轴中心10 cm处、单位质量处、单位质量(1g)分子所受到的离心力分子所受到的离心力(离心场强度离心场强度)为为400 000 g700 000 g. 沉降速度与蛋白质分子大小、密度和形状有关沉降速度与蛋白质分子大小、密度和形状有关,且与溶剂且与溶剂密度和黏度有关密度和黏度有关. 单位离心场强度的沉降速度称为单位离心场强度的沉降速度称为沉降系数沉降系数, 用用s(小写小写
5、)表示表示: 蛋白质、核酸、核糖体和病毒等的沉降系数介于11013到2001013秒之间。为了使用方便,以1013秒为一个沉降系数的单位,称为斯维得贝格单位(Svedberg unit),或称沉降系数单位,用S表示。如人血红蛋白的S为4.461013秒,即4.46S。 蛋白质的沉降系数(s)与相对分子质量(Mr)的关系可用斯维得贝格方程表达:)1 (vDRTsMr摩尔气体常数(8.314JK-1mol-1);热力学温度(K),旧称绝对温度蛋白质的扩散系数(cm2/s), 数值上等于当浓度梯度为1个单位时在1 s内通过1 cm2面积的蛋白质质量溶剂的密度(g/cm3)偏微比体积(cm3/g) 又
6、称偏微比容,蛋白质溶于水的偏微比容约0.74 cm3/g沉降系数(四)凝胶过滤法测定(四)凝胶过滤法测定Mr 凝胶过滤(层析)可按照蛋白质分子量大小进行分离的技术,同时可以测定蛋白质分子量。 蛋白质通过凝胶柱的速度即洗脱体积与其分子量有关:先测得几种标准蛋白质的先测得几种标准蛋白质的Ve Ve (VeVe为洗脱体积)为洗脱体积) ,并,并以其分子量对数对以其分子量对数对VeVe作图得作图得一直线,再测出待测样品的一直线,再测出待测样品的VeVe,查标准曲线即可确定分,查标准曲线即可确定分子量,并以其分子量对数对子量,并以其分子量对数对VeVe作图得一直线,再测出待作图得一直线,再测出待测样品的
7、测样品的VeVe,查标准曲线即,查标准曲线即可确定分子量。可确定分子量。LogMLogMA AB BC CLogMLogM测测V V测测(五)(五)SDS-PAGE法测定法测定Mr 聚丙烯酰胺凝胶电泳具有较高分辨率,用它分离、检测蛋白质混合样品,主要是根据各蛋白质各组分的电泳迁移率的不同。这种差异就蛋白质分子本身而言,主要与其所带净电荷以及分子量和形状有关。 当电泳体系中含有一定浓度的十二烷基硫酸钠(SDS)时,则得电泳迁移率的大小只取决于蛋白质的分子量,从而可直接由电泳迁移率推算出蛋白质的分子量。 SDS破坏蛋白氢键和疏水相互作用破坏蛋白氢键和疏水相互作用, 巯基乙醇能打开二硫巯基乙醇能打开
8、二硫键键, SDS和巯基乙醇存在下和巯基乙醇存在下,单体蛋白或亚基单体蛋白或亚基(寡聚蛋白质解寡聚蛋白质解离成亚基离成亚基) 处展开状态处展开状态. SDS 烃链与蛋白质侧链通过疏水相互作用形成复合体烃链与蛋白质侧链通过疏水相互作用形成复合体. 在在一定条件下一定条件下, SDS与大多数蛋白质的结合比与大多数蛋白质的结合比: 1.4g SDS / 1 g蛋白质蛋白质,相当于每两分子氨基酸残基结合一分子相当于每两分子氨基酸残基结合一分子SDS. SDS 与蛋白质结合后与蛋白质结合后: 第一第一, SDS 阴离子使多肽链覆盖上阴离子使多肽链覆盖上相同密度的负电荷相同密度的负电荷, 远超过蛋白质原有
9、电荷量远超过蛋白质原有电荷量, 掩盖了不同掩盖了不同蛋白质间原有的电荷差别蛋白质间原有的电荷差别; 第二第二, 改变蛋白质的天然构象改变蛋白质的天然构象, 使大多数蛋白质采取类似的形状使大多数蛋白质采取类似的形状. 因此在因此在 SDS 存在下的电存在下的电泳几乎是完全基于相对分子质量分离蛋白质的泳几乎是完全基于相对分子质量分离蛋白质的.聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳 ( SDS-PAGE)SDS-PAGE,迁移率不受蛋白质原有的电荷、分子形状等因素影响, 但凝胶具分子筛效应. 因此,迁移率与相对分子质量(Mr)之关系:rrbaMlg常数常数相对迁移率:相对迁移率:样品迁移距离样品迁移距
10、离/ /前沿前沿( (染料染料) )蛋白质亲水胶体的稳定性主要取决于两个因素: 双电层 水化层三、胶体性质与蛋白质的沉淀1蛋白质胶体溶液的稳定性蛋白质胶体溶液的稳定性 蛋白质颗粒大小属于胶体粒子的范围(1-100nm)。又由于其分子表面有许多极性基团,亲水性极强,易溶于水成为稳定的亲水胶体溶液。 蛋白质胶体溶液的稳定性是有条件的,相对的。假若改变环境条件,破坏其水化膜和双电层,蛋白质亲水胶体便失去稳定性,发生絮结沉淀现象,这既是所谓的蛋白质沉淀作用。 盐析法(salting out) : 中性盐(NH4SO4,NaSO4,NaCl等) 蛋白质脱去水化层。 优点:不引起蛋白质变性。 盐溶(sal
11、ting in):稀盐溶液中蛋白质溶解度增 加的现象。2蛋白质的沉淀 有机溶剂沉淀法: 极性有机溶剂(甲醇,乙醇,丙酮)脱去水化层以及降低介电常数 而增加带电质点间的相互作用。 条件:低温操作,缩短时间。 重金属盐沉淀法:当溶液pHpI,蛋白质颗粒带负电荷,易与重金属离子 (Hg2+,Pb2+,Cu2+,Ag+等) 生成沉淀。 生物碱试剂和某些酸类沉淀法:生物碱试剂能引起生物碱沉淀的一类试剂。 当溶液pHpI时,蛋白质颗粒带正电荷 易与生物碱试剂,酸根负离子反应沉淀 用途:临床除去体液中干扰测定的蛋白质加热变性沉淀法 原因:加热变性使蛋白质天然结构解体,疏水基外露,损坏了水化层 用途:制豆腐(
12、加热+少量盐卤)四、蛋白质分离纯化的一般原则四、蛋白质分离纯化的一般原则前处理:细胞破碎前处理:细胞破碎粗分级分离:盐析、等电点沉淀、有机溶剂沉淀等粗分级分离:盐析、等电点沉淀、有机溶剂沉淀等细分级分离:层析、电泳、结晶细分级分离:层析、电泳、结晶 蛋白质纯化测总目标:增加蛋白质纯化测总目标:增加纯度或比活力纯度或比活力 动物材料剔除结缔组织、脂肪组织动物材料剔除结缔组织、脂肪组织; ; 种子材料应先去壳种子材料应先去壳和种皮以免受单宁等物质的污染和种皮以免受单宁等物质的污染, , 油料种子脱脂油料种子脱脂. . 选择适当方法选择适当方法, ,破碎组织或细胞:动物组织破碎组织或细胞:动物组织(
13、 (电动捣碎机电动捣碎机或匀浆器或超声或匀浆器或超声);); 植物组织植物组织( (英砂或玻璃粉和适当的缓冲液研磨或用英砂或玻璃粉和适当的缓冲液研磨或用纤维素纤维素酶酶); ); 细菌细胞细菌细胞( (超声超声, ,与砂研磨或与砂研磨或溶菌酶溶菌酶).). 选择适当的缓冲液把所要的蛋白质提取出来选择适当的缓冲液把所要的蛋白质提取出来. . 如果蛋白质是与细胞膜或膜质细胞器结合的如果蛋白质是与细胞膜或膜质细胞器结合的, , 用超声波用超声波或去污剂使膜结构解聚或去污剂使膜结构解聚, , 用适当的介质提取。用适当的介质提取。前处理: :五、蛋白质分离纯化的一般方法五、蛋白质分离纯化的一般方法 根据
14、分子量:如沉降速度法离心 根据密度:沉降平衡法离心 根据电荷和分子量:聚丙烯酰胺凝胶电泳 根据分子量和分子形状:凝胶过滤 根据溶解度:硫酸铵分级沉淀、有机溶剂分级沉淀 根据电荷:等电点沉淀 透析:利用半透膜的选择通透性来纯化象蛋白质这样的大分子物质的过程叫透析。 超过滤:是利用压力或离心力,强行使水和其他小分子而蛋白质分子被截留在膜上,以达到浓缩和脱盐的目的,有时要用切向流过滤法。(一)根据分子大小不同的分离纯化方法磁力搅拌器磁力搅拌器透析液透析液装有蛋白溶液的透析袋装有蛋白溶液的透析袋搅拌子搅拌子 透析透析 超滤超滤 离心技术主要用于各种生物样品的分离和制备,生物样品悬浮液在高速旋转下,由于
15、巨大的离心力作用,使悬浮的微小颗粒(细胞器、生物大分子的沉淀等)以一定的速度沉降,从而与溶液得以分离,而沉降速度取决于颗粒的质量、大小和密度。 密度梯度离心技术是利用每种蛋白质颗粒沉降到与自身密度相等的密度梯度时即停止不前,最后各种蛋白质在离心管中被分离成各自的区带。 常用的密度梯度有蔗糖梯度,聚蔗糖梯度等。密度梯度(区带)离心常用于生成密度梯度常用于生成密度梯度的介质是蔗糖、聚蔗的介质是蔗糖、聚蔗糖(糖(Ficoll),分离核),分离核酸时还常用酸时还常用CsCl作为作为介质。介质。凝胶过滤法 常用凝胶:交联葡聚糖、常用凝胶:交联葡聚糖、聚丙烯酰胺凝胶,琼脂糖聚丙烯酰胺凝胶,琼脂糖(seph
16、arose 或或 Bio-Gel A);); 凝胶网孔大小一定,只允许相应大小的分子进入凝凝胶网孔大小一定,只允许相应大小的分子进入凝胶颗粒内部,大分子则被排阻在外,即分胶颗粒内部,大分子则被排阻在外,即分级分离范级分离范围或排阻极限围或排阻极限; 大分子从颗粒间隙流下来,洗脱液体积小。小分子大分子从颗粒间隙流下来,洗脱液体积小。小分子在颗粒网状结构洗脱历程长,后洗脱下来,洗脱体在颗粒网状结构洗脱历程长,后洗脱下来,洗脱体积大;积大; 用洗脱体积同标准分子量的蛋白质的比例关系测定用洗脱体积同标准分子量的蛋白质的比例关系测定蛋白质分子量;蛋白质分子量;(二)利用溶解度差别的纯化方法(二)利用溶解
17、度差别的纯化方法影响蛋白质溶解度的外部因素很多,其中主要有:溶液的pH、离子强度、介电常数和温度。溶解度归根结底取决于他们本身的分子结构。1. 通过改变溶液pH值的等电点沉淀法2. 通过改变溶液离子强度的盐析、盐溶3. 有机溶剂的分级沉淀4. 通过改变温度的沉淀法在等电点pH条件下,蛋白质为电中性,其物理性质如导电性、溶解度、黏度、渗透压等都表现为最低值,易发生絮结沉淀。因此,等电点性质常被用于蛋白质的分离制备,被称为等电点沉淀技术。等电点沉淀盐溶与盐析 盐溶:一般在低盐浓度的情况下,蛋白质的溶解度随盐盐溶:一般在低盐浓度的情况下,蛋白质的溶解度随盐浓度的升高而增加,这种现象称为浓度的升高而增
18、加,这种现象称为盐溶盐溶; 盐析盐析: :当盐浓度升高到一定程度后,蛋白质的溶解度又随当盐浓度升高到一定程度后,蛋白质的溶解度又随着盐浓度的升高而降低,结果使蛋白质沉淀析出,这种着盐浓度的升高而降低,结果使蛋白质沉淀析出,这种现象称为现象称为盐析盐析; ; 同一浓度盐溶液中,不同蛋白质的溶解度不同,借此可同一浓度盐溶液中,不同蛋白质的溶解度不同,借此可达到彼此分离的目的。达到彼此分离的目的。 盐溶原理盐溶原理: :蛋白质吸附某种盐离子后彼此排斥。蛋白质吸附某种盐离子后彼此排斥。 盐析原理:盐浓度增高到一定数值后,水活性降低,水盐析原理:盐浓度增高到一定数值后,水活性降低,水化膜相继被破坏,最终
19、引起蛋白质分子间相互聚积并从化膜相继被破坏,最终引起蛋白质分子间相互聚积并从溶液中析出溶液中析出 温度对蛋白质溶解度的影响 0-40之间,大部分球状蛋白质的溶解度随温度的升高而增加。有机溶剂分级分离法 降低水溶液的介电常数,破坏大分子周围水膜,使溶质降低水溶液的介电常数,破坏大分子周围水膜,使溶质溶解度降低溶解度降低; 利用不同蛋白质在不同浓度的有机溶剂中的溶解度不同利用不同蛋白质在不同浓度的有机溶剂中的溶解度不同而使蛋白质分离的方法,有机溶剂沉淀法。经常使用的而使蛋白质分离的方法,有机溶剂沉淀法。经常使用的有机溶剂是乙醇和丙酮;有机溶剂是乙醇和丙酮; 易使蛋白质和酶变性,操作必须在易使蛋白质
20、和酶变性,操作必须在低温低温条件下进行。条件下进行。电泳 :在外电场的作用下,带电颗粒向着与其电性相反的电极移动,这种现象称为电泳。原则上按电泳的原理来分,可分为:(三)根据电荷不同的纯化方法 自由界面电泳 区带电泳 滤纸电泳和薄膜电泳(醋酸纤维素薄膜、聚酰胺薄膜) 粉末电泳(淀粉、纤维素粉、硅胶粉,粉末与适当溶剂调和,铺板) 细丝电泳,如尼龙丝和其它人造丝电泳,这是一类微量电泳 凝胶电泳,最常用的支持介质是聚丙烯酰胺凝胶和琼脂糖凝胶 聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)浓缩胶样品 分离胶 在PAGE中,除了一般的电荷效应外,还有凝胶对样品的分子筛效应和浓缩效应, 三种效应共同起作用, 使样品的分离
21、效果大大提高。Tris-Gly pH=8.3Tris-Gly pH=8.3Tris-HCl pH=6.8T=3%Tris-HCl pH=8.9T=7.5%SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳 ( SDS-PAGE)0.5 1.0kD33022067603618.5kD9467433020.114.4Mol masskD30020010080605040302010Migration (Rf)Pharmacia: Molecular Markers for electrophoresisA stable pH gradient is established in the gel after applica
22、tion of an electric field.Protein solution is added and electric field is reapplied.After staining, proteins are shown to be distributed along pH gradient according to their pI values.等电聚焦 (IEF)pH梯度制作:利用两性电解质梯度制作:利用两性电解质(商品名商品名: Ampholine),多氨基多羧,多氨基多羧酸系列两性化合物同系物的复杂混合物,它们有相近但不同的酸系列两性化合物同系物的复杂混合物,它们有相
23、近但不同的pH和和pI值,在电场作用下,自然形成值,在电场作用下,自然形成pH梯度梯度.电泳就是在凝胶中加入两性电解质从而构成从正极到负极pH逐渐增加的pH梯度,处在其中的蛋白分子在电场的作用下运动,最后各自停留在其等电点的位置上,测出蛋白分子聚焦位置的pH值,便可以得到它的等电点。First dimensionI s o e l e c t r i c focusingIsoelectric focusing gel is placed on SDSpolyacrylamide gel.Second dimensionSDS-polyacrylamidegel electrophoresis
24、双向电泳 (Two-dimensional electrophoresis) 此法是利用离子交换树脂作为柱层析支持物,将带有不同电荷的蛋白质进行分离的方法。 若选择阳离子交换树脂,则带正电荷的物质与H+发生交换而结合在树脂上。 若选择阴离子交换树脂,则带负电荷的物质可与OH-发生交换而结合在树脂上。 物质在树脂上结合的牢固程度即亲和力大小有差异,因此选用适当的洗脱液便可将混合物中的组分逐个洗脱下来,达到分离纯化的目的。离子交换层析阳离子交换剂:阳离子交换剂: CM-纤维素:纤维素:-O-CH2COOH P-纤维素:磷酸基纤维素:磷酸基阴离子交换剂:阴离子交换剂: DEAE-纤维素:二乙基氨基乙
25、基纤维素:二乙基氨基乙基 AE-纤维素:氨基乙基纤维素:氨基乙基亲和层析利用化学方法将可与待分离物质可逆性特异结合的化合物(称配体)连接到某种固相载体上,并将载有配体的固相载体装柱,当待提纯的生物大分子通过此层析柱时,此生物大分子便与载体上的配体特异的结合而留在柱上,其他物质则被冲洗出去。然后再用适当方法使这种生物大分子从配体上分离并洗脱下来,从而达到分离提纯的目的 。 抗原和抗体 激素和受体蛋白 凝集素和糖蛋白配体配体蛋白质蛋白质蛋白质和配蛋白质和配体复合物体复合物交联试剂交联试剂载体载体配体配体载体与配体载体与配体交联体交联体杂质杂质杂质杂质游离配体游离配体六、蛋白质的含量测定与纯度 测定
26、蛋白质的量是研究蛋白质的最基本的一步。 溶液中蛋白质的浓度测定方法很多,最早的经典方法是凯氏定氮法,稍后应用较广泛的方法是双缩脲法、福林酚法和紫外吸收法,近年来大多数人用考马斯亮蓝法。(一)蛋白质的含量测定1. 双缩脲法 双缩脲法是基于蛋白质分子中的肽键,凡具两个以上肽键的物质均会发生双缩脲反应。 在碱性溶液中蛋白质可以与Gu2形成紫红色络合物,其颜色的深浅与蛋白质的浓度成正比,而与蛋白质的分子量和氨基酸组成无关。2. 福林酚法 福林酚法主要基于蛋白质在碱性溶液中能与铜形成复合物,此复合物以及芳香族氛基酸残基可以还原酚试剂而产生蓝色,再与标准蛋白质(通常采用牛血清白蛋内)比色定量。 福林酚试剂法灵敏度高,但是如果样品和标准蛋白质的芳香族氨基酸差异较大时,会有较大的系统误差。3. 紫外吸收法 蛋白质组成中常含有酪氨酸等芳香族氨基酸,在紫外光280nm波长处有最大吸收峰,故可用280nm波长的光吸收即光密度的大小来测定一般蛋白质的含量。4.考马氏亮蓝法 考马斯亮蓝G-250是一种染料,在游离状态下呈红色,与蛋白质结合则呈现蓝色。在一定范围内,溶液在595nm波长下的吸光度与蛋白质含量成正比,可用比色法测定。 本法试剂配制简单,操作简便,是一种常见的蛋白质快速微量测定方法。(二)蛋白质纯度鉴定(二)蛋白质纯度鉴定 常用电泳法(IEE、PAGE和SDS-PAGE)、HPLC法、免疫学方
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