环孢素A治疗前后慢性再生障碍性贫血患者骨髓吲哚胺双加氧酶水平变化

1、环孢素A治疗前后慢性再生障碍性贫血患者骨髓吲哚胺2，3双加氧酶水平变化陈玮 刘宵虹 张伟华 张秀莲 范星火 侯素敏 刘晨（山西医科大学第一医院血液科）【摘 要】目的检测环孢素A治疗前后慢性再生障碍性贫血（AA）患者骨髓单个核细胞中吲哚胺2，3双加氧酶（IDO）的表达情况，探讨IDO在慢性AA发病机制中的作用。方法用反转录-聚合酶链反应（RT-PCR）检测9例初治及环孢素A治疗3个月后慢性AA患者骨髓单个核细胞中IDO mRNA的表达水平，并分析其与中性粒细胞绝对值、网织红细胞相对值、血小板计数及血红蛋白含量相关性。数据分析采用t检验和直线相关分析。结果初治慢性AA患者骨髓单个核细胞中IDO m

2、RNA表达强度为（0.42±0.10），明显高于对照组（0.19±0.14），P<0.01。环孢素A治疗3个月后慢性AA患者骨髓单个核细胞中IDO mRNA表达强度为（0.19±0.12），明显低于治疗前（0.42±0.10），P<0.01。IDO与中性粒细胞绝对值、网织红细胞相对值、血小板计数及与血红蛋白含量的r值分别为0.459、-0.056、-0.482、0.006（P均0.05），均无明显线性相关关系。结论在慢性AA患者骨髓单个核细胞中，IDO表达增加，促进色氨酸向犬尿氨酸转化，而色氨酸的耗竭及其代谢产物犬尿氨酸可抑制T淋巴细胞的增殖

3、、诱导T淋巴细胞的凋亡，提示IDO在慢性AA的发病机制中可能起保护作用。【关键词】贫血，再生障碍性；双加氧酶类；环孢菌素；基因表达Expression and significance of IDO in chronic alplastic anemia patients treating by ciclosporin A CHEN Wei, LIU Xiao-hong, ZHANG Wei-hua, ZHANG Xiu-lian, FAN Xing-huo, HOU Su-min, LIU Chen. Department of Hematology, First Hospital of S

4、hanxi Medical University,Taiyuan 030001,China【Abstract】Objective To explore the significance of indoleamine 2,3-dioxygenase(IDO)in patients with chronic aplastic anemia(AA)and the role of IDO in the pathogenesis of chronic AA,we examined IDO mRNA expression in bone marrow mononucleated cells in chro

5、nic AA patients and evaluated the relationships between IDO mRNA and hemocytogenesis. Methods Heparinized bone marrow samples were obtained from 9 patients with chronic AA without any treatment and after three month treatment by ciclosporin A,the IDO mRNA of bone marrow mononucleated cells in chroni

6、c AA was measured by reverse transcriptase PCR.Comparisons between groups were performed with t-test and linear correlation analysis.Results Expression of IDO mRNA was higher in chronic AA than in healthy controls(0.42±0.10) vs(0.19±0.14),P<0.01.The IDO mRNA levels from patients after t

7、hree months immunosuppressive treatment were significantly decreased compared with the pretherapeutic patients(0.19±0.12)vs(0.42±0.10),P<0.01.Expression of IDO had no relationship with hemoglobin,platelet, reticulocyte and absolute neutrophil count in patients with chronic AA. Conclusio

8、n This suggests that the increased IDO may be a protective factor in patients with chronic AA.【Key words】Anemia,aplastic；Dioxygenases；Cyclosporine；Gene expression免疫异常在再生障碍性贫血（AA）的发生发展中发挥着极其重要的作用。研究发现，干扰素（IFN）-在激活吲哚胺2，3双加氧酶（IDO）的表达中发挥重要作用，IFN-能够强烈持续诱导IDO表达。IDO表达增强后，消耗局部的色氨酸及产生犬尿氨酸等代谢产物，而色氨酸的耗竭及其代谢产物犬

9、尿氨酸可抑制T淋巴细胞的增殖、诱导T淋巴细胞的凋亡，从而参与介导局部的免疫抑制1。本实验拟通过研究初治慢性AA患者治疗前及免疫抑制剂环孢素A治疗3个月后骨髓单个核细胞IDO的表达水平以及IDO mRNA表达水平与中性粒细胞绝对值（ANC）、网织红细胞相对值、血小板计数以及血红蛋白含量的关系，了解IDO mRNA在慢性AA患者中的表达水平及与病情的相关性，从而对慢性AA的发病机制及治疗方法进行探讨。1 资料和方法1.1 病例选择2007年10月至2009年1月，9例慢性AA患者均符合全国AA的诊断标准2。其中女性3例，男性6例，年龄1768岁，中位年龄41岁，均为初治患者。治疗方法：环孢素A 3

10、5 mg·kg-1·d-1治疗3个月。对照组取自9例非血液系统疾病及非免疫系统疾病且骨髓象正常者，男性5例，女性4例，年龄1964岁，中位年龄37岁。所有受试者检测时均无感染和其他自身免疫性疾病，均未使用免疫调节剂。1.2 主要试剂人淋巴细胞分离液（购于天津灏洋生物有限公司）；总RNA提取试剂盒由上海生工生物工程技术服务有限公司提供；目的基因IDO引物由北京诺赛有限公司合成；反转录聚合酶链反应（RT-PCR）试剂盒购自Fermentas公司。1.3 实验方法 骨髓单个核细胞的分离与总RNA的提取：收集对照组、初治及环孢素A治疗3个月后慢性AA患者乙二胺四乙酸（EDTA）抗凝

11、骨髓液各6 ml，用密度梯度离心法分离单个核细胞，按SK21352试剂盒操作说明提取骨髓单个核细胞总RNA。 RT-PCR检测：IDO上游引物序列为：（595-614）5-GCGCTGTTGGAAATAGCTTC-3，下游序列为（770-752）5-TTTGGGTCTTCCCAGAACC-3，可扩增长度为175 bp；GAPDH上游引物5-TGAACGGGAAGCTCACTGG-3，下游引物为5-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3，可扩增长度为307bp，（均由北京诺赛有限公司合成）。将引物反转录合成cDNA，加入5l模板cDNA于20l PCR反应体系中，按36个反应循环数进行扩增

12、，扩增条件为：94预变性2 min，94变性20 s，56退火30 s，72延伸30 s，循环35次，最后72延伸5 min。扩增产物用含0.5 ng/L溴化乙啶的1.5 g/L琼脂糖凝胶电泳显示，以DNA相对分子质量标志物为标准，电泳完毕后在紫外灯下观察条带并照相。扩增产物电泳分离后，用凝胶成像分析系统扫描，每个标本IDO特异性条带的吸光度（A）值与相应的3-磷酸甘油醛脱氢酶（GAPDH）条带的A值进行比较，半定量分析mRNA表达水平。1.4 统计学方法采用SPSS 11.5软件进行t检验，用简单直线相关分析探讨IDO与造血功能之间相关关系的方向和程度。P<0.05为差异有统计学意义。

13、2 结果2.1 治疗前慢性AA患者骨髓单个核细胞IDOmRNA表达水平：用RT-PCR方法检测慢性AA患者组和对照组骨髓单个核细胞IDO mRNA表达水平。结果显示：慢性AA患者组骨髓单个核细胞均有IDO mRNA表达，表达强度为（0.42±0.10）；对照组骨髓单个核细胞IDO mRNA有7例表达，2例不表达，表达强度为（0.19±0.14），慢性AA患者组明显高于对照组（P<0.01），见图1。 M 1 2 3 4 5 6 200 bp- IDO（175 bp）300 bp- GAPDH（307 bp） M：marker；1：对照组内参；2：治疗前慢性AA患者内参

14、；3：环孢素A治疗3个月后慢性AA患者内参；4：对照组；5：治疗前慢性AA患者组；6：环孢素A治疗3个月后慢性AA患者组图1骨髓单个核细胞IDO mRNA表达2.2 环孢素A治疗3个月后慢性AA患者IDO mRNA的表达水平：用RT-PCR方法检测慢性AA患者治疗前和环孢素A治疗3个月后骨髓单个核细胞IDO mRNA表达水平。结果显示：慢性AA患者治疗前骨髓单个核细胞均有IDO mRNA表达，表达强度为（0.42±0.10）；环孢素A治疗3个月后骨髓单个核细胞IDO mRNA有7例表达，2例不表达，表达强度为（0.19±0.12），免疫抑制剂环孢素A治疗3个月后慢性AA患者

15、IDO mRNA明显低于治疗前（P<0.01），见图1。2.3 慢性AA患者骨髓单个核细胞IDO mRNA表达水平与造血功能的关系：慢性AA患者骨髓单个核细胞IDO mRNA表达水平与ANC无明显的线性相关（r=0.459，P0.05）。慢性AA患者骨髓单个核细胞IDO mRNA表达水平与网织红细胞相对值无明显的线性相关（r=-0.056，P0.05）。慢性AA患者骨髓单个核细胞IDO mRNA表达水平与血小板计数无明显的线性相关关系（r=-0.482，P0.05）。慢性AA患者骨髓单个核细胞IDO mRNA表达水平与血红蛋白无明显的线性相关关系（r=0.006，P0.05）。表明在慢性

16、AA患者骨髓单个核细胞中IDO的高表达与骨髓造血功能无明显的相关性。3 讨论AA患者Th1淋巴细胞的过度分化和Th1型细胞因子如白细胞介素（IL）-2、IFN-等的过度分泌，导致造血干祖细胞过度凋亡。已有研究发现，IFN-是激活IDO的一个强诱导剂3。IDO是1963年首次在兔的肠道组织中发现的，在人和动物的许多组织和细胞中可以表达，特别是在抗原提呈细胞(APC)和胎盘组织。人类IDO的相对分子质量约42 000，由403个氨基酸残基组成，基因位点位于第8号染色体上，长约15 000 bp，包括10个外显子和9个内含子,为单拷贝基因,启动子端含有多个重复序列元件。在健康人，IDO的表达水平低，

17、但在感染、炎症和细胞因子的作用下可以显著增加表达。有IDO表达潜能的未成熟树突状细胞（DCs）在脂多糖（LPS）、细胞因子等刺激下也可以表达IDO。IDO催化哺乳动物肝外组织中的必需氨基酸L-色氨酸生成犬尿氨酸，是色氨酸代谢的限速酶。而色氨酸是哺乳动物体内最重要的氨基酸之一，是细胞维持活化和增殖所必需的氨基酸，同时也是构成蛋白质不可缺少的重要成分。色氨酸的缺乏可使细胞功能受限，被认为是唯一与自身免疫系统紊乱有关的氨基酸，与一些自身免疫性疾病的发病相关联4。IDO调控色氨酸的作用机制是使色氨酸分子中吲哚环氧化裂解，从而沿犬尿酸途径分解代谢，可以将色氨酸分解为L-犬尿氨酸、吡啶甲酸和喹啉酸等多种代

18、谢产物。IDO是一个非常重要的酶，它不仅可以抑制母体T淋巴细胞的反应，从而保护同种异基因的孕体对抗母体的排斥反应，而且还可以诱导T淋巴细胞产生免疫耐受5。研究表明，胎儿免遭母体T淋巴细胞攻击主要是由于胎盘细胞绒毛中IFN-作用后的树突状细胞（DCs）能够合成IDO，而IDO通过降解母胎界面的色氨酸从而抑制T淋巴细胞的增殖6。IDO通过降解局部组织中的色氨酸，而色氨酸的耗竭及其代谢产物犬尿氨酸可抑制T淋巴细胞的增殖、诱导T淋巴细胞的凋亡，这在免疫耐受中发挥着重要的作用7。近年来有研究表明色氨酸经IDO催化的代谢产物对T淋巴细胞有直接的溶解作用8。其色氨酸的消耗可以间接抑制T淋巴细胞的增殖，使T淋

19、巴细胞活化信号转导受阻，从而诱导一种局部的免疫耐受状态。这些研究均可提示IDO调控色氨酸代谢途径可能在诱导免疫耐受中起到关键作用。在AA的发病过程中有免疫激活的过程，同时也伴有免疫耐受被打破的过程，表现出自身免疫性疾病的免疫反应特征。因此，在AA的治疗过程中诱导免疫耐受起到重要的作用。目前，慢性AA的治疗主要是免疫抑制剂。如果能诱导慢性AA患者骨髓造血组织对机体产生免疫耐受，这样就可以减少骨髓造血组织的破坏，从而为慢性AA提供新的治疗途径。本实验用RT-PCR检测了环孢素A治疗前后慢性AA患者骨髓单个核细胞IDO mRNA的表达水平，并对IDO与造血功能做了简单直线线性相关性分析。结果显示环孢

20、素A治疗前慢性AA患者骨髓单个核细胞IDO mRNA的表达强度明显高于健康对照组；给予环孢素A规律治疗3个月后，慢性AA患者IDO mRNA的表达强度较治疗前明显下降；相关性分析证实IDO与造血功能无明显的线性相关性。因此通过本实验我们可以推测：IDO mRNA表达水平的增加在慢性AA的发病中可能起到保护作用，IDO或者IDO激活剂有可能用于治疗慢性AA，为慢性AA的治疗提供新的治疗方法。参考文献1 Munn DH，Mellor AL.Indoleamine 2，3-dioxygenase and tumorinduced tolerance.J Clin Invest，2007，117（5）

21、：1147-1154.2张之南，沈悌.血液病诊断与治疗标准.3版.北京：科学出版社，2007.3 Jung ID，Lee CM，Jeong YI，et al.Differential regulation of indoleamine 2，3-dioxygenase by lipopolysaccharide and interferon gamma in murine bone marrow derived dendritic cells.FEBS Lett，2007，581（7）：1449-1456.4 Le AV，Broide DH.Indoleamine-2，3-dioxygenase modulation of