环境中大肠杆菌快速生物检测技术研究进展概要

1、3收稿日期:2005210217作者简介:王娜, 硕士研究生, 从事环境污染物的免疫检测技术研究; 施汉昌, 教授, 从事水污染控制技术与原理研究。基金项目:国家高技术发展计划(863 项目(2002AA649160文章编号:100926094(2006 0320127205环境中大肠杆菌快速生物检测技术研究进展3王娜, 何苗, 施汉昌(清华大学环境科学与工程系, 环境模拟与污染控制国家重点联合实验室, 北京100084摘要:大肠杆菌作为水质卫生学指标, 在环境水质监测中起着非常重要的指示作用。近年来为了克服大肠杆菌常规监测方法的不足, 基外的研究热点。, 有良好的应用前景, 大肠杆菌的快速检

2、测技术应向操作简单、快速、高灵敏度以及低成本方向发展。关键词:环境工程; 大肠杆菌; 生物技术; 快速检测中图分类号:X 83012文献标识码:A0引言大肠杆菌是环境水质监测和食品安全中重要的指示微生物。目前, 世界各国及国际组织都将大肠菌群数作为重要环境卫生学指标, 并对其提出了严格的限制。世界卫生组织饮用水水质标准(第二版 中规定, 所有用于饮用的水中大肠杆菌或耐热大肠菌在任意100m L 水样中不得检出; 现行美国饮用水水质标准国家一级饮用水标准规定总大肠杆菌(包括粪型及艾氏大肠菌 为0mg/L ; 中华人民共和国国家标准生活饮用水水质卫生规范规定, 总大肠菌群及粪大肠菌群每100m L

3、 水样中不得检出。目前, 国际上公认的大肠菌群标准检测方法以多管发酵法和滤膜法为主。我国在水和食品卫生检验标准中规定的大肠菌群数的检测也是多管发酵法与滤膜法。但是其检测周期长, 操作繁琐, 难以适应污染源快速诊断的需要。近年来, 世界各国针对水环境和食品中大肠杆菌的快速检测展开了大量研究工作, 部分技术被成功应用。本文综述了大肠杆菌快速生物检测技术的研究进展, 并对其发展前景进行了评估。1基于分子生物学技术的大肠杆菌快速检测111DNA 探针技术DNA 探针技术是用特异性的DNA 探针进行大肠杆菌核糖体RNA (rRNA 的检测。目前DNA 探针技术的研究主要是用来检测和鉴定医学临床上和食品中

4、的大肠杆菌。检测各种大肠杆菌的核酸探针有多种, 其中检测致病性大肠杆菌的报道最多, 所利用的靶基因多为产毒素的基因, 如VT 、eaeA 等, 多采用生物素、荧光素等非放射性物质进行标记。荧光探针、寡核苷酸探针等已被用于检测水中的大肠杆菌, 取得了很好的结果。其检测精度高, 检测时间较短。为了更灵敏更快速地检测大肠杆菌,DNA 探针技术多与PCR 技术结合来检测大肠杆菌1-3。美国的G ene T rak 公司(G ene T rak Inc. ,US A 已开发出检测大肠杆菌的商品化DNA 探针系统。以聚合酶链反应扩增大肠杆菌的目标DNA , 再用探针杂交检测, 不需要进行1内完成检测操作,

5、 检测灵敏m L , 故所有阳性结果必须用。112聚合酶链反应技术聚合酶链反应(PCR 技术是1983年由Millus 和Cetus 发明的DNA 快速扩增技术。PCR 方法已在致病性大肠杆菌的检测中有了比较深入而广泛的研究, 取得了较好的应用成果。PCR 技术具有多种不同种类, 如实时定量PCR 、多重PCR 、E LIS A PCR 等。目前, 针对于大肠杆菌的PCR 技术多种多样, 其中以实时定量PCR 和多重PCR 来检测大肠杆菌的研究最多, 发展最快。到目前为止, 基于大肠杆菌PCR 技术的研究主要是针对致病性大肠杆菌的致病基因, 特别是肠出血性大肠杆菌O157。例如, Fitzma

6、urice 等5利用实时定量PCR 技术和逆转录PCR 技术来定量检测大肠杆菌O157:H7的VT 1和VT 2毒素基因; Atlas 等6针对环境中大肠杆菌, 使用lam B 作为目标基因能够检测到15个目标基因/m L ;Fricker 等7建立了基于PCR 的大肠杆菌检测方法, 可以在24h 内完成对99种不同的环境水样检测, 取得了与标准方法100%吻合的检测结果。该方法已列为英国泰晤士河的例行检测项目。马颖等8已将PCR 技术应用于检测饮用水中大肠杆菌。研究证明, 该法较适用于检测经氯消毒或臭氧消毒的饮用水中的大肠杆菌, 检测结果与常规滤膜法有较好的一致性, 且分析时间短, 反应灵敏

7、。在检测大肠杆菌方面的研究中, 各个机构都在尝试应用各种不同类型的PCR 技术来达到更好的检测效果; 但是其假阳性问题、污染问题, 操作相对复杂及仪器昂贵一直都是研究者们面临的难题。由于大肠杆菌的种类多, 针对所有大肠杆菌的共同基因片断难以确认, 目前研究和应用主要是针对特定类型的大肠杆菌基因检测。113基因芯片技术基因芯片(G ene chip , 又称DNA 芯片。基因芯片技术是高效大规模获取相关生物信息的重要手段, 相关研究主要集中于致病性大肠杆菌方面。美国食品与药物管理局(F ood andDrug Administration , FDA 的Chizhikov 9将包括O157:H7

8、的大肠杆菌的6个编码细菌抗原和毒力的特异基因探针点样在玻片上, 与多重PCR 扩增产物进行杂交, 同时检测和鉴别与食物中毒相关的肠道病原体。该芯片可检测15种沙门氏菌、志贺氏菌和大肠杆菌的毒力因子。RUAN 等10基于电化学阻抗721第6卷第3期2006年6月安全与环境学报Journal of Safety and Environment V ol. 6N o. 3Jun , 2006光谱开发了用于检测大肠杆菌O157:H7的芯片, 并将其用于免疫生物传感器, 检测限可以达到6×103CFU/m L 。目前日本已经开发出商品化的大肠杆菌检测芯片IntelliG eneT M 和G e

9、neChip E. coli G enome , 但是这种芯片仅限于研究使用。基因芯片技术的发展, 为鉴别诊断大量肠道病原菌及同时检测多个标本提供了可能, 减少了工作量, 缩短了诊断时间。该技术有利于建立快速灵敏的细菌病原体鉴别诊断的自动分析系统, 有广阔的应用前景。目前关于检测大肠杆菌的基因芯片主要用于医学领域, 集中在致病性大肠杆菌O157:H7等的检测, 在环境领域中研究应用的较少。2, , 定量测定的快速检测技术。根据标记物质的不同, 目前用于检测大肠杆菌的免疫检测方法主要有以下几种。211酶免疫分析技术酶免疫分析(Enzyme immunoassay ,EI A 在环境领域中应用较为

10、广泛, 其中, 酶联免疫吸附分析法(Enzyme 2linked im 2munos orbent assay ,E LIS A 是最常用的测定方法。该方法操作简单, 特异性强, 迅速灵敏, 在大肠杆菌的快速检测中应用较多。Vandekerchove 等11运用多克隆抗体E LIS A 方法检测致病性大肠杆菌(EPEC 。在单个检测水平上(individual level , 该法试验得到的敏感度及特异性分别为8010%和9814%; 在多个检测水平上(rabbit flock level 则为7912%和8512%。Pad 2hye12采用单克隆抗体E LIS A 检测大肠杆菌O157:H7

11、。Park等13采用多克隆抗体的E LIS A 试剂盒来检测粪便中的大肠杆菌O157, 并与传统的麦康凯培养基法进行对比。试剂盒的灵敏度及特异性分别为9112%和9915%, 传统法的灵敏度及特异性分别为8214%和100%。Ramadan 等14利用E LIS A 检测方法在2h 内检测到大肠杆菌O157(10108CFU/m L 。姚斐等15利用间接酶联免疫吸附方法检测活的非可培养状态的大肠杆菌O157:H7, 最小检测浓度为105CFU/m L 。孙克江16等应用酶联免疫吸附试验检测O157:H7, 并与常规培养法进行比较, 得到的结果检出率较高, 敏感性较强。E LIS A 检测方法操

12、作简单, 灵敏度高, 但是对于检测所有血清型的大肠杆菌需要广谱抗体(Broad spectrum antibody , 商品化的试剂盒可靠性需进一步检验, 标准尚不统一, 因此其商品化受到了很大的限制。在美国, 应用快速酶法检测总大肠杆菌的试剂盒已经投入市场使用。美国食品与药物管理局已认可使用商品化的出血性大肠杆菌O157:H7的试剂盒。我国仅中国兽药监察所17针对大肠埃希氏菌K 88, K 99,987P 抗原开发了E LIS A 试剂盒, 用于控制幼畜大肠杆菌病。可见, 目前国内外的研究多基于O157:H7的研究, 而针对于总大肠杆菌开发的检测技术的研究很少, 环境领域中还没有可应用的大肠

13、杆菌检测试剂盒。212荧光免疫测定技术荧光免疫测定(Fluorescent immunoassay , FI A 是以荧光素作为标记物, 将免疫反应的特异性与灵敏性结合, 通过荧光分光光度计测量荧光强度, 推算待测物质的浓度。这种技术已被广泛应用。针对其容易被高背景干扰的缺点, 时间分辨荧光免疫分析(TRFI A 技术得到了快速发展。Y u 等18利用该O157:H7, 可在6h 内检测出大肠杆菌:H7(105L 。该法超过了放射性同位, , 储存时检测重复性好, 操作流程短, 标准曲线范, 应用范围广泛等优点, 是一种新型的免疫标记分析手段, 具有广泛的发展空间。213化学发光免疫分析技术化

14、学发光免疫分析(Chemiluminescence immunoassay ,C LI A 利用化学发光物质作为标记物, 将具有高灵敏度的化学发光测定技术与高特异性的免疫反应相结合进行检测。K ovacs 等19利用化学发光免疫分析法对牛肉中的大肠杆菌O157进行了测定, 敏感度达到103104CFU/m L 。T agi 等20利用化学发光免疫分析技术测定食品和水样中大肠菌群, 可以在9h 内检测到大肠杆菌(1CFU/m L 。化学发光免疫分析技术目前在环境领域中应用不多。214免疫胶体金标记技术免疫胶体金标记技术(Immunocolloidal 2g old technique ,ICG

15、T 是以胶体金作为示踪标志物, 应用于抗原抗体的一种新型免疫标记技术。该方法是中华人民共和国卫生部颁布的“关于全国肠出血性大肠杆菌O157:H7感染性腹泻应急处理预案”中的指定方法。该法具有快速反应的特点, 但只能作为大肠杆菌的定性或半定量检测, 较适用于一些致病性大肠杆菌的检测。215免疫磁珠技术免疫磁珠技术(Immunomagnetic bead , I M B 应用磁珠作为抗体载体, 通过抗体抗原结合在磁力作用下发生力学移动, 而达到分离特异性抗原的目的。Martina 等21应用此法从病人及与此相关的奶牛场奶牛的粪便中分离出多株山梨醇阳性的O157:H7大肠杆菌。Y u 22,23利用

16、免疫磁珠技术结合荧光免疫法研究环境水样中的细菌和有毒物质的快速检测, 还对该法和电化学发光技术进行了比较, 结果表明该法虽然敏感度不如后者, 但是却更直接更方便。3仪器化的大肠杆菌检测311免疫传感器免疫传感器是以抗原或抗体作为生物分子识别元件来检测环境中的污染物。用于检测环境中大肠杆菌的免疫传感器种类很多, 主要包括压电晶体免疫传感器、表面声波免疫传感器(Surface acoustic wave (S AW immunosens or 、表面等离子体共振免疫传感器(Surface plasm onres onance (SPR immunosen 2821V ol. 6N o. 3安全与环

17、境学报第6卷第3期s or 、电流免疫传感器(Amperometric immunosens or 和光学免疫传感器等。1 压电晶体免疫传感器压电晶体免疫传感器是利用压电晶体振荡频率对表面质量负载的高度敏感性与免疫反应的高度特异性相结合发展起来的一种新型生物传感器, 它具有灵敏度高, 特异性好, 操作简单, 不需要任何标记, 检测速度快, 成本低廉等优点。Plomer 等24研究了一种可以检测饮用水中常见肠道细菌(如大肠杆菌、志贺氏菌、沙门氏菌等 的压电石英晶体免疫传感器。他们找到肠道革兰氏阴性细菌的共同抗原并制备单克隆抗体, 将其用SPA 固定在10MH z 的石英晶体电极表面肠杆菌为例,

18、细胞浓度在106109器都能较为准确检测:H7, 在3050min 内可检测到103108CFU/m L 。朱文杰等26以串联式压电传感器为基础构建了一台自动化微生物检测仪, 对大肠杆菌进行了检测。结果表明该方法准确度与常规的计数方法相当(r 0198 , 但是更为灵敏快速。2 表面声波免疫传感器表面声波免疫传感器与压电晶体免疫传感器类似, 是通过发生在晶体表面的免疫反应改变晶体表面的负重, 从而引起声波频率的改变来测定样品中的待测抗原。H owe 等27采用表面声波免疫传感器对大肠杆菌进行了检测, 检测限可以达到106CFU/m L , 检测时间为3h 。Deobagkar 等28报道了利用

19、声波免疫传感器检测水体中大肠杆菌的方法, 能够检测到400105CFU/m L 大肠杆菌。3 表面等离子体共振免疫传感器表面等离子体共振免疫传感器是基于物理光学现象研制的, 在分子相互作用、临床诊断、食物检测及环境检测等方面研究较多。Meeusen 等29利用该SPR 免疫传感器来检测食品中大肠杆菌O157:H7, 可以在35min 内检测到大肠杆菌O157:H7, 检测限为107CFU/m L 。G e Jing 等30使用集成化手持式S preeta T MSPR 传感器快速检测大肠杆菌O157:H7, 检测限为105CFU/m L 。SPR 免疫传感器在国际上逐渐成为热点, 但是我国研究

20、较晚, 正处于发展阶段。4 电流免疫传感器电流免疫传感器是应用最广泛的免疫传感器之一, 它是基于在恒电位下电极表面发生氧化还原反应引起电流的变化来测定溶液中相应的待测物质的浓度。T ahir 等31采用该技术检测大肠杆菌O157:H7, 可以在10min 内完成分析, 检测精度可达10CFU/m L 。Ercole 等32利用大肠杆菌的DH5a 链的多克隆抗体开发了用于检测水中大肠杆菌的完全电位交互生物传感器(PAB , 检测时间为115h , 检测限可达到10CFU/m L 。Carnes 等33使用一种新型的免疫传感器来检测大肠杆菌。这种传感器中设置了免疫过滤膜, 整个方法只需要17min

21、 , 最低检测限为501000CFU/m L 。Alocilja 等34开发了用于检测食品中大肠杆菌O157:H7的基于电化学夹心免疫法的传感器, 可在10min 中检测到大肠杆菌O157:H7, 检测限为718CFU/m L 。以上电化学免疫传感器检测精度高, 快速简便, 可检测痕量污染物, 朝着精度更高, 时间更短的方向发展, 但其稳定性及可信度需要提高。总而言之, 电化学免疫传感器具有较大的发展空间, 相信能够更好地应用在环境领域中并实现商品化。5 光学免疫传感器。Fer 2O157:H7的逝10倍。Erwin 等36研O157:H7的化学发光多通道免疫传感器, 检测限为105CFU/m

22、 L , 检测时间24min 。随着免疫传感器的分析模式和传感技术的提高, 该技术朝着微型化, 更为灵敏的方向发展37。312自动化仪器最初的自动免疫测定分析仪(Automated immunoassay ana 2lyzer ,AI A 诞生于20世纪70年代。当时自动化主要体现在吸样(包括样本和试剂 的自动化, 以减少人为误差。20世纪8090年代出现了所谓“walk away ”式自动化系统。操作者把样本放至仪器后, 仅需较少甚至无需操作干预, 该系统便可自动进行检测。近年来, 各种基于不同原理的全自动免疫测定分析仪在临床实验室中应用越来越多, 不但减轻了实验室人员的劳动强度, 而且大大

23、提高了测定的准确性和重复性。2005年,AOAC (Ass ociation of Analytical C ommunities 将自动酶标免疫测试系统(VI DAS 作为检测牛肉中大肠杆菌O157的工具, 分别建立了在8h 和24h 内检测出大肠杆菌O157的两种方法。傅晓琴38和陈纯39利用VI DAS 对大肠杆菌O157:H7建立了快速的检测方法, 证明该方法具有特异性好, 敏感性高, 快速简便的特点。这种自动酶标免疫测试系统目前在国内外成为应用热点, 是酶免疫自动化系统中应用最为广泛的一种。但是由于与其配套的进口试剂昂贵, 限制了其在基层实验室的应用。为了提高分析速度和自动化程度,

24、近年来出现了流动注射免疫分析法(FII A 。该法是利用在非平衡态测定, 使反应时间缩短, 更利于快速测定和自动化。FII A 具有一些突出的优点:用计算机控制缓冲液的流速、自动进样、检测器的检测及数据处理等。加拿大已经开发了一个检测大肠杆菌的流动注射免疫分析系统40。Ihab 等41,42也开发了针对大肠杆菌的流动注射电流型免疫系统, 用来检测大肠杆菌O157:H7。此系统内含电流传感器, 直接检测大肠杆菌O157:H7, 因无需预增菌过程, 检测在30min 内完成, 检测区间在100600CFU/m L , 检测限达到100CFU/m L 。313联用分析方法将多种方法相结合从而实现自动

25、化操作和精确控制, 可以大幅度地提高灵敏度。目前各种联用分析方法层出不穷。9212006年6月王娜, 等:环境中大肠杆菌快速生物检测技术研究进展Jun , 2006随着各学科和技术之间的相互渗透, 色谱和流动注射法等技术与免疫分析(I A 相结合可以弥补免疫分析技术上的一些局限性, 从而使之具有更好的选择性、灵敏性和快速测定等优点。但德忠等43将荧光免疫分析技术、光纤传感技术、流动注射技术和免疫磁珠分离技术联用, 建立了一种新型荧光光纤免疫磁珠流动分析系统, 并采用荧光素异硫氰酸酯(FIT C 对系统性能进行考察。结果表明, 该分析系统设计合理, 性能可靠, 在临床、环保等领域有广泛的应用前景

26、。目前各种联用技术的不断出现大大促进了国内外检测技术的灵敏度和精确度, 为检测技术的进一步发展提供了更为广阔的发展空间。4结论综合上述分析, 前景。其中免疫分析法以其快速和可批量检测等优点, 基于目前广泛研究的基础, 在大肠杆菌的快速大规模筛查中具有明显的应用优势; 基于DNA 识别的分子生物学检测技术可针对特定强致病性大肠杆菌实现快速检测, 也是目前各国研究机构的研究热点。但总体来说, 他们仍然处于研究开发阶段, 大规模的应用尚需在检测精度的提高、稳定性的保持、操作的简便和经济性等方面加强和提高。R eferences(参考文献 :1E DITH F , URS U LA O. Applic

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