生化反应曲线

1、 1 生化生化反应曲线反应曲线 2生化分析基本原理生化分析基本原理 生化反应曲线生化反应曲线内容概况内容概况 3罗氏生化分析系统产品线罗氏生化分析系统产品线Cobas 6000 (c501) 600T/HModular D 2400T/HModular P 800T/HCobas c311300T/HCobas c111180T/HCobas 8000 2000T/H 4cobascobas 8000 8000 模块化组合分析系统模块化组合分析系统 智能、高效、智能、高效、强劲强劲 5物质对光吸收的基本定律物质对光吸收的基本定律 Lambert- Beer定律 LambertBeer定律表达为

2、: 当一束平行的单色光通过含有均匀吸光物质的溶液时,溶液的吸光度(A)与溶液的浓度(C)和光透过液层厚度(L)的乘积成正比。物质对光吸收的吸光系数（e）为常数。 其数学表达式：A = e*C*L I入射光透射光I0= = =-光吸收的基本定律光吸收的基本定律= =light detector 6根据根据Lambert- BeerLambert- Beer定律来计算待测物浓度定律来计算待测物浓度如若吸光系数 ( )未知，我们就需要采用定标曲线 来计算待测物的浓度。 浓度 (amount of substance)吸光度 (amount of color)40123456706050302010C

3、alibrator/standard 标准品 (cfas)待测样本Concx =Concx = Abs Absx x x x ConcsConcs AbssAbssConcxConcx = 待测样本浓度ConcConcs s = 标准品浓度 AbsxAbsx = 样本吸光度AbssAbss = 标准品吸光度此值为定值 7 Lambert-Beer 定律 适合于任何均匀非散射的介质 生化比色分析特定蛋白透射比浊分析Lambert-Beer 定律分光光度法定量分析的依据分光光度法定量分析的依据 8Roche Hitachi PhotometerRoche Hitachi Photometer 9

4、当相应的比色杯每一次通过光路系统时，光路系统会测量并记录下相应的吸光度 光路系统可以测量后分光后12个波长的相应吸光度。12 有效波长: 340, 376, 415, 450, 480, 505, 546, 570, 600, 660, 700, 800nm 多数检测项目都使用双波长检测方法。（可去除干扰物对检测结果的影响）Reaction sequenceReaction sequence 10 11 12仪器读数的原理不同仪器每个循环周期的时间间隔Modular P 1818秒秒Cobas c702 1616秒秒Cobas C501 8 8秒秒Modular D 1212秒秒C311 12

5、 12秒秒反应转盘不停的周期旋转当相应的比色杯通过光路系统时，光路系统会测量并记录下相应的吸光度在不同的时间点加入相应的反应试剂 13Reaction sequenceReaction sequence 14Instrument cycleInstrument cycle 15Endpoint and rate (kinetic) assaysEndpoint and rate (kinetic) assays自动生化分析常用的方法有自动生化分析常用的方法有: : 终点法（终点法（End Point AssaysEnd Point Assays）：一般在整个反应完成后再来检测吸光度 速率法（速

6、率法（Rate assaysRate assays） ：一般在反应的过程中监测吸光度的变化情况 16终点分析法终点分析法时间吸光度A 1tS+R1 基于基于 被测物质在反应过程中被测物质在反应过程中到达反应终点或平衡点到达反应终点或平衡点，根据该点吸光度的大小求出被测物浓度，称为终点法根据该点吸光度的大小求出被测物浓度，称为终点法。 终点法的计算：终点法的计算： 从从时间时间- -吸光度曲线吸光度曲线来看，到达反来看，到达反应终点时，吸光度将不再变化应终点时，吸光度将不再变化。在达。在达到终点时任取一点进行测定，此时底到终点时任取一点进行测定，此时底物和产物的量都不再变化。物和产物的量都不再变

7、化。吸光度A 1S+R1吸光度 17 两点终点法（两点终点法（2-point end2-point end） 一点终点法一点终点法 （1-point end1-point end）一点终点单试剂（一点终点单试剂（1-point endpoint assay one reagent1-point endpoint assay one reagent）一点终点双试剂（一点终点双试剂（1-point endpoint assay two reagents1-point endpoint assay two reagents） 三点终点法（三点终点法（3 3- -point endpoint end）

8、终点分析法（终点分析法（Endpoint assaysEndpoint assays） 18两点终点法两点终点法 在被测物反应或指示反应尚未开始时，选择第一在被测物反应或指示反应尚未开始时，选择第一个吸光度，在反应到达终点或平衡时选择第二个吸光度，个吸光度，在反应到达终点或平衡时选择第二个吸光度，此两点吸光度之差用于计算结果。此两点吸光度之差用于计算结果。 19去除了样本的本底采用两个测量点 针对两个或多个试剂的项目第一个读数点一般选在添加最后一个试剂之前第二个读数点一般选在加入最后一个试剂之后且已经达到了反应终点两点终点法的特点两点终点法的特点C + D (显色产物)+ B1 (试剂1) +

9、 B2 (试剂 2)A A (样本)Endpoint assaysEndpoint assays 20两点终点法的反应曲线两点终点法的反应曲线Cobas c702Cobas c702Endpoint assaysEndpoint assaysSample+R1Mp1 abs before addition of R3Mp2 abs at reaction end 21两点读数的时间点:第19点测量包含了样本和试剂1的本底 sample + reagent 1 第 38点在加入所有试剂后，反应达到终点 sample + reagent 1+ reagent 2两点终点法的应用参数两点终点法的应用

10、参数 Cobas c702 Cobas c702测量的两个读数点方法类型总反应时间（min）2Point Endpoint assay application settings2Point Endpoint assay application settings 22RF-II C4 C3 ASL CRPL IGG IGA IGM两点终点法分析项目举例两点终点法分析项目举例Endpoint assaysEndpoint assays 23一点终点法一点终点法A单试剂一点终点法例如:CHOL/TG. 在反应到达终点，即在时间在反应到达终点，即在时间- -吸光度曲线上吸光度不再吸光度曲线上吸光度不再

11、改变时选择一个终点吸光度值，用于计算结果。改变时选择一个终点吸光度值，用于计算结果。B双试剂一点终点法Mg(双试剂) 24单试剂一点终点法的特点（单试剂一点终点法的特点（1-point endpoint assay one reagent1-point endpoint assay one reagent） 不包含样本的本底 仅进行一个点的测量检测项目举例：甘油三酯（TG）Endpoint assaysEndpoint assaysA (样本) C + D (显色产物)+ B (试剂) 25单单试剂一点终点法的反应曲线试剂一点终点法的反应曲线1-point endpoint assay 1-p

12、oint endpoint assay oneone reagents reagentsEndpoint assaysEndpoint assays 26 不包含样本的本底 仅进行一点测量应用项目举例： Magnesium不采用两点终点法主要是样本和R1体积相加仍180uL(最小反应体积，无法测量）双试剂一点终点法的特点（双试剂一点终点法的特点（1-point endpoint assay two reagents1-point endpoint assay two reagents）C + D (product)+ B1 (reagent 1) + B2 (reagent 2)A A (sa

13、mple) 27 1st entry: 方法类型 2nd entry:总分析时间 3rd - 6th entry:测量点 一点终点法应用参数（一点终点法应用参数（1 Point Endpoint assay1 Point Endpoint assay）Utility - Application - AnalyzeUtility - Application - Analyze 28 TRIGL CHO 一一点终点法分析项目举例点终点法分析项目举例Endpoint assaysEndpoint assays 29例如例如, ,多项同测组合试剂盒多项同测组合试剂盒,CHO,CHO与与TGTG同一测定

14、同一测定 即双终点法即双终点法, ,在一个通道内一次进行两项反应相关在一个通道内一次进行两项反应相关的终点法测定的终点法测定. .三点终点法三点终点法 30上升 increasing 或 下降decreasing终点法反应的方向（终点法反应的方向（Reaction DirectionReaction Direction） 31 速率法速率法 吸光度tt2t1t3t4A1A2A3S+R时间A 1 利用线性反应期，计算出单位时间的吸光度变化A/min，来计算酶的活性。单位时间的吸光度变化量是一致的 在酶促反应过程中在酶促反应过程中, ,在反应速度恒定期在反应速度恒定期( (线性反应期线性反应期)

15、)来连续观察和记录一定来连续观察和记录一定反应时间内底物或代谢产物变化速度的化学方法反应时间内底物或代谢产物变化速度的化学方法. . 32速率速率A A法法 （Rate ARate A）两点速率法（两点速率法（2-point Rate2-point Rate）速率法（速率法（Endpoint assaysEndpoint assays） 33 速率速率A A法法A 单试剂速率法例如:ACPAFUB 双试剂速率法 例如:ALTASTCK 在较长的反应时间区段内,每隔一定时间读取一次吸光度值,至少读取4点,得到3个A,求出单位时间的反应速率 A/min . .通过最小二乘法（least squar

16、es method） 34Rate A assay Modular PRate A assay Modular PReag. at R3 timingLast mp1st. mpSample Reag. at R1 timingRate assaysRate assays 35GOT/ASTGGTGPT/ ALT LipaseALPGLDHAmylaseLDHCHECKMB 速率速率A A 法法- -分析项目举例分析项目举例EnzymesRate assaysRate assays 36 2 2点速率法点速率法 2点速率法尿素氮 指在时间指在时间- -吸光度曲线上选择两个测光点，此两点既非反应

17、初始吸光吸光度曲线上选择两个测光点，此两点既非反应初始吸光度亦度亦非终点吸光度，这两点的单位时间吸光度差值用于结果计算。非终点吸光度，这两点的单位时间吸光度差值用于结果计算。 372-point Rate assay2-point Rate assayRate assaysRate assaysC + D (product)+ B1 (reagent 1) + B2 (reagent 2)A A (sample)Enzyme 38采用一种或多种试剂检测两个测量点检测固定的间隔时间内两点的吸光度变化。 换算成 Abs/min参与计算在加入最后最后一个试剂之后进行吸光度检测。两点速率法的特点两点速

18、率法的特点2-point Rate assay2-point Rate assayRate assaysRate assays 392-point Rate assay Modular P2-point Rate assay Modular PRate assaysRate assays 40AmmoniaAcid phosphataseNon-prostatic phosphataseUrinary/CSF protein BicarbonateUreaRate assaysRate assays2 2点速率点速率 法法- -分析项目举例分析项目举例 41Reaction DirectionReaction Direction上升decreasing 或 下降increasing 生化反应曲线生化反应曲线 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57Thank you for your attentio