中医药论文：黄芪中黄芪总皂苷的大孔树脂纯化工艺研究

1、中医药论文:黄芪中黄芪总皂苷的大孔树脂纯化工艺研究【摘要】目的优选出分离纯化黄芪中黄芪总皂苷的最佳工艺条件。方法采用动态吸附罕斤;上,用超高效液相色谱法测定黄芪甲苷的含量，优选出最佳纯化条件。结果 D101 树脂对黄芪总皂苷的纯化最优，以 2 BV/h 吸附速率吸附,5 BV 70%乙醇以 3 BV/h 的流速进行洗脱 效果最佳，黄芪甲苷的精制度为 446.28%。结论 D101 大孔吸附树脂可用于黄芪总皂苷的纯 化。【关键词】黄芪；黄芪总皂苷；大孔树脂 黄芪为豆科植物蒙古黄芪 Astragalusmembranaceus（Fisch.）Bge.var.mongholicus（Bge.）Hsi

2、ao 或膜荚黄芪 Astragalusmembranaceus（Fisch.）Bge.的干燥根,其主要成分为黄芪总皂苷，具有广泛的药理作用，如强 心、抗胃溃疡、对外周神经系统的再生具有双重调节作用、降血压等作用2-5。本文以黄芪甲苷为指标对黄芪中黄芪总皂苷的纯化进行了研究，为以后黄芪的进一步开发做基础。1 材料与仪器黄芪甲苷对照品（中国药品生物制品检定所，批号 110781200613）;黄芪药材（浙江中医药大学中药饮片厂），经浙江中医药大学资源鉴定教研室陈孔荣副教授鉴定为膜荚黄芪Astragalus membranaceus（Fisch.）Bge.的干燥根。化学试剂均为分析纯。D201、D1

3、01、DM130（天津南开大学化工厂）。赛多利斯分析天平（赛多利斯科学仪器北京有限公司）;RE 52AA 旋转 蒸发器（上海亚荣生化仪器厂）,Waters AcquityTMUltraperformanee LC 色谱仪、AcquityTMTUV 检测器；2 方法与结果2.1 色谱条件 色谱柱：ACQUITY UPLC BEH C18（2.1 mmx100 mm,1.7 卩 m）;流动相：乙 腈-水（35： 65）;漂移温度:50C;流速:02 ml/min;柱温:30C;氮气压力：45PSI。2.2 对照品溶液的制备精密称取黄芪甲苷对照品适量，用甲醇制成浓度为 0066mg/ml 的溶液，作

4、为对照品溶液。2.3 供试品溶液的制备 取黄芪粗粉约 3 g,精密称定 加甲醇 24 ml 加热回流 2 次，每次 2 h, 过滤合并滤液，减压回收并用甲醇定容至50 ml 量瓶中，备用。2.4 标准曲线的制备 取“2.2”项下的对照品溶液，分别进样 05、1、1.5、2.0、2.5 卩l,以对照品峰面积的常用对数值（Y）为纵坐标、进样量（卩 g）的常用对数值（X）为横坐标进行线性回归，得回归方程为 Y=39921X16698（ r =09997）。结果表明，黄芪甲苷进样量在 00330165 卩 g 范围内的对数值与峰面积对数值呈良好线性关系。2.5 精密度实验取 2.2 项下的对照品溶液进

5、样，重复测定 6 次，每次进样 3 卩 l,记录峰面 积,计算得 RSD 为 051%。2.6 稳定性实验 按照“ 2.3”项下制备样品一份，分别于 0 h、4 h、6 h、8 h、10 h 进样, 每次进样 3 卩 l,依法测定，记录峰面积。计算得 RSD 为 3.14%,表明样品在 10 h 内稳定。3 上柱药液的制备取黄芪粗粉约 80 g,精密称定，加甲醇 240 ml 加热回流 2 次，每次 2 h,过滤，合并滤液，减压 回收甲醇并用纯净水定容至50 ml 量瓶中，备用。4 树脂的选择称取预处理过的树脂各 5 g 于 100 ml 锥形瓶中，加入一定量供试品溶液，盖紧瓶塞，每隔 10

6、min振摇 20 s,持续 2 h,静止放置 24 h,过滤,测量滤液中黄芪甲苷含量，计算吸附率。将经静 态吸附后的树脂水洗至无Molish 反应（吸取 1 ml 清洗液，加 5%划;/阻？诫 3 滴,摇匀。沿试管壁缓缓加入 05 ml 浓硫酸，如在试管与硫酸的交界面处，很快形成紫色环），加 70%乙祝康论文堂羸平皆 中国学术期刊网F祝廣论立堂羸平皆-中国学术期刊网醇 20 ml 解吸，每隔 10 min 振摇 20 s,持续 2 h,静置 24 h 后,过滤得解析液，测定其黄芪甲苷含量计算解析率。表 1树脂的筛选树脂型号 吸附率（）转移率（）D201 705 62.9D101 92.8 89

7、.2DM130 88.3 84.8表 1 表明,D101 对柴胡皂苷和姜黄素的吸附率与转移率均最高，所以选用 D101 大孔树脂。5 动态考察5.1 动态吸附曲线的考察取 DM101 树脂 20 g（血 18 mmx40 cm）于柱内，精密吸取按上述方法制备的黄芪水溶液上柱，流速为 3 BV/h,每 20 ml 收集为一流分，测量流出液中黄芪甲苷的含量。以流出液体积（ml）为横坐标，黄芪甲苷的量（mg）为纵坐标，分别绘制泄漏曲线，计算树脂吸附容量。树脂吸附量 =泄漏点上样体积（ml）x样品浓度（mg/ml）图 1 动态泄露曲线由图 1 可知,D101 树脂的吸附饱和点为 120 ml,即每克

8、D101 可吸附黄芪甲苷 1.25 mg。5.2 上柱药液浓度的考察 取 D101 树脂 10 g,将上述样品（黄芪甲苷浓度为 0 8 mg/ml） 分别加水稀释成浓度为 0 4、0 2、0 1 mg/ml 的上样液，以 2 BV/h 的流速进行吸附，水洗,70%乙醇以 3 BV/h的流速洗脱，收集洗脱液，测定黄芪甲苷的含量。图 2 不同药液浓度对黄芪甲苷纯化的影响由图 2 可以得出当含黄芪甲苷为 08 mg/ml 时，吸附率最高，当浓度更高时容易使柱子堵塞，故确定药液浓度为 08 mg/ml。5.3 吸附流速的考察 取最佳浓度下的黄芪水溶液，控制流速 1、2、3、4、5 BV/h 进行吸 附

9、冰洗，以 3 BV/h 的 70%乙醇 5 BV 洗脱。收集上样残留液和醇洗脱液，分别测定其黄芪甲苷 的含量。图 3 不同吸附流速对黄芪甲苷纯化的影响由图 3 可得出，当吸附流速为 2BV/h 时吸附率最大5.4 乙醇洗脱浓度的考察 分别取 5 根树脂柱各以 2BV/h 的吸附流速上药液。用纯净水 洗后,分别用 40%、50%、60%、70%、80%的乙醇（分别标为 15 号）各 5 BV,以 3 BV/h 流速依次进行洗脱，分别收集不同浓度的乙醇洗脱液5 份。测定含量。图 4 不同乙醇浓度对黄芪甲苷纯化的影响由图 4 可得,4 号浓度的乙醇对柴胡甲苷纯化最佳，故选择 70%的乙醇洗脱。5.5

10、 洗脱流速的考察 按上述所确定的条件进行吸附，洗脱，控制 5 BV 70%的乙醇分别以1、2、3、4、5 BV/h 洗脱，收集洗脱液，计算柴胡皂苷和姜黄素的含量。图 5 不同洗脱流速对黄芪甲苷纯化的影响由图 5 可得,洗脱流速为 1 BV/h 和 3 BV/h 时黄芪甲苷的解析率相当，为提高工作效率选 用 3 BV/h的流速。6 重复验证试验根据上述试验结果，按最佳条件，即取浓度为 08 mg/ml 的黄芪水溶液以 2 BV/h 上样，水洗至无 Molish 反应,5 BV 70%乙醇洗脱，收集洗脱液，平行 3 份。测定黄芪甲苷的含量，另取 黄芪上样品液及 70%乙醇洗脱液水浴挥干，干燥至恒重

11、，计算总固物。结果黄芪提取液纯化前 黄芪甲苷量祝廣论立堂羸平皆-中国学术期刊网占总固物的4.97%,纯化后黄芪甲苷占总固物的22.18%，黄芪甲苷的精制度为446.28%。7 讨论本实验考察了 70%乙醇洗脱用量对黄芪甲苷纯化的影响，随着乙醇用量的增加，黄芪甲苷 的洗脱量增加，当洗脱用量达到 5 BV 时，洗脱量达到了总洗脱量的 88.07%,若增加洗脱量则黄 芪甲苷含量甚少，且加大了工作量，影响效率，故采用了 5BV 的用量。用 D101 大孔树脂富集纯化黄芪总皂苷的效果好，采用 5BV70%乙醇洗脱，洗脱率高，成本低，转移率达到 71.17%，适于大工业化生产。参考文献1 中国药典 200

12、5 年版第一部S.2005.2 LIU Y X，LIU Z P，JIAO J J，et al. Effects of astragaloside IV on myocardiac dynamicsand cardiac fun cti on with no rmal and depressa nt cardiac fun cti on in rats.Ch in Tradit Herb D rugs(中草药),2001,32(4):332334.3 CHENG C Y，YAO C H，LIU B S，et al.The role of astragaloside in regeneration of theperipheral nerve system.J B iomed Mater Res A，2006,76(3) :463469.4 NA VARRETE A,ARRIETA J,CALIS I,et al.Gastrop rotective effect of astragalosideV:role of prostagla ndi ns,sulfhydryls and n itric oxide.J Pharm Pharmacol,2005,57(8):10591064.5 WANG X,V