乳酸乳球菌摇瓶发酵条件优化

1、 项项 目目 名名 称称 ： 乳酸乳球菌摇瓶发酵条件化乳酸乳球菌摇瓶发酵条件化 项项 目目 负负 责责 人人 ： 张芳艳张芳艳 负责人所在学院负责人所在学院 ： 化学与生命科学学院化学与生命科学学院 指指 导导 教教 师师 ： 滕国生滕国生 据估计，全世界每年约有10%一20%的食品由于腐败而废弃，造成巨大的经济损失。过去人们常常利用加入化学防腐剂的方法来延长食品的保据估计，全世界每年约有据估计，全世界每年约有10%一一20%的食品由于腐的食品由于腐败而废弃，造成巨大的经败而废弃，造成巨大的经济损失。过去人们常常利济损失。过去人们常常利用加入化学防腐剂的方法用加入化学防腐剂的方法来延长食品的保

2、藏期，由来延长食品的保藏期，由于化学防腐剂添加过量可于化学防腐剂添加过量可致癌，对人体健康和生态致癌，对人体健康和生态环境都产生不利的影响。环境都产生不利的影响。随着人们生活水平的提高，随着人们生活水平的提高，健康食品、绿色食品越来健康食品、绿色食品越来越受到欢迎。利用安全高越受到欢迎。利用安全高效生物防腐剂代替化学防效生物防腐剂代替化学防腐剂已成为一种趋势。腐剂已成为一种趋势。乳链菌肽乳链菌肽(Nisin)是世界上公认安全的防腐剂。是一种由微是世界上公认安全的防腐剂。是一种由微生物代谢所产生的具有很强杀菌作用的天然代谢产物。乳链生物代谢所产生的具有很强杀菌作用的天然代谢产物。乳链菌肽本身具有

3、许多优良性质：首先，容易被人体消化道中的菌肽本身具有许多优良性质：首先，容易被人体消化道中的一些蛋白酶和胰蛋白酶所降解，不会在体内蓄积而引起不良一些蛋白酶和胰蛋白酶所降解，不会在体内蓄积而引起不良反应，并且对食品的色、香、味等无不良影响。使用它还可反应，并且对食品的色、香、味等无不良影响。使用它还可以降低杀菌温度，减少热处理时间，因此能改进食品的营养以降低杀菌温度，减少热处理时间，因此能改进食品的营养价值、风味、结构、颜色等性状，同时还可节省能耗。乳链价值、风味、结构、颜色等性状，同时还可节省能耗。乳链菌肽本身具有热稳定性并耐酸、耐低温贮藏，作为一种理菌肽本身具有热稳定性并耐酸、耐低温贮藏，作

4、为一种理想的天然防腐剂获得越来越广泛的应用。在食品工业中，各想的天然防腐剂获得越来越广泛的应用。在食品工业中，各种食品的防腐保鲜是一个非常重要的问题。种食品的防腐保鲜是一个非常重要的问题。乳链菌肽是由乳酸乳球菌乳链菌肽是由乳酸乳球菌(lactococcus lactis)或乳酸链球菌或乳酸链球菌(Streptococcus lactis)产生的一种产生的一种小分子多肽抗菌物质，对许多革兰小分子多肽抗菌物质，对许多革兰氏阳性菌，包括引起食品腐败和对氏阳性菌，包括引起食品腐败和对人体健康有害的葡萄球菌人体健康有害的葡萄球菌(Staphylococcus)、链球菌、链球菌(Streptococcus

5、)、微球菌、微球菌( Micrococcus)、分枝杆菌、分枝杆菌(Mycobacterium)、利斯特氏菌、利斯特氏菌(Listeria)和乳杆菌和乳杆菌(Lactobacillus)等有强烈抑制作用。等有强烈抑制作用。乳链菌肽作为一种高效天然无毒的食乳链菌肽作为一种高效天然无毒的食品防腐剂，己经广泛应用于肉类、鱼品防腐剂，己经广泛应用于肉类、鱼类、牛奶、干酪、蛋类、水果、蔬菜、类、牛奶、干酪、蛋类、水果、蔬菜、果汁饮料、啤酒酿造、豆制品等食品果汁饮料、啤酒酿造、豆制品等食品的防腐处理。随着应用研究的深入，的防腐处理。随着应用研究的深入，乳链菌肽应用范围目前已扩展到造纸、乳链菌肽应用范围目前

6、已扩展到造纸、活性食品包装、农业饲料、生殖避孕、活性食品包装、农业饲料、生殖避孕、医学移植等领域。它能有效地延长食医学移植等领域。它能有效地延长食品变质期和货架寿命品变质期和货架寿命,对人体无毒无害对人体无毒无害,有明显的社会和经济效益。近来还发有明显的社会和经济效益。近来还发现乳链菌肽可用于治疗胃和十二指肠现乳链菌肽可用于治疗胃和十二指肠溃疡、口腔溃疡和皮肤病溃疡、口腔溃疡和皮肤病 ,具有医药具有医药价值价值,发展前景广阔。发展前景广阔。 现状 但由于目前产乳链菌肽的菌种产生乳但由于目前产乳链菌肽的菌种产生乳链菌肽产量低、效价不高，利用的培链菌肽产量低、效价不高，利用的培养基价格昂贵，造成生

7、产成本高，导养基价格昂贵，造成生产成本高，导致乳链菌肽不能大规模化生产中的应致乳链菌肽不能大规模化生产中的应用。因此，我们开始寻找产高效价、用。因此，我们开始寻找产高效价、高产量的乳链菌肽生产菌株，并利用高产量的乳链菌肽生产菌株，并利用工业废料进行发酵生产，以降低成本，工业废料进行发酵生产，以降低成本，推进乳链菌肽在食品、环保、农业、推进乳链菌肽在食品、环保、农业、医药、化工等领域的广泛应用。医药、化工等领域的广泛应用。目前国内外对乳链菌肽的研究多集中乳链菌肽的发酵条件优化、单一的菌种选育等研究方面。Angela Faustino Jozala（2005）利用脱脂牛奶对乳链菌肽的发酵培养基进行

8、了优化;Washingtoun state university利用乳清连续发酵乳链菌肽，产量稳定在92.9mg/L；Appl Microbiol Biotechnol (2005)发表了关于乳链菌肽的分批发酵模型。大连轻院焦中高焦中高等人以乳酸乳球菌79UV-S22为出发菌株，用紫外线、DES、LiCl 等多种理化因子进行诱变处理，获得一株乳链菌肽高产突变株，其效价稳定在2000 IU/ml 以上；华南理工大学杨博杨博等人对乳酸乳球菌79UV-S22 经多种诱变处理后，利用菌株的乳链菌肽免疫性筛选得到一株乳链菌肽高产菌株，效价达1527 IU/ml；中科院还连栋还连栋等人以乳酸乳球菌7962

9、为原始菌株，用紫外线等多种理化诱变剂对其进行诱变处理，获得一株乳链菌肽 高产突变株，其效价稳定在2300-2500 IU/ml。从以上国内外的研究现状来看，菌种的生产效价水平较低、发酵工艺落后、且发酵原材料昂贵、制约了大规模化生产，限制了在食品、保健品和医药等方面的广泛应用。本项目以购于美国菌种保藏中心Lactococcus lactis subsp.lactis ATCC11454的菌株为出发菌株，对其进行诱变筛选得到遗传稳定的乳链菌肽高产菌株，在对优化乳链菌肽发酵培养基的基础上，我们将采用化学计量学的方法，优化其摇瓶发酵条件，首先采用两水平的PB设计实验，分别考察装液量、接种量、温度、转速

10、、初始pH值和发酵时间对乳链菌肽的影响，采用多元一次回归模型对PB实验结果进行分析，筛选出影响显著摇瓶培养条件，然后进行中心组合设计实验以进一步优化乳链菌肽的摇瓶发酵条件，分别采用多元二次回归模型和神经网络模型对中心组合设计实验结果进行分析，考察各影响显著培养条件之间的交互作用，同时分别采用偏导求极值的方法和遗传算法分别对模型进行最优值的搜寻，然后在最优条件下进行验证实验，以验证优化结果的准确性和方法的可行性。研究思路和方法：研究思路和方法：1. BP试验设计筛选乳链菌肽摇瓶影响显著的发酵条件摇瓶发酵培养基(g/L): 葡萄糖 15.92, 蛋白胨 30.57, 酵母浸粉 39.07, NaC

11、l 5.25, K2HPO4 10，MgSO47H2O 0.2.采用摇瓶发酵培养基，250 ml的摇瓶，按照PB实验设计表进行实验，然后采用多元一次回归模型对结果进行分析，筛选影响显著的摇瓶发酵条件。Plackett-Burman试验因子水平及编码值因素 X1 X2 X3 X4 X5 X6 X7 pH 转速/rpm 温度/ 接种/% 装液/ml 发酵时间/h 种龄/h 71804041202412 612034280188PB实验设计runX1X2X3X4X5X6X7X8X911-11-1-1-1111211-11-1-1-1113-1 11-11-1-1-1141-111-11-1-1-15

12、11-111-11-1-16111-111-11-17-1111-111-118-1-1111-111-19-1-1-1111-111101-1-1-1111-1111-11-1-1-1111-112-1-1-1-1-1-1-1-1-1在PB试验的基础上，进行Box-Benhnken 设计试验，同时采用多元二次回归模型和神经网络模型对实验结果进行分析，多元二次回归用于描述各考察因素对乳链菌肽效价的影响和各考察因素之间的交互关系，神经网络模型用于预测各发酵条件下乳链菌肽效价。模型的拟合度采用决定系数（R2）评价，模型的显著采用F检验来测定，多元二次回归模型中各项系数采用t检验进行显著性检验，以评

13、价各考察因素对响应值和各考察因素之间交互作用的显著性。2 . Box-Benhnken 设计试验优化乳链菌肽摇瓶发酵条件设计试验优化乳链菌肽摇瓶发酵条件 4.重点及难点：重点及难点：本项目重点及难点所在为Plackett-Burman设计试验和Box-Benhnken 设计试验及最陡爬坡试验等化学计量学方法在乳链菌肽发酵培养基及发酵条件的优化中的应用。 5. 创新点：创新点：本项目在以前工作的基础上，预利用Plackett-Burman设计法、最陡爬坡实验和Box-Behnken设计并结合响应面等统计学分析法对乳链菌肽发酵培养基进行优化，提高乳链菌肽效价在培养基优化的基础上，进一步优化乳链菌肽的培养条件，分别对装液量、接种量、温度、转速、初始pH值和发酵时间进行单因素实验，进一步提高乳链菌肽的效价，得到适合生产的发酵工艺条件，降低了乳链菌肽的生产成本，从而实现乳链菌肽的大规模生产。生物显微镜 XSZ-HS 江南光电股份有限公司台式恒温摇床 Innova 4000 New Brunswick Scientific高压自动灭菌锅 400145 P.selecta可见分光光度仪 723 山东高密彩虹分析仪器有限公司PH计 PHSJ-3F 上海精密仪器有限公