荷叶多酚的微波辅助提取工艺优化及其抗氧化活性研究11

1、荷叶多酚的微波辅助提取工艺优化及其抗氧化活性研究赵晓云 赵博 邢媛媛 李志洲（陕西理工学院化学与环境科学学院 陕西汉中 723001）摘要：采用回归正交实验优化荷叶多酚的最佳提取工艺条件，并对所提取的多酚进行抗氧化活性研究，结果显示：最佳提取工艺条件为料液比1:50.7，乙醇体积分数32.5%，微波作用时间159.4s，荷叶多酚得率可达4.214%。荷叶多酚的抗氧化性研究结果表明，荷叶多酚样品液浓度大于0.7mg/mL时对·OH的清除效果优于柠檬酸和Vc；且随着荷叶多酚添加量的增加对油脂的抗氧化效果增强，当添加量大于0.2%时对油脂抗氧化效果优于Vc；加入其他抗氧化剂后荷叶多酚的抗氧

2、化效果明显增强。关键词：荷叶；多酚；回归正交；抗氧化性Optimization of themicrowave-assisted extract processing of polyphenolsin lotus-leaf and oxidation activityZHAO Xiao-yun,ZHAO Bo,XHING Yuan-yuan, LI Zhi-zhouSchool of Chemical & Environmental Sciences，Shaanxi University of technologyHanzhong Shaanxi 723001Abstract:The

3、optimum extraction conditions of microwave enhancement extraction ofpolyphenols from lotus-leaf were optimizedby orthogonal regression design andantioxidant activities of the extraction of polyphenols were researched. The results showed that the optimum extraction conditions were the ratio of raw ma

4、terial 1:50.7;ethanol volume fraction 32.5%,the microwave duration 159.4s, the rate of the polyphenols can reach4.212%.Theresults of oxidation stability of polyphenolsin lotus-leafshowed thatthe concentration than 0.7 mg/mL of lotus leaf polyphenols samplesclearing the ·OH is better than citrat

5、e acid and Vc; and as the lotus polyphenols additives to grease antioxidant effects is increasing, grease antioxidant effects of the adding more than 0.2% is better than the Vc,;the antioxidant capacity of polyphenols inlotus-leafis obviously enhanced after adding other antioxidant.Keywords:lotus-le

6、af; polyphenols;orthogonal regression;oxidation resistance植物多酚又名植物单宁，为植物体内的一种次生代谢产物，具有多元酚羟基结构，是多羟基酚类化合物的总称1。其主要存在于植物的皮、根、叶、果中，具有多种保健功能，其中最重要的是它的抗氧化功能2。它不仅对活性氧自由基具有很强的捕捉能力，而且可以对由氧自由基诱发的生物大分子损伤起到保护作用3-4。具有明显的抗突变、抗肿瘤、抗病毒、抗微生物、抗衰老等功能5-6。因而植物多酚在医药、食品、保健品、化妆品等行业中显示出巨大的应用价值。国内外对荷叶黄酮、生物碱类物质的抗氧化活性研究报道较多7-8，但

7、对荷叶多酚提取及抗氧化性研究报道较少。本文通过回归正交优化了荷叶多酚的提取工艺，并探索了其对·OH的清除率和对油脂的抗氧化性。1实验部分1.1 实验材料与主要仪器主要原料：荷叶（产地：汉中）；主要试剂：没食子酸、三氯化铁、铁氰化钾、盐酸、甲醇、乙醇、丙酮等，均为分析纯（AR）。主要仪器：WF-2000微波反应器(上海屹尧分析有限公司)；TU-1800型紫外分光光度计(北京普析通用仪器有限责任公司)；GR-200电子分析天平（日本-A&D公司）等。作者简介：赵晓云（1987.10），女，汉族，陕西理工学院化学与环境科学学院化学工程与工艺专业07级学生。 1.2 实验方法1.2.

8、1没食子酸标准曲线的绘制精确量取没食子酸配制浓度为0.05mg/mL的标准溶液，移取0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL，分别置于6个25mL棕色量瓶中，依次加入0.5mL浓度为0.100mol/LFeCl3溶液，0.5mL浓度为0.008mol/LK3Fe(CN)6溶液和0.5mL浓度为0.1mol/L的盐酸溶液，蒸馏水定容。摇匀，静置15min后用紫外可见分光光度计在695nm处测定吸光值，并绘制标准曲线9，采用二次回归得回归线性方程为:y=0.3653x+0.0171，R2=0.9993式中：y表示吸光度;x表示没食子酸浓度(g/mL)。1.2.2荷叶多酚的提取流程新鲜荷叶除去

9、叶柄清洗切碎60干燥 粉碎筛分(0.3mm)微波提取过滤荷叶多酚提取液浓缩低温烘干荷叶粗多酚荷叶多酚含量的测定准确称取1.000g荷叶干粉，按照一定的料液比加入不同体积分数的溶剂，控制提取温度，在一定微波功率下提取一定时间后离心，蒸馏水定容至。然后取0.1mL上述溶液，采用的方法测定荷叶多酚含量。荷叶多酚得率(%)=(提取的荷叶多酚的质量/荷叶干粉的质量)×100%1.2.4 荷叶多酚清除羟自由基的研究10取5mmol/L邻二氮菲1.5mL于试管中，依次加入0.05mol/L、pH=7.4的磷酸缓冲液2.0mL、1.0mL蒸馏水、0.75mmol/LFeSO4溶液1.0mL，充分混合

10、后加入0.1%的H2O21.0mL，最后加蒸馏水定容至10mL。反应液在37下保温1h，于536nm处测吸光值，其值记为Ap。同，其中用1.0mL蒸馏水代替1.0mLH2O2，测得吸光度值记为Ab。用不同浓度的荷叶多酚试样液1.0mL代替中的1.0mL蒸馏水，测得的吸光度值记为AS。清除率计算公式为:清除率d(%)=(ASAp)/(AbAp) ×100%1.2.5荷叶多酚在油脂体系中抗氧化作用的实验1.2.5.1标准曲线的绘制精确量取0.5mmol/L的KI-I 2标准溶液0、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8mL，分别置于25mL具塞试管中，依次加入2.00mL氯仿-冰醋酸(2

11、:3，体积比)、1.00mL1%(w/v)可溶性淀粉溶液，加水定容至25mL，摇匀，静置20min后取上层清液于585nm处测定其吸光度，绘制标准曲线，以碘量为横坐标，吸光值为纵坐标绘制标准曲线11。得到碘量-吸光度的回归方程:，R2=0.9991式中：y表示吸光度;x表示含碘量/mol。1.2.5.2油脂POV值得测定将新鲜猪油切成小块，文火湿法熬炼，双层纱布过滤除去残渣，冷却密封后放入冰箱中备用。称取30g，并加入样品溶液于100mL的烧杯中，置于50水浴中缓慢加热熔化油样，并在升温过程中不时搅拌使成均相，60恒温箱中保存，每隔12h搅拌1次，并注意调换在烘箱中的位置，以确保实验条件尽量相

12、同，每隔2d进行取样测定。油脂测定POV值方法如下：称取油样0.6g于具塞试管中（同时做平行试验与空白试验，以蒸馏水为参比），加入2.00mL的氯仿-冰醋酸溶液，摇匀溶解后，加入1.00mL的10%的KI溶液，具塞摇匀30s，并置于暗处反应3min。取出后加入1.00mL1%(w%)的可溶性淀粉溶液，定容、摇匀。静置20min后测吸光度，根据其吸光度和标准曲线计算碘的生成量。根据以下公式计算样品的POV值：POV(meq/kg)=碘生成量(mol)/油样质量(g)2结果与讨论2.1 提取剂的选择分别选用体积分数为20%的甲醇、乙醇、丙酮、乙酸乙酯溶液和蒸馏水作为萃取剂，在微波功率为300W、温

13、度为60、微波作用时间为150s、料液比为1：50，按照1.2的方法进行最佳溶剂的选择试验，试验结果见图1。由图1可知，20%甲醇的溶液提取效果最佳，20%的乙醇和丙酮次之，水的提取效果最差。但考虑到甲醇和丙酮的毒性较大，提取后去除不完全会对人体造成不良影响，而水的提取效果又太差，因此从安全、简便的角度考虑，实验选用乙醇作为荷叶多酚的提取溶剂。2.2 单因素试验料液比对荷叶多酚提取效果的影响固定微波功率为300W、温度为60、乙醇体积分数为20%、微波作用时间为150s。每个料液比平行3份，结果取平均值。不同料液比对荷叶多酚提取效果的影响如图2所示。由图2可知，液固比的增大对提高多酚得率的影响

14、较为显著，在1:20-1:50之间，多酚得率呈上升局势，而在1:50-1:70之间则多酚得率下降。所以最适的提取料液比为1:50。 图1 不同溶剂对提取率的影响 图2 不同料液比对对提取率的影响Fig.1 Effects of different solvents Fig.2 Effects of the ratio of raw material on the rate of extraction on the rate of extraction2.2.2乙醇体积分数对荷叶多酚提取效果的影响固定料液比1: 50、微波功率为300W、温度为60、微波作用时间为150s。每个体积分数平行3份，

15、结果取平均值。不同乙醇体积分数对荷叶多酚提取效果的影响如图3所示。由图3可知，开始时随着乙醇体积分数的增加，荷叶多酚得率提高，当乙醇浓度为30%时，多酚得率达到最大值。但超过30%后，荷叶多酚得率却下降。所以最适的乙醇体积分数为30%。2.2.3 微波功率对提取效果的影响固定料液比1: 50、乙醇体积分数为30%、温度为60、微波作用时间为150s。每个微波功率平行3份，结果取平均值。不同微波功率对荷叶多酚提取效果的影响如图4所示。由图4可知，开始时多酚得率随着微波功率的提高而增加，当微波功率为500W时，荷叶多酚得率最高，微波功率再升高得率反而下降。所以最适的微波功率为500W。图3 不同乙

16、醇体积分数对提取效果的影响图4 不同微波功率对提取效果的影响Fig.3 Effects ofdifferentethanol volume fractionsFig.4 Effects of different microwave powerson the rate of extraction on the rate of extraction2.2.4微波作用时间对荷叶多酚提取效果的影响固定料液比1: 50、微波功率为500W、温度为60、乙醇体积分数为30%。每个微波作用时间平行3份，结果取平均值。不同微波作用时间对荷叶多酚提取效果的影响如图5所示。由图5可知，随着时间延长多酚得率逐渐增大

17、，180s时最高，之后多酚得率又下降。因此微波时间选用180s比较适宜。2.2.5提取温度对荷叶多酚提取效果的影响固定料液比1: 50、微波功率为500W、乙醇体积分数为30%、微波作用时间为180s。多次提取、离心后合并滤液，每个提取次数平行3份，结果取平均值。不同提取次数对荷叶多酚提取效果的影响如图6所示。由图6可知，提取2次、3次和4次，多酚得率分别增加了10.1%、2.3%、1.4%，虽然多次提取能增加多酚的提取量，但提取量增加较少，原因可能是随着提取时间加长导致部分多酚物质的分解，降低了提取量。同时其他杂质成分也溶出增多，故从成本角度考虑，本实验选择提取次数为2次较为合适。图5 不同

18、微波作用时间对提取效果的影响 图6 不同提取次数对提取效果的影响Fig.5 Effects of the microwave duration Fig.6 Effects of the times of extractionon the rate of extraction on the rate of extraction2.3微波提取荷叶多酚条件优化2.3.1 回归正交实验设计从单因素实验结果可以看出，影响荷叶多酚得率的因素很多，主要是料液比、乙醇体积分数、微波作用时间三个因素。为优化提取条件，采用正交回归旋转组合实验设计方法，考察各因素对实验结果的影响，因子水平编码见表1。表1 因子水平

19、编码Table 1 Factors and levels of the orthogonalregression testsZ j料液比(g/mL)乙醇体积分数(%)微波作用时间(s)上星号臂 (+1.682)1：33.1813.18129.54上水平 (+1)1：4020150零水平 (0)1：5030180下水平 (-1)1：6040210下星号臂(-1.682)1：66.8246.82230.46变化区间j1：1010302.3.2二次回归正交实验结果按表1进行试验，实验指标（Y）为多酚得率，结果见表2：表2 正交回归实验结果Table 2 the results of orthogon

20、al regression design实验号Z1Z2Z3多酚得率(%)1-1-1-13.7292-1-114.0033-11-13.5614-1113.65451-1-13.86461-113.941711-13.58781113.7149-1.682003.712101.682003.500110-1.68203.6891201.68203.6451300-1.6823.7263.72614001.6824.2124.212150004.211160004.212170004.212180004.213190004.210200004.213210004.210220004.2112300

21、04.212二次回归正交实验结果分析对表2结果用SAS系统软件包进行结果分析12，结果见表3。表3 结果的方差分析Table 3 The results of variance analysis来源DFSSMSFPrZ110.0028570.0028570.3904570.542872Z210.0877960.08779611.997880.004196Z310.141140.1411419.287630.000729Z1210.6769430.67694392.508660.0001Z1Z210.0000210.0000210.0028870.957968Z1Z310.0033210.003

22、3210.4538530.512311Z2210.5428690.54286974.18660.0001Z2Z310.0021450.0021450.2931450.597369Z3210.0968350.09683513.233160.003007模型91.5390640.17100723.369210.0001误差130.0951290.007318总和221.634193由表3看出，一次项的Z2、二次项的Z32对实验结果影响显著；一次项的Z3、二次项的Z12、Z22对实验结果有非常显著的影响。决定系数R2=94.18%，说明自变量的产业化可以解释因变量变化的94.18%，这主要是未计入方

23、程的变量影响的缘故，另外，实验过程的误差也有一定的影响。回归模型的F值为23.36921，已经达到0.01的显著统计程度。最后得到的回归方程为：Y1=4.214836+0.007099Z1-0.014565Z2+0.064123Z3-0.238461Z12+0.197625Z1Z2-0.045625Z1Z3-0.156967Z22-0.016125Z2Z3-0.174999Z32方程分别对Z1、Z2、Z3求偏导并等于零，可求得Z1=-0.069881，Z2=-0.24759，Z3=0.686202，最佳工艺条件为：料液比1:50.7，乙醇体积分数32.5%，微波作用时间159.4s。预测最大值

24、为4.214%。在此最佳工艺条件下进行五次平行试验，结果取平均值，得到荷叶多酚得率为4.220%，与理论值比较二者比较接近。故此回归正交实验确定的工艺条件准确可靠、具有实际应用价值。2.4 荷叶多酚的抗氧化性研究2.4.1荷叶多酚清除羟自由基的实验按照1.2.3所示步骤分别考察0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2mg/mL荷叶多酚样品液体外清除·OH的作用， 以同样浓度的抗坏血酸、柠檬酸为对照，进行清除·OH活性的研究。结果见图7。由图7可知，荷叶多酚样品液对·OH具有明显的清除作用，且随着样品液浓度的增加，其对·OH的清除率呈上升趋势，即清除

25、率与多酚的浓度存在着一定的量效关系，多酚浓度为0.7mg/mL左右时， 其抗氧化能力与同浓度的Vc、柠檬酸基本相同，大于此值后，其抗氧化能力高于同浓度的Vc、柠檬酸。说明荷叶多酚对·OH的抗氧化能力优于Vc、柠檬酸。2.4.2荷叶多酚在油脂体系中抗氧化作用的实验2.4.2.1荷叶多酚在油脂中的抗氧化作用分别以油量的0（空白）、0.02%、0.05%、0.2%、0.5%加入荷叶多酚，以油量的0.20%加入Vc，不同时间抗氧化性能结果见图8、9。图7荷叶多酚对羟自由基清除率的影响 图8 荷叶多酚对猪油的抗氧化效果Fig.7 Effections of polyphenols from l

26、otus-leaf Fig.8 Effections of polyphenols from lotus-leaf on the clearance of the ·OH on lard antioxidant effects由图8、9可知，添加了荷叶多酚的猪油和菜油的氧化诱导期比空白组延长了2d，而以后的氧化速率也明显低于空白组，并且，其抗氧化效果随着荷叶多酚浓度的增加而增加，但均不同程度的降低了猪油和菜油的自氧化速率。对于图8，当荷叶多酚添加量为0. 05%时其抗氧化效果与0. 20%Vc效果相当，而高浓度的荷叶多酚优于Vc抗氧化剂；对于图9，当荷叶多酚添加量为0.02%、0.0

27、5%时其抗氧化效果与0. 20%Vc效果基本相当。由此说明荷叶多酚对油脂的抗氧化效果较好。2.4.2.2荷叶多酚与其它抗氧化剂的协同抗氧化作用研究分别取以油量的0.05%的荷叶多酚分别与0.02%的柠檬酸、0.02%的酒石酸以及0.02%的Vc协同抗氧化，另设一空白组（0.05%的荷叶多酚），不同时间的抗氧化性能结果见图10。由图10可知，加入其他增效剂后，荷叶多酚与增效剂对油脂的抗氧化作用明显增强，均优于单独使用荷叶多酚时的抗氧化作用。在前8天对油脂的抗氧化作用差别并不明显，而后荷叶多酚+Vc组的抗氧化作用减弱，可能是由于Vc本身在高温下物质结构发生了变化，丧失了增效作用。荷叶多酚+柠檬酸组、荷叶多酚+酒石酸组的POV值变化趋势相差不明显且具有较强的抗氧化性。图9 荷叶多酚对菜油的抗氧化效果图10 荷叶多酚与不同抗氧化剂协同对猪油抗氧化效果Fig.9 Effections of polyphenols from lotus-leafFig.10 Effections of the sy