第4章分子发光光谱法(福大仪器分析)

1、第第4章章 分子发光光谱法分子发光光谱法分子发光的类型分子发光的类型- -按激发的模式分类：按激发的模式分类：光致发光：分子吸收光能被激发，所产生的发光：分子荧光和磷光光致发光：分子吸收光能被激发，所产生的发光：分子荧光和磷光化学发光：分子由化学反应的化学能所激发化学发光：分子由化学反应的化学能所激发生物发光：分子由生物体体内的化学反应释放出来的能量所激发生物发光：分子由生物体体内的化学反应释放出来的能量所激发分子发光分析法的特点分子发光分析法的特点 灵敏度高。较吸收光度法一般要高灵敏度高。较吸收光度法一般要高2 3个数量级。个数量级。 选择性比较高。选择性比较高。 样品量小，操作简便，工作曲

2、线的动态线性范围宽。样品量小，操作简便，工作曲线的动态线性范围宽。4.1 荧光与磷光的基本原理荧光与磷光的基本原理第第4章章 分子发光光谱法分子发光光谱法4.1.1 分子荧光与磷光的产生分子荧光与磷光的产生分子能级：电子能级、振动、转动能级；分子能级：电子能级、振动、转动能级；基态基态(S0)激发态激发态(S1、S2、激发态振动能级、激发态振动能级)：吸收特定频率的辐射；量子化；跃迁一次到位；吸收特定频率的辐射；量子化；跃迁一次到位； 激发态激发态基态：多种途径和方式基态：多种途径和方式(见能级图见能级图)；速度最快、激发态寿命最短的途径占优势；速度最快、激发态寿命最短的途径占优势； 第一、第

3、二、第一、第二、电子激发单重态电子激发单重态 S1 、S2 ； 第一、第二、第一、第二、电子激发三重态电子激发三重态 T1 、T2 ；4.1 荧光与磷光的基本原理荧光与磷光的基本原理第第4章章 分子发光光谱法分子发光光谱法4.1.1 分子荧光与磷光的产生分子荧光与磷光的产生 电子激发态的多重度：电子激发态的多重度：M=2S+1 S S为电子自旋量子数的代数和为电子自旋量子数的代数和(0(0或或1)1)； 平行自旋比成对自旋稳定平行自旋比成对自旋稳定( (洪特规则洪特规则) )，三重态能级比相应，三重态能级比相应 单重态能级低；单重态能级低； 大多数有机分子的基态处于单重态；大多数有机分子的基态

4、处于单重态； S0T1 禁阻跃迁；禁阻跃迁；通过其他途径进入通过其他途径进入(见能级图见能级图)；进入的几率小；进入的几率小； 第第4章章 分子发光光谱法分子发光光谱法4.1.1 分子荧光与磷光的产生分子荧光与磷光的产生-分子的去激发过程分子的去激发过程非辐射能量传递过程非辐射能量传递过程 （1 1）振动弛豫：同一振动弛豫：同一电子能级内以电子能级内以热能热能量量交换形式由高振动能级至低相邻振动能级交换形式由高振动能级至低相邻振动能级间的跃迁。发生振动弛豫的时间间的跃迁。发生振动弛豫的时间10 -12 s。 （2）内转换：同多重度电子能级中）内转换：同多重度电子能级中,等能等能级间的无辐射能级

5、交换。级间的无辐射能级交换。 通过内转换和振动弛豫，高激发单重通过内转换和振动弛豫，高激发单重态的电子跃回第一激发单重态的最低振动能态的电子跃回第一激发单重态的最低振动能级。级。 第第4章章 分子发光光谱法分子发光光谱法4.1.1 分子荧光与磷光的产生分子荧光与磷光的产生-分子的去激发过程分子的去激发过程非辐射能量传递过程非辐射能量传递过程 （3）外转换：激发分子与溶剂或其他分子之）外转换：激发分子与溶剂或其他分子之间产生相互作用而转移能量的非辐射跃迁；间产生相互作用而转移能量的非辐射跃迁； 外转换使荧光或磷光减弱或外转换使荧光或磷光减弱或“猝灭猝灭”。（4）系间跨越：不同多重态）系间跨越：不

6、同多重态,有重叠的转动能有重叠的转动能级间的非辐射跃迁（级间的非辐射跃迁（S1 T1)。 改变电子自旋，禁阻跃迁，通过自旋改变电子自旋，禁阻跃迁，通过自旋轨轨道耦合进行。道耦合进行。第第4章章 分子发光光谱法分子发光光谱法4.1.1 分子荧光与磷光的产生分子荧光与磷光的产生-分子的去激发过程分子的去激发过程辐射能量传递过程辐射能量传递过程 (1)(1)荧光发射：电子由荧光发射：电子由第一激发单重态的最第一激发单重态的最低振动能级低振动能级基态（基态（ 多为多为 S1 S0跃迁），跃迁），发射波长为发射波长为 2的荧光；的荧光； 10-710 -9 s 。 由图可见，发射荧光的能量比分子吸收由图

7、可见，发射荧光的能量比分子吸收的能量小，波长长；的能量小，波长长； 2 2 1 第第4章章 分子发光光谱法分子发光光谱法4.1.1 分子荧光与磷光的产生分子荧光与磷光的产生-分子的去激发过程分子的去激发过程辐射能量传递过程辐射能量传递过程 (2) 磷光发射：磷光发射：电子由电子由第一激发三重态的最第一激发三重态的最低振动能级低振动能级基态（基态（ T1 S0跃迁）；跃迁）； 电子由电子由S0进入进入T1的可能过程：（的可能过程：（ S0 T1禁阻跃迁）禁阻跃迁） S0 激发激发振动弛豫振动弛豫内转换内转换系间跨越系间跨越振动弛豫振动弛豫 T1 发光速度很慢：发光速度很慢： 10-310 s 。

8、 光照停止后，可持续一段时间。光照停止后，可持续一段时间。第第4章章 分子发光光谱法分子发光光谱法4.1.2 荧光量子效率荧光量子效率荧光物质吸光后所发射的荧光的光子数与所吸收的激发光的光子荧光物质吸光后所发射的荧光的光子数与所吸收的激发光的光子数之比值。数之比值。第第4章章 分子发光光谱法分子发光光谱法4.1.3 荧光的激发光谱和发射光谱荧光的激发光谱和发射光谱1.荧光荧光(磷光磷光)的激发光谱曲线的激发光谱曲线 固定测量波长固定测量波长(选最大发射波长选最大发射波长),化化合物发射的荧光合物发射的荧光(磷光磷光)强度与照射光波强度与照射光波长的关系曲线长的关系曲线 （图中曲线（图中曲线I

9、） 。2.2.荧光光谱荧光光谱( (或磷光光谱或磷光光谱) ) 固定激发光波长固定激发光波长( (选最大激发波选最大激发波长长), ), 化合物发射的荧光化合物发射的荧光( (或磷光强或磷光强度度) )与发射光波长关系曲线与发射光波长关系曲线( (图中曲图中曲线线II或或III) )。第第4章章 分子发光光谱法分子发光光谱法4.1.4 荧光光谱的特征荧光光谱的特征 1.Stokes1.Stokes位移位移 激发光谱与发射光谱之间的波长差值。激发光谱与发射光谱之间的波长差值。发射光谱的波长比激发光谱的长，发射光谱的波长比激发光谱的长，振动弛振动弛豫消耗了能量。豫消耗了能量。 第第4章章 分子发光

10、光谱法分子发光光谱法4.1.4 荧光光谱的特征荧光光谱的特征2. 镜像规则镜像规则 通常荧光发射光谱与它的吸收光谱（与通常荧光发射光谱与它的吸收光谱（与激发光谱形状一样）成镜像对称关系。激发光谱形状一样）成镜像对称关系。 第第4章章 分子发光光谱法分子发光光谱法4.1.4 荧光光谱的特征荧光光谱的特征3.3.发射光谱的形状与激发波长无关发射光谱的形状与激发波长无关 电子跃迁到不同激发态能级，吸收不电子跃迁到不同激发态能级，吸收不同波长的能量同波长的能量( (如能级图如能级图 2 , 1)，产生不产生不同吸收带，同吸收带，但均回到第一激发单重态的但均回到第一激发单重态的最低振动能级再跃迁回到基态

11、，产生波最低振动能级再跃迁回到基态，产生波长一定的荧光长一定的荧光(如如 2 )。 第第4章章 分子发光光谱法分子发光光谱法4.1.5 影响荧光强度的因素影响荧光强度的因素第第4章章 分子发光光谱法分子发光光谱法4.1.5 影响荧光强度的因素影响荧光强度的因素-分子结构分子结构第第4章章 分子发光光谱法分子发光光谱法4.1.5 影响荧光强度的因素影响荧光强度的因素-分子结构分子结构（1）跃迁类型：）跃迁类型： * 的荧光效率高，系间跨越过的荧光效率高，系间跨越过程的速率常数小，有利于荧光的产生；程的速率常数小，有利于荧光的产生；（2）共轭效应：）共轭效应：提高共轭度有利于增加荧光效率并提高共轭

12、度有利于增加荧光效率并产生红移。产生红移。（3）刚性平面结构：）刚性平面结构：可降低可降低分子振动，减少与溶剂的相互分子振动，减少与溶剂的相互作用，故具有很强的荧光。如作用，故具有很强的荧光。如荧光素和酚酞有相似结构，荧荧光素和酚酞有相似结构，荧光素有很强的荧光，酚酞却没光素有很强的荧光，酚酞却没有。有。第第4章章 分子发光光谱法分子发光光谱法4.1.5 影响荧光强度的因素影响荧光强度的因素-分子结构分子结构（4）取代基效应：）取代基效应：第第4章章 分子发光光谱法分子发光光谱法4.1.5 影响荧光强度的因素影响荧光强度的因素-分子结构分子结构（4）取代基效应：）取代基效应：P316/表表14

13、.1第第4章章 分子发光光谱法分子发光光谱法4.1.5 影响荧光强度的因素影响荧光强度的因素-环境因素环境因素（1）溶剂的影响）溶剂的影响 除一般溶剂效应外，溶剂的极性、氢键、配位键的形除一般溶剂效应外，溶剂的极性、氢键、配位键的形成都将使化合物的荧光发生变化。成都将使化合物的荧光发生变化。第第4章章 分子发光光谱法分子发光光谱法4.1.5 影响荧光强度的因素影响荧光强度的因素-环境因素环境因素（1）溶剂的影响）溶剂的影响（2）温度的影响（）温度的影响（荧光强度对温度变化敏感）荧光强度对温度变化敏感）第第4章章 分子发光光谱法分子发光光谱法4.1.5 影响荧光强度的因素影响荧光强度的因素-环境

14、因素环境因素（1）溶剂的影响）溶剂的影响（2）温度的影响）温度的影响（3） 溶液溶液pH 对酸碱化合物，溶液对酸碱化合物，溶液pH的影响较大，需要严格控制；的影响较大，需要严格控制；（4）猝灭）猝灭 发光分子与溶剂或溶质分子之间所发生的导致发光发光分子与溶剂或溶质分子之间所发生的导致发光强度下降的物理或化学作用过程。强度下降的物理或化学作用过程。第第4章章 分子发光光谱法分子发光光谱法4.1.5 影响荧光强度的因素影响荧光强度的因素-环境因素环境因素（4）猝灭）猝灭 发光分子与溶剂或溶质分子之间所发生的导致发光强发光分子与溶剂或溶质分子之间所发生的导致发光强度下降的物理或化学作用过程。度下降的

15、物理或化学作用过程。 与发光分子相互作用而引起发光强度下降的物质，称与发光分子相互作用而引起发光强度下降的物质，称为猝灭剂（如氧为猝灭剂（如氧,一般需除氧）。一般需除氧）。 动态猝灭：猝灭剂与发光物质的激发态分子之间的相互作用动态猝灭：猝灭剂与发光物质的激发态分子之间的相互作用静态猝灭静态猝灭 ：猝灭剂与发光物质的基态分子之间的相互作用：猝灭剂与发光物质的基态分子之间的相互作用第第4章章 分子发光光谱法分子发光光谱法4.1.5 影响荧光强度的因素影响荧光强度的因素-环境因素环境因素（5）内滤作用和自吸现象）内滤作用和自吸现象自吸现象自吸现象：化合物的荧光发射光谱的短波长端与其吸收光谱化合物的荧

16、光发射光谱的短波长端与其吸收光谱 的长波长端重叠，产生自吸收；如蒽化合物。的长波长端重叠，产生自吸收；如蒽化合物。内滤作用内滤作用：溶液中含有能吸收激发光或荧光物质发射的荧光溶液中含有能吸收激发光或荧光物质发射的荧光, 如如色胺酸中的重铬酸钾；色胺酸中的重铬酸钾；第第4章章 分子发光光谱法分子发光光谱法4.2 分子荧光光谱仪分子荧光光谱仪激发光源：氙激发光源：氙灯和高压汞灯，染料激光器灯和高压汞灯，染料激光器(可见与紫外区可见与紫外区)样品池：石英池样品池：石英池双单色器系统：双单色器系统：激发单色器（选择激发光波长）；激发单色器（选择激发光波长）； 发射单色器（选择发射光发射单色器（选择发射

17、光(测量测量)波长）波长）检测器：检测器：光电倍增管。光电倍增管。 第第4章章 分子发光光谱法分子发光光谱法4.3 分子荧光光谱法的应用分子荧光光谱法的应用（1 1）灵敏度高）灵敏度高 比紫外比紫外- -可见分光光度法高可见分光光度法高2 24 4个数量级个数量级 检测下限：检测下限：0.10.10.0010.001 g/cmg/cm3 3（2 2）选择性强）选择性强 既可依据特征发射光谱，又可根据特征吸收光谱；既可依据特征发射光谱，又可根据特征吸收光谱；（3 3）试样量少）试样量少 缺点缺点：应用范围小。应用范围小。第第4章章 分子发光光谱法分子发光光谱法4.3.1 荧光定量分析荧光定量分析

18、荧光强度荧光强度 If正比于吸收的光量正比于吸收的光量Ia和荧光量子效率和荧光量子效率 ： If = Ia 由朗由朗-比耳定律：比耳定律： Ia = I0(1-10- b c ) If = I0(1-10- b c ) = I0(1-e-2.303 b c ) 浓度很低时，将括号项近似处理后：浓度很低时，将括号项近似处理后： If = 2.303 I0 b c = Kc4.3.1.1 荧光强度与浓度的基本关系式荧光强度与浓度的基本关系式第第4章章 分子发光光谱法分子发光光谱法4.3.1.2 单组分的荧光直接测定和间接测定单组分的荧光直接测定和间接测定1. 直接测定法直接测定法 要求被分析物本身

19、具有荧光。要求被分析物本身具有荧光。 通常采用相对测量方法，如工作曲线法。通常采用相对测量方法，如工作曲线法。 每次测绘工作曲线最好用同一种稳定的荧光物质校每次测绘工作曲线最好用同一种稳定的荧光物质校准仪器的读数。准仪器的读数。2. 间接测定法间接测定法 被分析物本身不发荧光，或者因荧光量子产率太低被分析物本身不发荧光，或者因荧光量子产率太低而无法进行直接测定，便只能采用间接测定的办法。而无法进行直接测定，便只能采用间接测定的办法。 如：光衍生法、荧光猝灭法、敏化荧光法等如：光衍生法、荧光猝灭法、敏化荧光法等第第4章章 分子发光光谱法分子发光光谱法4.3.1.2 单组分的荧光直接测定和间接测定

20、单组分的荧光直接测定和间接测定(1)(1)无机化合物无机化合物 与有机试剂配合物后测量；可测量约与有机试剂配合物后测量；可测量约6060多种元素。多种元素。 铍、铝、硼、镓、硒、镁、稀土常采用荧光分析法；铍、铝、硼、镓、硒、镁、稀土常采用荧光分析法； 氟、硫、铁、银、钴、镍采用荧光熄灭法测定；氟、硫、铁、银、钴、镍采用荧光熄灭法测定； 铜、铍、铁、钴、锇及过氧化氢采用催化荧光法测定；铜、铍、铁、钴、锇及过氧化氢采用催化荧光法测定； 铬、铌、铀、碲采用低温荧光法测定；铬、铌、铀、碲采用低温荧光法测定； 铈、铕、锑、钒、铀采用固体荧光法测定铈、铕、锑、钒、铀采用固体荧光法测定(2)(2)生物与有机

21、化合物的分析（生物与有机化合物的分析（见表 ） 第第4章章 分子发光光谱法分子发光光谱法4.3.1.2 单组分的荧光直接测定和间接测定单组分的荧光直接测定和间接测定第第4章章 分子发光光谱法分子发光光谱法4.3.1.2 单组分的荧光直接测定和间接测定单组分的荧光直接测定和间接测定第第4章章 分子发光光谱法分子发光光谱法4.3.1.3 多组分的荧光测定多组分的荧光测定第第4章章 分子发光光谱法分子发光光谱法4.4 磷光光谱法磷光光谱法 磷光发射磷光发射： T1 S0跃迁跃迁； S0 激发激发振动弛豫振动弛豫内转换内转换 系间跨越系间跨越振动弛豫振动弛豫 T1 发光速度很慢：发光速度很慢： 10-

22、310 s 光照停止后，可持续一段时间光照停止后，可持续一段时间 荧光发射：荧光发射： S1 S0跃迁；跃迁； 10-710 -9 s 第第4章章 分子发光光谱法分子发光光谱法4.4.1 低温磷光低温磷光 由于三重态寿命较长，为减小非辐射失活过程的影响，由于三重态寿命较长，为减小非辐射失活过程的影响，通常应在低温条件下测量磷光。通常应在低温条件下测量磷光。 液氮液氮是最常用的冷却剂，因而要求所使用的溶剂在液氮是最常用的冷却剂，因而要求所使用的溶剂在液氮温度下应具有足够的黏度并能形成明净的刚性玻璃体，且对温度下应具有足够的黏度并能形成明净的刚性玻璃体，且对分析物具有良好的溶解特性，在所研究的光谱

23、区内没有很强分析物具有良好的溶解特性，在所研究的光谱区内没有很强的吸收和发射，并容易制备和提纯。的吸收和发射，并容易制备和提纯。 第第4章章 分子发光光谱法分子发光光谱法4.4.2 室温磷光室温磷光 固态基质表面室温磷光分析固态基质表面室温磷光分析：分析物通过物理吸附或某种：分析物通过物理吸附或某种化学作用力被束缚在固体基质表面，增大了刚性，减小了碰化学作用力被束缚在固体基质表面，增大了刚性，减小了碰撞失活的概率，在严格干燥试样的情况下限制了氧的猝灭作撞失活的概率，在严格干燥试样的情况下限制了氧的猝灭作用，显示室温磷光。用，显示室温磷光。 胶束稳定的室温磷光分析：胶束稳定的室温磷光分析：磷光体

24、进入表面活性剂的胶磷光体进入表面活性剂的胶束溶液中，微环境和定向约束力发生变化，减小内转化和碰束溶液中，微环境和定向约束力发生变化，减小内转化和碰撞能量损失等非辐射失活过程概率，明显增大三重态的稳定撞能量损失等非辐射失活过程概率，明显增大三重态的稳定性，使磷光强度显著增大。性，使磷光强度显著增大。 敏化室温磷光分析敏化室温磷光分析第第4章章 分子发光光谱法分子发光光谱法4.4.3 磷光分析仪磷光分析仪 荧光计上配上磷光测量附件即可对磷光进行测量。在有荧光计上配上磷光测量附件即可对磷光进行测量。在有荧光发射的同时测量磷光。荧光发射的同时测量磷光。 测量方法：测量方法：（1 1）通常借助于荧光和磷

25、光寿命）通常借助于荧光和磷光寿命的差别，采用磷光镜的装置将荧光的差别，采用磷光镜的装置将荧光隔开。隔开。（2 2）采用脉冲光源和可控检测及）采用脉冲光源和可控检测及时间分辨技术。时间分辨技术。 室温测量时，不需要杜瓦瓶。室温测量时，不需要杜瓦瓶。第第4章章 分子发光光谱法分子发光光谱法4.4.4 磷光分析的应用磷光分析的应用第第4章章 分子发光光谱法分子发光光谱法4.4.4 磷光分析的应用磷光分析的应用第第4章章 分子发光光谱法分子发光光谱法4.5 化学发光分析化学发光分析 化学发光是由化学发光是由化学反应化学反应提供的能量激发物质所产生的光提供的能量激发物质所产生的光辐射。生物发光是指产生于

26、生物体系中的化学发光。基于这辐射。生物发光是指产生于生物体系中的化学发光。基于这类发光现象的分析方法，称为化学发光（或生物发光）分析类发光现象的分析方法，称为化学发光（或生物发光）分析法。法。 优点：优点：(1). 灵敏度很高。灵敏度很高。(2). 仪器设备简单，无须光源仪器设备简单，无须光源和单色器，因而也消除了散射光和杂散光的干扰；和单色器，因而也消除了散射光和杂散光的干扰；(3). 线性线性范围宽；范围宽；(4). 分析速度快。分析速度快。 局限：局限：目前可供应用的发光体系尚有限，发光机理有待目前可供应用的发光体系尚有限，发光机理有待进一步研究，方法的选择性有待进一步提高。进一步研究，

27、方法的选择性有待进一步提高。 第第4章章 分子发光光谱法分子发光光谱法 在化学反应过程中，某些化合物接受能量而被激发，从激在化学反应过程中，某些化合物接受能量而被激发，从激发态返回基态时，发射出一定波长的光。发态返回基态时，发射出一定波长的光。 A +B = C + D* D* D + h （1）能够发光的化合物大多为有机化合物，芳香族化合物；）能够发光的化合物大多为有机化合物，芳香族化合物；（2）化学发光反应多为氧化还原反应，激发能与反应能相当）化学发光反应多为氧化还原反应，激发能与反应能相当 E=170300 kJ/mol；位于可见光区；位于可见光区；（3）发光持续时间较长，反应持续进行；

28、发光持续时间较长，反应持续进行； 化学发光反应存在于生物体化学发光反应存在于生物体(萤火虫、海洋发光生物萤火虫、海洋发光生物)中，中，称生物发光称生物发光(bioluminescence)。4.5.1 化学发光分析原理化学发光分析原理第第4章章 分子发光光谱法分子发光光谱法4.5.2 化学发光反应类型化学发光反应类型1. 直接化学发光直接化学发光A +B = C * + D C * C + h 第第4章章 分子发光光谱法分子发光光谱法4.5.2 化学发光反应类型化学发光反应类型2. 间接化学发光间接化学发光第第4章章 分子发光光谱法分子发光光谱法4.5.2 化学发光反应类型化学发光反应类型3. 液相化学发光液相化学发光 发光试剂：鲁米诺（发光试剂：鲁米诺（3-氨基