限制性内切酶原理

1、IIII型限制酶型限制酶限制酶的定义1 限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶是可以识别DNA的特异序列，并在识别位点或其周围切割双链DNA的一类内切酶，简称限制酶限制酶。限制酶在基因工程中广为使用。 限制性核酸内切酶分布极广，几乎在所有细菌的属、种中都发现至少一种限制性内切酶。细菌通过自身的限制酶，破坏入侵的外源破坏入侵的外源DNA，从而保护自身。 30多年前，当人们在对噬菌体的宿主特异性的限制-修饰现象进行研究时，首次发现了限制性内切酶。细菌可以抵御新病毒的入侵，而这种“限制”病毒生存的办法则可归功于细胞内部可摧毁外源摧毁外源DNADNA的限制性内切酶。首批被发现的限制性内切酶包括来源于大肠杆菌

2、大肠杆菌的EcoR IEcoR I和EcoR EcoR IIII，以及来源于流感嗜血杆菌（流感嗜血杆菌（Haemophilus influenzae）的Hind IIHind II和Hind IIIHind III。这些酶可在特定位点切开DNA，产生可体外连接的基因片段。限制酶的发现命名EcoR IEscherichia属名属名Coli种名种名Ry13株系株系编号编号切割频率 切割频率是指某限制性核酸内切酶在DNA分子中预期的切割概率预期的切割概率。可以估算该限制性核酸内切酶在某种DNA分子中的切点数切点数。 前提是：假定假定DNADNA的碱基组成是均一的、的碱基组成是均一的、碱基排列在碱基排

3、列在DNADNA分子上是随机分布的分子上是随机分布的。这样每个位点上，每一种碱基出现的概率即为1/41/4 。 如果某限制性核酸内切酶的识别序列是6 bp，则其切割频率为(1/4)6 =1/4096，即每隔4.1kb就可能有一个切割点。当识别序列为n个 bp， 则其切割频率为（1/4）n 。限制酶的种类2I I型限制酶型限制酶 通常其切割位点与识别位点相距千个碱基, 不能准确定位切割位点。例如：EcoB、EcoK。IIII型限制酶型限制酶 所识别的序列多为短的回文序列回文序列，切割位点与识别位点一致。是基因工程上，实用性较高的限制酶种类。例如：EcoRI、HindIII。IIIIII型限制酶型

4、限制酶 切割位点与识别位点相距24-26个碱基，不能准确定位切割位点。例如：EcoPI、HinfIII。什么是回文序列？GAATTAAGC TTAATTCGAATATTCCTTATAAGIIII型限制酶型限制酶ApaI 识别序列：识别序列： 5GGGCCC 3 BamHI 识别序列：识别序列： 5 GGATCC 3 BglII 识别序列：识别序列： 5 AGATCT 3 EcoRI 识别序列：识别序列： 5 GAATTC 3 HindIII 识别序列：识别序列： 5 AAGCTT 3 KpnI 识别序列：识别序列： 5 GGTACC 3 NcoI 识别序列：识别序列： 5 CCATGG 3 N

5、deI 识别序列：识别序列： 5 CATATG 3 NheI 识别序列：识别序列： 5 GCTAGC 3 NotI 识别序列：识别序列： 5 GCGGCCGC 3 SacI 识别序列：识别序列： 5 GAGCTC 3 SalI 识别序列：识别序列： 5 GTCGAC 3 SphI 识别序列：识别序列： 5 GCATGC 3 XbaI 识别序列：识别序列： 5 TCTAGA 3 XhoI 识别序列：识别序列： 5 CTCGAG 3 II型限制酶切割DNA后形成粘性末端粘性末端或平末端平末端分别由错位切和平切错位切和平切形成。能形成粘性末端的酶在基因工程中应用最多。粘性末端和平末端 5NNN NN

6、N33NNNNNN 5 5NNN NNN33NNNNNN5 5粘性末端和3粘性末端5NN NN33NNNN 5 5NNN NNN33NNNNNN5 5粘性末端3粘性末端5NNNN33NNNN 5 5NNNN33NNNN 5 同尾酶 切割不同不同的DNA片段但产生相同相同的粘性末端的一类限制性内切酶。 同裂酶 有一些来源不同的限制酶识别的是同样的核苷酸靶子序列，这类酶称为同裂酶。识别序列和切割位点都相同的叫同序同切酶同序同切酶，识别序列相同但切割位点不同的叫同序异切酶同序异切酶。例如：Hpa和MspI为同序同裂酶（CCGG）。XmaI和SmaI为同序异裂酶，都识别CCCGGG，但Xma I的切点

7、在CCCGGG，形成带有CCGG的粘性末端；而Sma I的切点则在CCCGGG，形成平末端。有些限制酶识别的序列不是回文序列不是回文序列。 Acc 的识别切割位点分别是GTAGAC 和 GTCTACBbvC 的识别切割位点分别为CCTCAGC和GGAGTCG特殊的II型限制酶GTATCGACCATAGCTGCCTCAGCGGAGTCG1) DNA1) DNA的纯度的纯度2) DNA2) DNA的甲基化程度的甲基化程度3) 3) 酶切消化反应的温度酶切消化反应的温度4) DNA4) DNA的分子结构的分子结构5) 5) 限制性核酸内切酶的缓冲液限制性核酸内切酶的缓冲液6) 6) StarStar

8、活性（星活性）活性（星活性）影响限制性酶活性的因素 限制酶消化DNA底物的反应效率，很大程度上取决于所使用的DNA的纯度纯度。DNA制剂中的含有蛋白质、酚、氯仿、酒精、EDTA、SDS以及高浓度的盐离子等都有可能抑制限制酶的活性。 提高限制酶对低纯度低纯度DNA的反应效率，一般采用三种方法： 增加限制酶的用量。增加限制酶的用量。 扩大酶催化反应的体积。扩大酶催化反应的体积。（以使潜在的抑制因素被相应地稀释） 延长酶催化反应的保温时间。延长酶催化反应的保温时间。DNADNA的纯度的纯度DNADNA的甲基化程度的甲基化程度 识别序列中特定核苷酸的甲基化作用，会严重影响酶的催化效率。 为避免这样的问

9、题，在基因克隆中使用的质粒DNA是从失去甲基化酶的大肠杆菌菌株中提取的。酶切消化反应的温度酶切消化反应的温度 不同的限制酶具有不同的最适反应温度。大多数核酸内切限制酶的标准反应温度是37，有些核酸内切限制酶的最适反应温度低于标准的37，SmaI是25、ApaI是30；有些高于标准的37，例如MaeI是45、BclI是50、MaelII是55。DNA的分子结构的分子结构 DNA分子的不同构型对限制酶的催化效率也有很大的影响。某些限制酶切割超螺旋的质粒DNA或病毒DNA所需要的酶量，要比消化线性DNA的高出许多倍，最高的可达20倍。核酸内切限制酶的缓冲液核酸内切限制酶的缓冲液II型限制酶的最适pH

10、一般是6-8, 缓冲液中通常含有Mg2+。Star活性（星活性）活性（星活性） 限制酶在一些特定条件下使用时，识别位点的特异性降低特异性降低，可以把不同于正常识别的序列切断，这个现象叫Star活性。Star活性出现的频率，根据酶、底物DNA、反应条件的不同而不同。 Star活性主要受低粒子强度、高pH值以及过高的甘油浓度的影响。 消化DNA样品后，需要钝化内切酶的活性，终止反应。方法：1）65温浴5-10分钟，使酶失活。2）加入EDTA除去酶分子的镁离子，是使酶失活。3）加SDS或者尿素使酶解聚沉淀。4）用等体积的酚抽提酶解产物，提取DNA。限制性内切酶反应的终止限制性内切酶的保存限制酶于-2

11、0用50的甘油保存。 基因工程中常用的工具酶有限制酶限制酶、DNA聚合酶聚合酶、DNA连接酶连接酶、逆转录酶逆转录酶、碱性磷酸酶碱性磷酸酶、末端末端转移酶转移酶、甲基化酶甲基化酶。 型限制酶在基因工程中的的应用3 将目的基因导入受体细胞前，需要用相同相同的限制酶将目的基因和载体切成相同的粘性末端，再通过碱基互补配对的方式，在连接酶的作用下，目的基因和载体完成连接。最后将连接好的重组载体导入细胞。 NNAAGCTTNN NNGGATCCNNN NNTTCG AANN NNCCTAGGNNN HindIIIBamHIHindIIIBamHI双酶切法AGCTTNN NNG ANN NNCCTAG为什

12、么通常要用两种限制酶？可以有效防止载体自连造成空载体。可以有效防止载体自连造成空载体。HindIIIBamHI连接酶可不可以用一种酶切割目的基因和载体？ 可以，此时切割后的载体载体需要加入碱性磷酸酶处理。碱性磷酸酶处理。碱性磷酸酶可以去除去除酶切后切口的磷酸磷酸，从而使粘性末端在加入连接酶后不能重新结合。5NNN NNN33NNNNNN 5 5NNN NNN33NNNNNN5 5NNN NNN33NNNNNN5 碱性磷酸酯酶碱性磷酸酯酶单酶切法pAGCTTNN NNA-OH HO-ANN NNTTCGAp DNA连接酶 基因工程中，很多情况下，基因组中靠近目的基因两侧的碱基并没有没有合适的酶切

13、位点。怎么办？Hsp70A ：Ex-F5 CGCCATATGCCAGCTATCGGAATCGATTTGG 3 Nde IHsp70A ：Ex-R5 GCGGCCGCATAAAGGTGGGGAGAGCTTACAAC3 Not I 通常是设计合适的PCRPCR引物引物，让目的基因在PCR扩增后，两侧含有酶切位点。 DNA甲基化酶4甲基化酶：可以从活性甲基化合物(如S-腺苷甲硫氨酸)上将其甲基转移到其他化合物的酶。可形成各种甲基化合物，或是对某些蛋白质或核酸等进行化学修饰形成甲基化产物。 DNA甲基化酶：以S-腺苷甲硫氨酸为甲基供体，将甲基转移到DNA特定的碱基特定的碱基上的过程。 原核生物的甲基化酶是作为限制与修饰系统中的一员，用于保护宿主 DNA 不被相应的限制酶所切割。 Dam甲基化酶在 GATC 序列中的腺嘌呤上引入甲基。一些限制酶（如BamH、Bcl、Sau3A等）的识别位点中含 GATC 序列。 有些限制酶对Dam甲基化的DNA 敏感，不能切割相应的序列，如 Bcl。有些限制酶对Dam甲基化的DNA不敏感，如 BamH、Sau3A等。甲基化酶对限制酶的影响：1.修饰酶切位点。 构建 DNA