微生物的分离与纯化技术()

1、实验七实验七 微生物的分离与纯化技术微生物的分离与纯化技术 n土壤是微生物生活的大本营，它所含微生物无土壤是微生物生活的大本营，它所含微生物无论是数量还是种类都是极其丰富的。因此土壤论是数量还是种类都是极其丰富的。因此土壤是微生物多样性的重要场所，是发掘微生物资是微生物多样性的重要场所，是发掘微生物资源的重要基地，可以从中分离、纯化得到许多源的重要基地，可以从中分离、纯化得到许多有价值的菌株。有价值的菌株。n一般土壤中，细菌最多，放线菌及霉菌次之，一般土壤中，细菌最多，放线菌及霉菌次之，而酵母菌主要见于果园及菜园土壤中。而酵母菌主要见于果园及菜园土壤中。 n从混杂微生物群体中获得只含某一种或某

2、一株微从混杂微生物群体中获得只含某一种或某一株微生物的过程称为微生物的生物的过程称为微生物的分离与纯化分离与纯化。n平板分离法平板分离法普遍用于微生物的分离与纯化。普遍用于微生物的分离与纯化。n基本原理基本原理是选择适合于待分离微生物生长的条件，是选择适合于待分离微生物生长的条件，如营养成分、酸碱度、温度和氧的要求，或加入如营养成分、酸碱度、温度和氧的要求，或加入某种抑制剂造成只利于该微生物生长，而抑制其某种抑制剂造成只利于该微生物生长，而抑制其它微生物生长的环境，从而淘汰一些不需要的微它微生物生长的环境，从而淘汰一些不需要的微生物。生物。一、实验目的和内容一、实验目的和内容目的：目的： 学习

3、从土壤中分离微生物的方法，学习从土壤中分离微生物的方法， 学习无菌操作技术。学习无菌操作技术。内容：内容： 1 1 培养基的配制及相关物品的灭菌；培养基的配制及相关物品的灭菌； 2 2 用稀释法从土壤中分离微生物；用稀释法从土壤中分离微生物； 用平板划线方法分离微生物用平板划线方法分离微生物 二、实验材料和用具二、实验材料和用具n牛肉膏蛋白胨固体培养基、高氏牛肉膏蛋白胨固体培养基、高氏1号固体培号固体培养基，土豆蔗糖固体培养基，养基，土豆蔗糖固体培养基，99mL无菌水无菌水(带玻璃珠带玻璃珠) ，9mL无菌水，无菌水，10%酚液，土酚液，土壤样品壤样品n无菌培养皿、无菌培养皿、1mL无菌移液管

4、、天平、称无菌移液管、天平、称量纸、药勺、试管架量纸、药勺、试管架n高压灭菌锅高压灭菌锅三、操作步骤三、操作步骤（一）（一） 固体培养基的配制固体培养基的配制（人一组）（人一组）l 称量和溶解称量和溶解 2pH调节、分装（三角瓶）调节、分装（三角瓶） 、包扎、包扎。3. 灭菌灭菌(二二) 土壤稀释分离土壤稀释分离（人一组）（人一组）1取土壤取土壤 取表层以下取表层以下510cm处的土样，放入无菌的袋处的土样，放入无菌的袋或瓶中备用，或放在或瓶中备用，或放在4冰箱中暂存。冰箱中暂存。2制备稀释液制备稀释液(要要无菌操作无菌操作) (1)准备准备三角瓶装三角瓶装99mL水（加玻璃珠），水（加玻璃珠

5、），1只；只； 试管装试管装4.5mL无菌水，；无菌水，； 包扎、灭菌包扎、灭菌 角匙一只角匙一只（2）制备土壤悬液：）制备土壤悬液： 无菌角匙无菌角匙称土样称土样1g，迅速倒入带玻璃珠的，迅速倒入带玻璃珠的99mL无无菌水瓶中菌水瓶中(玻璃珠用量玻璃珠用量10粒左右粒左右)，振荡，振荡510min，使土样充分打散，即成为使土样充分打散，即成为10-2的土壤悬液。的土壤悬液。u在每根无菌移液管的报纸套上做好标记，如在每根无菌移液管的报纸套上做好标记，如10-3 、10-4 、10-5。u无菌移液管用前从中间拆开报纸套，取出移液管，无菌移液管用前从中间拆开报纸套，取出移液管，用后再插回报纸用后再

6、插回报纸套，保护移液管尖端套，保护移液管尖端。u每次每次吸取土液吸取土液，要将移液管插入液面，以口吹吸，要将移液管插入液面，以口吹吸3次，每次吸上的液次，每次吸上的液面要高于前一次，以减少稀释中的误差。面要高于前一次，以减少稀释中的误差。u放土液放土液操作时移液管尖不能接触下一稀释度液体的液面，每一个稀操作时移液管尖不能接触下一稀释度液体的液面，每一个稀释度换用一支移液管。释度换用一支移液管。(3)稀释：稀释： 用无菌移液管吸用无菌移液管吸10-2的土壤悬液的土壤悬液1mL，放入，放入9mL无菌水中即为无菌水中即为10-3稀释液，如此重复，可依次制成稀释液，如此重复，可依次制成10-310-的

7、稀释液。的稀释液。3.平板接种培养平板接种培养 3.1稀释倾注平板法稀释倾注平板法 (混菌混菌)u细菌细菌: 取取10-6、10-7两管稀释液各两管稀释液各1mL，分别接入相应标号的平皿，每个稀，分别接入相应标号的平皿，每个稀释度接两个平皿。释度接两个平皿。取冷却至取冷却至50（以不烫手为宜）（以不烫手为宜）的的牛肉膏蛋白胨培养基牛肉膏蛋白胨培养基，分别倒入以上，分别倒入以上培养皿中培养皿中(装量以铺满皿底为宜，约装量以铺满皿底为宜，约10-15ml)，迅速摇动平皿，使菌液，迅速摇动平皿，使菌液与培养基充分混匀，但不沾湿皿的边缘，待琼脂凝固即成细菌平板。与培养基充分混匀，但不沾湿皿的边缘，待琼

8、脂凝固即成细菌平板。 倒平板时要注意倒平板时要注意无菌操作。无菌操作。u放线菌放线菌 取取10-4、10-5两管稀释液各两管稀释液各1mL，分别接入相应标号的平皿，每个稀释度接，分别接入相应标号的平皿，每个稀释度接两个平皿。两个平皿。 取冷却至取冷却至50（以不烫手为宜）（以不烫手为宜）的的高氏高氏1号培养基号培养基（添加（添加10%酚数滴）酚数滴），分别倒入以上培养皿中分别倒入以上培养皿中(装量以铺满皿底为宜，约装量以铺满皿底为宜，约10-15mL)，迅速摇动，迅速摇动平皿，使菌液与培养基充分混匀，但不沾湿皿的边缘，待琼脂凝固即成平皿，使菌液与培养基充分混匀，但不沾湿皿的边缘，待琼脂凝固即成

9、放线菌平板。放线菌平板。u 霉菌霉菌取取10-4、10-5两管稀释液各两管稀释液各1ML，分别接入相应标号的平皿，每个稀释度接，分别接入相应标号的平皿，每个稀释度接两个平皿两个平皿 取冷却至取冷却至50（以不烫手为宜）（以不烫手为宜）的的土豆蔗糖培养基土豆蔗糖培养基，分别倒入以上培养，分别倒入以上培养皿中皿中(装量以铺满皿底为宜，约装量以铺满皿底为宜，约10-15mL)，迅速摇动平皿，使菌液与培，迅速摇动平皿，使菌液与培养基充分混匀，但不沾湿皿的边缘，待琼脂凝固即成霉菌平板。养基充分混匀，但不沾湿皿的边缘，待琼脂凝固即成霉菌平板。n倒平板的方法：右手持盛培养基的试管或三角瓶置火焰倒平板的方法：

10、右手持盛培养基的试管或三角瓶置火焰旁边，用右手将试管塞或瓶塞轻轻地拨出，试管或瓶口旁边，用右手将试管塞或瓶塞轻轻地拨出，试管或瓶口保持对着火焰；然后左手拿培养皿并将皿盖在火焰附近保持对着火焰；然后左手拿培养皿并将皿盖在火焰附近打开一缝，迅速倒入培养基约打开一缝，迅速倒入培养基约10mL，加盖后轻轻摇动，加盖后轻轻摇动培养皿，使培养基均匀分布在培养皿底部，然后培养皿，使培养基均匀分布在培养皿底部，然后平置于平置于桌面上，待凝后即为平板。桌面上，待凝后即为平板。3.2 平板划线分离法。平板划线分离法。u倒平板倒平板 按无菌操作要求，在火焰旁操作，倒固体培养基平板。按无菌操作要求，在火焰旁操作，倒固

11、体培养基平板。u划线分离划线分离 使用接种环，使用接种环， 挑取挑取-土壤悬液，在平板中划线分离。土壤悬液，在平板中划线分离。 划线的方法多样，目的是划线的方法多样，目的是获得单个菌落获得单个菌落。n用接种环以无菌操作挑取用接种环以无菌操作挑取-土壤悬土壤悬液，先在平板培养基的一边作第一次平液，先在平板培养基的一边作第一次平行划线行划线34条，再转动培养皿约条，再转动培养皿约70度角，度角，并将并将接种环上剩余物烧掉接种环上剩余物烧掉，待冷却后通待冷却后通过第一次划线部分作第二次平行划线，过第一次划线部分作第二次平行划线，再用同样的方法通过第二次划线部分作再用同样的方法通过第二次划线部分作第三

12、次划线。第三次划线。 掌握好力度，不要划破培养基。掌握好力度，不要划破培养基。4培养培养 将接种好的平板将接种好的平板倒置倒置，即皿盖朝下放置，即皿盖朝下放置，(可减少可减少培养基水分蒸发、可减少污染培养基水分蒸发、可减少污染)，培养细菌：培养细菌：37，恒温培养箱中培养，恒温培养箱中培养12d。培养放线菌：培养放线菌：28，恒温培养箱中培养，恒温培养箱中培养35d。培养霉菌：培养霉菌：28，恒温培养箱中培养，恒温培养箱中培养35d。四、结果四、结果观察从土壤稀释分离的微生物观察从土壤稀释分离的微生物菌落菌落 注意事项注意事项1. 称药品称药品天平用完要及时关毕天平用完要及时关毕。2.土壤稀释

13、分离土壤稀释分离注意无菌操作注意无菌操作（酒精灯）（酒精灯）制备土壤悬液时注意温度不能太高。制备土壤悬液时注意温度不能太高。3. 倒平板倒平板u温度温度 （50度左右，不烫手为宜，温度太低琼脂凝固；温度太高会烫死培养度左右，不烫手为宜，温度太低琼脂凝固；温度太高会烫死培养物）物）u装量装量 (以铺满皿底为宜，约以铺满皿底为宜，约10-15mL)，太少铺不满，铺不平整，而且如果，太少铺不满，铺不平整，而且如果培养时间长，则容易干裂；太多浪费。培养时间长，则容易干裂；太多浪费。u 平板表面应平整平板表面应平整 u 混菌法倒平板与平板划线法倒平板不同：混菌法倒平板与平板划线法倒平板不同：混菌法倒平板

14、前先加混菌法倒平板前先加1ml土壤稀释液，再倒入培养基；土壤稀释液，再倒入培养基；平板划线法倒平板是先倒入培养基制成平板，再挑菌划线平板划线法倒平板是先倒入培养基制成平板，再挑菌划线4.划线划线时，掌握好力度，不要划破培养基。时，掌握好力度，不要划破培养基。5.剩余的培养基不能倒入水槽，以防填塞。剩余的培养基不能倒入水槽，以防填塞。6.各种器皿用完各种器皿用完及时清洗及时清洗。7.玻璃珠、皮筋、报纸玻璃珠、皮筋、报纸等用完回收等用完回收值日生值日生负责负责u高压灭菌锅灭菌时的看守工作。高压灭菌锅灭菌时的看守工作。在斜面试管上用记号笔标明待接种的在斜面试管上用记号笔标明待接种的菌种名称、接种者和

15、日期（菌种名称、接种者和日期（eg:酵酵母母/0316/060315）。 双手用医用酒精消毒。双手用医用酒精消毒。点燃酒精灯或煤气灯。点燃酒精灯或煤气灯。 将菌种试管和待接种的斜面试管，用大拇指和食指、中指、无名指握在将菌种试管和待接种的斜面试管，用大拇指和食指、中指、无名指握在左手中，试管底部放在手掌内并将中指夹在两试管之间，使左手中，试管底部放在手掌内并将中指夹在两试管之间，使斜面向斜面向上成水平状态上成水平状态，在火焰边用右手松动试管塞以利于接种时拔出。，在火焰边用右手松动试管塞以利于接种时拔出。细菌斜面接种技术细菌斜面接种技术n右手拿接种环通过火焰烧灼灭菌右手拿接种环通过火焰烧灼灭菌

16、，在火焰边，在火焰边用右手的手掌边缘和小指，小指和无名指分别用右手的手掌边缘和小指，小指和无名指分别夹持棉塞夹持棉塞 ( 或试管帽或试管帽 ) 将其取出，并迅速烧灼将其取出，并迅速烧灼管口。取试管棉塞或试管帽时要缓慢拔出，不管口。取试管棉塞或试管帽时要缓慢拔出，不宜用力过猛。宜用力过猛。 n将灭菌的接种环伸入菌种试管内，先将环接触试管内将灭菌的接种环伸入菌种试管内，先将环接触试管内壁或未长菌的培养基，使接种环的温度下降达到冷却壁或未长菌的培养基，使接种环的温度下降达到冷却的目的，然后再挑取少许菌苔。将接种环退出菌种试的目的，然后再挑取少许菌苔。将接种环退出菌种试管，迅速伸入待接种的斜面试管，用

17、环在斜面上管，迅速伸入待接种的斜面试管，用环在斜面上由下由下往上做往上做S形划线形划线。不要将培养基划破，也不要使接种。不要将培养基划破，也不要使接种环接触壁或管口。环接触壁或管口。n接种环退出斜面试管，再用火焰烧灼管口，并接种环退出斜面试管，再用火焰烧灼管口，并在火焰边将试管塞上。在火焰边将试管塞上。 将接种环逐渐接近火将接种环逐渐接近火焰再烧灼，如果接种环上沾的菌体较多时，应焰再烧灼，如果接种环上沾的菌体较多时，应先将环在火焰边烤干，然后烧灼，以免未烧死先将环在火焰边烤干，然后烧灼，以免未烧死的菌种飞溅出污染环境，接种病原菌时更要注的菌种飞溅出污染环境，接种病原菌时更要注意此点。意此点。超

18、净工作台 工作原理工作原理：鼓风机驱动空气通过高效过滤器得以：鼓风机驱动空气通过高效过滤器得以净化，净化的空气被徐徐吹过台面空间而将其净化，净化的空气被徐徐吹过台面空间而将其中的尘埃、细菌甚至病毒颗粒带走，使工作区中的尘埃、细菌甚至病毒颗粒带走，使工作区构成无菌环境。构成无菌环境。超净台的使用与保养超净台的使用与保养：使用前最好开启超净台内使用前最好开启超净台内紫外灯照射紫外灯照射1030分分钟钟，然后让超净台预工作，然后让超净台预工作1015分钟，以除去分钟，以除去臭氧和使用工作台面空间呈净化状态；臭氧和使用工作台面空间呈净化状态；使用完毕后，要用使用完毕后，要用70%酒精将台面和台内四周酒

19、精将台面和台内四周擦拭干净，以保证超净台无菌。擦拭干净，以保证超净台无菌。还要定期用福尔马林熏蒸超净台还要定期用福尔马林熏蒸超净台n划线分离法操作录像n无菌操作接种操作录像1、菌落（、菌落（colony） 单个微生物在适宜的固体培养基单个微生物在适宜的固体培养基表面或内部生表面或内部生长长、繁殖到一定程度可以形成、繁殖到一定程度可以形成肉眼可见的肉眼可见的、有、有一定形态结构一定形态结构的子细胞生长群体，称为的子细胞生长群体，称为菌落菌落。当固体培养基表面众多菌落连成一片时，便成当固体培养基表面众多菌落连成一片时，便成为为菌苔菌苔(1awn) 。n菌落的观察菌落的观察2、菌落特征、菌落特征 各种细菌在一定条件下形成的菌落具有一各种细菌在一定条件下形成的菌落具有一定的定