食品微生物学教学教材

1、食品微生物学微生物实验室技术性管理微生物实验室技术性管理l实验室环境实验室环境l实验室设备实验室设备l培养基与试剂培养基与试剂l标准菌株标准菌株l实验室安全实验室安全实验室环境实验室环境l总原则：环境不影响检测结果准确性l实验室面积与工作量匹配l实验室区域与办公区域分开l单方向工作流程，避免交叉污染l卫生指标项目：洁净工作台和洁净室l致病菌分离鉴定：生物二级实验室（biosafety level 2 BLS-2）实验室设备实验室设备l设备配置与检测量和检测类型相适应（例如：粪大肠菌群44.50.2）l检测设备放置在适宜条件下(显微镜)，便于维护、清洁、消毒与校准，并保持整洁与良好的工作状态l定

2、期进行检查和检定（加贴标识）、维护保养，应有日常监控和使用记录高压灭菌器高压灭菌器l每次灭菌时，放置的物品不宜过于拥挤，物品之间应留用一定空间；最好使用不同的高压灭菌器消毒培养基和实验后废弃物l每次灭菌时，应对灭菌效果进行监控并记录：l每次使用应记录灭菌温度及时间；l每周检查清洁排气滤网、密封阀等；l清洁内部,去除水的沉淀物或培养基,使用去离子水；l操作前接受专门培训l每年进行一次检定；定期对灭菌效果进行验证：l化学指示胶带化学指示胶带; ;l生物指示剂：湿热脂肪杆菌生物指示剂：湿热脂肪杆菌均质器均质器l每次使用后进行清理，保洁；l每次使用时注意保持均质袋的密封l确保使用无菌的均质袋，定期对无

3、菌袋进行无菌检查冰箱和冰柜冰箱和冰柜l对于存放样品和标准菌株的冰箱和冰柜，每天进行温度核查并记录l分区存放l每半年至少进行一次冰箱和冰柜除霜、清洁和消毒培养基与试剂培养基与试剂l可参照GB/T4789.28规定执行l编制关键培养基和试剂质量控制程序：l明确那些培养基和试剂是关键试剂，应进行技术性验收（选择性固体培养基、血平板、诊断学清、抗生素、生化鉴定管）l规定验收的方法（标准菌株划线接种，菌落特征；标准菌株进行玻片凝集试验；抑菌试验；标准菌株接种生化管观察反应现象）l规定判定标准l以上技术性验收试验需编制相应记录表格进行记录（每批进行）；l例：培养基质量控制程序举例（商业培养基与自制培养基）

4、菌株菌株 编制菌株管理程序：l购置要求l验证和评估试验方法l活化、传代方法，同时确认（生化鉴定），有相应记录l保存方法、条件并记录l工作菌株使用前确认，传代不超过5代。l使用记录l销毁记录（方法，时间，人员签字）l标识要求：名称、来源、标准号、接种日期、所传代数l编制标准（参照菌株一览表）l参考GB/T27045-2008附录A菌株保存方法菌株保存方法l方法1：甘油冻存法 置细胞冻存管中，加入终浓度为1520%的灭菌甘油，混匀，-80保存或冻干l方法2：-60-85玻璃珠保存法 该方法可以对菌株连续保存，非常实用，但与冻干保存比较，该方法在资金和能源上的消耗较大。 菌株保存方法菌株保存方法l使

5、用不同颜色的玻璃珠有助于菌株的辨别。使用时只需取出一粒玻璃珠，放入含有所需培养基的试管或培养瓶中培养。在常规的液体培养基（一般需氧菌为营养肉汤，厌氧菌为强化梭状芽孢杆菌培养基(RCM)，嗜盐菌为加盐营养肉汤培养基）中混入15的甘油得到需要的悬液培养基。l整套保存系统在市场上有售(如ProLab Diagnostics公司的Microbank系统)。实验室安全实验室安全l废弃物处置 编写废弃物处理指导书，对使用过的培养基分类进行处理，包括液体培养基、固体培养基、增菌培养基等l意外情况的处理（包括感染性物质溢洒、擦伤等） 编写微生物实验室应急处理规范，放于实验室内的醒目处2010微生物标准微生物标

6、准（剩余样品或同批样品不进行微生物复检剩余样品或同批样品不进行微生物复检）l菌落总数（GB 4789.2-2010）l大肠菌群（GB 4789.3-2010）l沙门氏菌（GB 4789.4-2010）l金黄色葡萄球菌（GB 4789.10-2010）l乳酸菌（GB 4789.35-2010）菌落总数主要区别：l修改了英文名称l修改了菌落总数计算公式中的解释l修改了培养基和试剂（删除了NaOH和HCl）l删除了第二法 测试片法2010lFood microbiological examination：Aerobic plate count(食品微生物学检验)2008lMicrobiologica

7、l examination of food hygiene:Aerobic plate count(食品卫生微生物学检验) 检样25g(或25mL)样品+225mL稀释液，均质10倍系列稀释选择23个适宜连续稀释度的样品均质液，各取1mL分别加入无菌培养皿内培养计数各平板菌落数361 计算菌落总数报告48h2h（水产特殊）大肠菌群大肠菌群主要区别：l修改了英文名称（同上）l第二法：平板计数法菌落选择范围改为15-150CFUl删除了第三法 测试片法第二法第二法 ：平板计数法：平板计数法 检样25g(或25mL)样品+225mL稀释液，均质10倍系列稀释选择23个适宜稀释度的样品均质液，接种VR

8、BA平板计数典型和可疑菌落361 18h24hBGLB肉汤或复发酵试验报告结果361 18h24h第二法第二法l典型菌落：l紫红色，菌落周围有红色的胆盐沉淀环，菌落直径为0.5mm或更大l选菌落数在15-150之间的平板,分别计数平板上出现的典型和可疑大肠菌群菌落。从平板上挑取10个不同类型的典型和可疑菌落，接种BGLB，凡BGLB肉汤管产气，可报告为阳性第二法第二法l大肠菌群数：l平板上菌落数阳性管数 10 稀释倍数l单位：CFU/g (CFU/mL)沙门氏菌沙门氏菌区别l修改了英文名称（同上）l修改了标准范围l修改了培养基试剂l修改了设备材料l修改了附录A范围范围2010l本标准规定了食品

9、中沙门氏菌（Salmonella）的检验方法l本标准适用于食品中沙门氏菌的检验2008l本标准规定了食品中沙门氏菌的检验方法l本标准适用于各类食品和食物中毒样品中沙门氏菌的检测培养基培养基试剂试剂2010l沙门氏菌属显色培养基l生化鉴定试剂盒2008l科玛嘉沙门氏菌属显色培养基lAPI 20E生化鉴定试剂盒或VETEK生化鉴定卡（法国梅里埃公司）设备材料设备材料2010l全自动微生物生化鉴定系统2008l全自动微生物生化鉴定系统（VETEK）附录附录A2010l培养基PH7.50.22008l培养基PH7.50.1检样25g(或25mL)样品+BPW增菌液225mL361 ，818h1ml+S

10、C10mL1ml+TTB10mL421 ，1824h挑选可疑菌落BSXLD(或HE、科玛嘉显色培养基)361 ，1824hTSI 赖氨酸 靛基质 尿素 氰化钾 营养琼脂商品化生化鉴定系统H2S+ 靛基质+尿素- 氰化钾-赖氨酸+反应结果与左侧描述不符H2S- 靛基质-尿素- 氰化钾-赖氨酸+/-H2S+ 靛基质-尿素- 氰化钾-赖氨酸+361 ，4048h361 ，1824h甘露醇+山梨醇+ONPG-血清学试验非沙门氏菌报告HE琼脂琼脂BS(图图)金黄色葡萄球菌金黄色葡萄球菌区别l修改了标准的中英文名称l修改了范围修改了范围l规范了样品制备过程规范了样品制备过程l修改了附录A 中胰酪胨大豆肉汤

11、的名称，规范为10%氯化钠胰酪胨大豆肉汤l增加了第二法金黄色葡萄球菌 Baird-Parker 平板计数和第三法金黄色葡萄球菌MPN 计数标准范围标准范围l2010l本标准第一法适用于食品中金黄色葡萄球菌的定性检验l第二法适用于金黄色葡萄球菌含量较高的食品中金黄色葡萄球菌的计数(GB/T 4789.37-2008)l第三法适用于金黄色葡萄球菌含量较低而杂菌含量较高的食品中金黄色葡萄球菌的计数。l2008l适用于各类食品和食物中毒样品中金黄色葡萄球菌的检验样品制备样品制备l2010l取25g(mL)样品到225mL7.5%氯化钠肉汤中，均质,增菌培养24hl2008l取取25g(mL)样品到22

12、5mL无菌生理盐水或磷酸盐缓冲溶液中，均质；取5mL稀释液到50 mL7.5%氯化钠肉汤中，增菌培养24h金黄色葡萄球菌MPN计数l样品稀释（同前） l接种和培养l根据对样品污染状况的估计，选择3个适宜稀释度 的样品匀液（液体样品可包括原液），在进行10倍递增稀释时，每个稀释度分别吸取1mL样品匀液接种到10%NaCl 胰蛋白胨大豆肉汤管，每个稀释度接种3管，将上述接种物361培养，45h48h。 l用3mm接种环，从有细菌生长的各管中，移取1环，分别接种BairdParker平板，361培养，4548h。金黄色葡萄球菌MPN计数典型菌落确认l从典型菌落中至少挑取1个可疑金黄色葡萄球菌菌落接种

13、到BHI肉汤和营养琼脂小斜面，361培养1824h。进行血浆凝固酶试验 结果计算：l计算血浆凝固酶试验阳性菌落对应的管数，查MPN检索表 结果报告l根据检索表的数值，报告样品中金黄色葡萄球菌的含量，单位:MPN/g或MPN /mL。典型菌落特征：典型菌落特征：黑色黑色, , 有光泽有光泽, , 突起菌落并突起菌落并伴有透明圈，通常外层有清晰圈伴有透明圈，通常外层有清晰圈血浆凝固酶实验血浆凝固酶实验乳酸菌乳酸菌 区别l修改了乳酸菌总数、乳杆菌、双歧杆菌和嗜热链球菌的计数方法GB/T4789.35-2003GB/T4789.35-2003食品中乳酸菌检验食品中乳酸菌检验与与GB/T4789.35-

14、GB/T4789.35-2008,20102008,2010的区别的区别GB/T4789.35-2003GB/T4789.35-2008GB/T4789.35-2010乳酸菌饮料中乳酸菌检验食品中乳酸菌检验莫匹罗星锂盐（Li-Mupirocin）MRS琼脂平板 TJA培养基（改良番茄汁琼脂）MRS培养基倾注法涂布法乳酸菌鉴定必做项目选作项目生化部分部分修改StreptococcusStreptococcus and LactobacillusStreptococcus and Lactobacillus20072007年在北京超市采集年在北京超市采集1111个酸奶厂家共计个酸奶厂家共计2020种不同的酸奶，种不同的酸奶，2020种种酸奶含益生菌菌种表酸奶含益生菌菌种表品种品种同时含有的菌种同时含有的菌种11种嗜热链球菌、保加利亚乳杆菌、双歧杆菌、嗜酸乳杆菌2种嗜热链球菌、保加利亚乳杆菌、双歧杆菌5种嗜热链球菌、保加利亚乳杆菌1种鼠李糖乳杆菌1种干酪乳杆菌酸奶所用菌种分离率与