实验一纸层析法分离氨基酸

1、氨基酸的分离鉴定氨基酸的分离鉴定纸层析法纸层析法指导老师：郑永良一、实验目的一、实验目的l掌握氨基酸纸层析的方法和原理，学会分析待掌握氨基酸纸层析的方法和原理，学会分析待 测样品的氨基酸成分。测样品的氨基酸成分。 二、实验原理二、实验原理l纸层析是以滤纸为惰性支持物的分配层析。滤纸纤维纸层析是以滤纸为惰性支持物的分配层析。滤纸纤维上的羟基具有亲水性，吸附一层水作为固定相，有机上的羟基具有亲水性，吸附一层水作为固定相，有机溶剂为流动相。当有机相流经固定相时，物质在两相溶剂为流动相。当有机相流经固定相时，物质在两相间不断分配而得到分离。间不断分配而得到分离。 l溶质在滤纸上的移动速度用溶质在滤纸上

2、的移动速度用RfRf值表示：值表示： lRfRf= =原点到层析斑点中心的距离原点到层析斑点中心的距离/ /原点到溶剂前沿的距原点到溶剂前沿的距离离 l在一定的条件下某种物质的在一定的条件下某种物质的RfRf值是常数。值是常数。RfRf值的大小值的大小与物质的结构、性质、溶剂系统、层析滤纸的质量和与物质的结构、性质、溶剂系统、层析滤纸的质量和层析温度等因素有关。本实验利用纸层析法分离氨基层析温度等因素有关。本实验利用纸层析法分离氨基酸。酸。 三、实验器材三、实验器材l（1 1）大烧杯（）大烧杯（5000mL5000mL）：）：1 1只只/ /组组 l（2 2）毛细管。）毛细管。 l（3 3）喷

3、雾器：公用。）喷雾器：公用。 l（4 4）培养皿：）培养皿：1 1只只/ /组。组。 l（5 5）层析滤纸（长）层析滤纸（长22cm22cm、宽、宽14cm14cm的的新华一号滤纸）：新华一号滤纸）：1 1张张/ /组。组。 l（6 6）直尺、铅笔：自备。）直尺、铅笔：自备。 l（7 7）电吹风：）电吹风：1 1只只/ /组。组。 l（8 8）托盘、针、白线：）托盘、针、白线：1 1套套/ /组。组。 l（9 9）手套：）手套：1 1双双/ /组。组。 l（1010）塑料薄膜：公用。）塑料薄膜：公用。 l（1111）小烧杯：）小烧杯：50mL50mL，1 1只只/ /组。组。 四、实验试剂四、

4、实验试剂l（1 1）扩展剂：将）扩展剂：将4 4体积正丁醇和体积正丁醇和1 1体积冰醋酸体积冰醋酸放入分液漏斗中，与放入分液漏斗中，与5 5体积水混合，充分振荡，体积水混合，充分振荡，静置后分层，弃去下层水层。静置后分层，弃去下层水层。 l（2 2）氨基酸溶液：）氨基酸溶液：0.5%0.5%的已知氨基酸溶液的已知氨基酸溶液3 3种种（亮氨酸、赖氨酸、苯丙氨酸、缬氨酸，脯氨（亮氨酸、赖氨酸、苯丙氨酸、缬氨酸，脯氨酸氨酸），酸氨酸），0.5%0.5%的待测氨基酸液的待测氨基酸液1 1种。种。 l（3 3）显色剂：）显色剂：0.1%0.1%水合茚三酮正丁醇溶液。水合茚三酮正丁醇溶液。 实验试剂实验试

5、剂 五、实验操作五、实验操作l检查培养皿是否干燥、洁净；若否，将其洗净并置于检查培养皿是否干燥、洁净；若否，将其洗净并置于干燥箱内干燥箱内120120烘干。烘干。 l（1 1）平衡：剪一大块塑料薄膜铺在桌面上，将层析）平衡：剪一大块塑料薄膜铺在桌面上，将层析缸或大烧杯到置于塑料薄膜上，再把盛有约缸或大烧杯到置于塑料薄膜上，再把盛有约20mL20mL展层展层溶液的小烧杯置于倒置的层析缸或大烧杯中，用塑料溶液的小烧杯置于倒置的层析缸或大烧杯中，用塑料薄膜密封起来，平衡薄膜密封起来，平衡20min20min。（2）规划：带上手套，取宽约）规划：带上手套，取宽约14cm、高约、高约22cm的层析滤的层

6、析滤纸一张。在纸的下端距边缘纸一张。在纸的下端距边缘2cm处轻轻用铅笔划一条平处轻轻用铅笔划一条平行于底边的直线行于底边的直线A，在直线上，在直线上做做4个记号，记号之间间隔个记号，记号之间间隔2cm，这就是原点的位置。，这就是原点的位置。另在距左边缘另在距左边缘1cm处画一条处画一条平行于左边缘的直线平行于左边缘的直线B，在，在B线上以线上以A、B两线的交点为原两线的交点为原点标明刻度（以厘米为单点标明刻度（以厘米为单位），参见左图。位），参见左图。 （3 3）点样：用毛细管浸液取样，点在这四个位置上。同）点样：用毛细管浸液取样，点在这四个位置上。同一位置上需点一位置上需点2 23 3次，每

7、点完一点，立刻用电吹风热风次，每点完一点，立刻用电吹风热风吹干后再点，以保证每点在纸上扩散的直径最大不超过吹干后再点，以保证每点在纸上扩散的直径最大不超过3mm3mm。每人须点。每人须点4 4个样，其中个样，其中3 3个是已知样，个是已知样，1 1个是待测样个是待测样品。品。 （4 4）层析：用针、线将滤纸缝成筒状，纸的两侧）层析：用针、线将滤纸缝成筒状，纸的两侧 边缘不能接触且要保持平行，参见图边缘不能接触且要保持平行，参见图3-33-3。向培养。向培养皿中加入扩展剂，使其液面高度达到皿中加入扩展剂，使其液面高度达到1cm1cm左右，左右，将点好样的滤纸筒直立于培养皿中（点样的一端将点好样的

8、滤纸筒直立于培养皿中（点样的一端在下，扩展剂的液面在在下，扩展剂的液面在A A线下约线下约1cm1cm），罩上大烧），罩上大烧杯，仍用塑料薄膜密封。当上升到杯，仍用塑料薄膜密封。当上升到121215cm15cm，取，取出滤纸，剪断连线，立即用铅笔描出溶剂前沿线，出滤纸，剪断连线，立即用铅笔描出溶剂前沿线，迅速用电吹风热风吹干。迅速用电吹风热风吹干。l（5 5）显色：用喷雾器在）显色：用喷雾器在通风厨中向滤纸上均匀喷通风厨中向滤纸上均匀喷上上0.1%0.1%茚三酮正丁醇溶液，茚三酮正丁醇溶液，然后立即用热风吹干，即然后立即用热风吹干，即可显出各层析斑点，参见可显出各层析斑点，参见左图。左图。l（6 6）计算各种氨基酸的）计算各种氨基酸的RfRf值，并判断混合样品中都有哪值，并判断混合样品中都有哪些氨基酸，各人将自己的实验结果贴在实验报告上，见些氨基酸，各人将自己的实验结果贴在实验报告上，见表表3-23-2。 l（7 7）实验完毕，倒掉用过的展层液和平衡液，将培养皿）实验完毕，倒掉用过的展层液和平衡液，将培养皿洗净，整理好桌面上的仪器和试剂，并注意清洁自己的洗净，整理好桌面上的仪器和试剂，并注意清洁自己的操作台，请老师验收，实验报告当场交给老师。操作台，请老师验收，实验报告当场交给老师。l计算计算 RfRf= = 原点到层析斑点中心的距离原点到层析斑点中心的距离