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文档简介

1、Real-TimeRT-PCR常见问题分析1 1 .某一孔荧光信号特别强问题：同一批样品，其中某一个荧光信号特别强？原因：试剂配制时反应液没完全溶化，导致探针量在一管中增多；试剂配制时没有充分混匀致各管中各成分的量不同；也可能是 PCRPCR 仪热槽被荧光物质污染，这时就要清除热槽中的污染；2 2 . .扩增曲线有一向上或向下的尖峰MaMa问题：扩增曲线有一向上或向下的尖峰？原因：反应过程中电压不稳定；可能在 2020 循环左右仪器有停下或者仪器有开盖，使得光线突然增强；如果尖峰向下，也可能是卤素灯老化所致，这时应更换；DataandStandardsAllDyesLogScale歹AutoS

2、caleSmooth:3.3.部分样本扩增效率过低问题：部分样本扩增效率过低？原因：提取液残留，一定程度抑制了 PCRPCR 反应；反应液未严格取量混匀或分装不均匀；试剂失效；4.4.阴性对照或空白对照翘尾，可能原因：1 1、模板提取环境有污染。2 2、模板提取操作有污染。3 3、配液过程存在污染。问题：阴性对照或空白对照翘尾？原因：模板提取环境有污染；模板提取操作有污染；试剂配制过程存在污染;问题：直线型扩增曲线？原因：探针部分降解（探针降解原因：a.a.探针反复冻融一一稀释的探针可在 4c4c 保存至少3 3 个月，应避免反复冻融；b.b.探针在光线下暴露时间太长）；反应液中有 PCRPC

3、R 抑制物;6 6.没有扩增曲线Component问题：没有扩增曲线？原因：PCPC 替数设置错误，在设计循环参数时将荧光信号读取时间设在反应的第一步，即stagestage1 1 阶段；电脑设定了自动休眠；AmpPlot问题：扩增曲线有一个下滑阶段？原因：基线选取范围不对，可试着将基线范围改大一些，这一问题常因试剂质量所致;8 8.扩增曲线断裂扩增曲线断裂问题：扩增曲线断裂？原因：基线选取范围不对，基线终点大于 CtCt 值，这通常是由于模板 DNADNA 浓度过高所致，因CtCt 值15,15,而基线范围仍取 3 315,15,其中包含部分扩增信号，导致标准差偏大，阈值过高，解决办法：减少基线终点至 CtCt 值前 4 4 个循环，重新分析数据9.9.样品浓度跨度过大样品浓度过高，至阳性样品扩增曲线在后面循环中呈一向下的直线，原因及解决办法同“扩增曲线断裂”。山坡形扩堵

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