高中生物选修一2017-课题2多聚酶链式反应扩增DNA片段(39ppt)

1、课题2多聚酶链式反应扩增DNA片段一、一、PCRPCR的原理及反应过程的原理及反应过程1.1.生物体内生物体内DNADNA复制的条件复制的条件: :(1)(1)原料原料:_:_。(2)(2)模板模板: :解旋后的每一条解旋后的每一条_。(3)(3)酶酶: :打开打开DNADNA双链的双链的_和合成和合成DNADNA单链的单链的_。(4)(4)引物引物: :为为DNADNA聚合酶的起始提供聚合酶的起始提供_末端。末端。4 4种脱氧核苷酸种脱氧核苷酸DNADNA母链母链解旋酶解旋酶DNADNA聚合酶聚合酶332.PCR2.PCR的概念和原理的概念和原理: :(1)(1)概念概念:PCR:PCR即多

2、聚酶链式反应即多聚酶链式反应, ,是一种体外是一种体外_的技术。它能以极少量的的技术。它能以极少量的DNADNA为模板为模板, ,在几小时内复制出上百万在几小时内复制出上百万份的份的DNADNA拷贝。拷贝。迅速扩增迅速扩增DNADNA片段片段(2)(2)原理原理: :DNADNA变性变性: :在在_的温度范围内的温度范围内,DNA,DNA的的_结构结构将解体将解体, ,双链分开双链分开, ,这个过程称为变性。这个过程称为变性。DNADNA复性复性: :当温度缓慢降低后当温度缓慢降低后, ,两条彼此分离的两条彼此分离的DNADNA链又会重新链又会重新_,_,这个过程称为复性。这个过程称为复性。D

3、NADNA合成合成:DNA:DNA聚合酶从引物聚合酶从引物_端开始延伸端开始延伸DNADNA链链,DNA,DNA的合成的合成方向总是从子链的方向总是从子链的_端向端向_端延伸。端延伸。8080100100双螺旋双螺旋结合成双链结合成双链335533(3)(3)条件条件: :原料原料:_:_。模板模板: :热变性解旋后的两条热变性解旋后的两条_。酶酶:_:_。引物引物: :能分别与能分别与_两端互补配对的两种引物两端互补配对的两种引物, ,为为DNADNA聚合酶提供聚合酶提供33末端。末端。其他条件其他条件: :需要稳定的需要稳定的_和能自动调节温度的温控设和能自动调节温度的温控设备。备。四种脱

4、氧核苷酸四种脱氧核苷酸DNADNA母链母链耐热的耐热的DNADNA聚合酶聚合酶两条模板链两条模板链缓冲溶液缓冲溶液3.PCR3.PCR的反应过程的反应过程: :变性变性: :当温度上升到当温度上升到_以上时以上时, ,双链双链DNADNA解旋解旋, ,氢键断裂氢键断裂, ,变为变为 单链单链复性复性: :当温度下降到当温度下降到_左右左右, ,两种引物通过两种引物通过_ 分别与两条单链分别与两条单链DNADNA结合结合延伸延伸: :当温度上升到当温度上升到_左右左右, ,溶液中的四种脱氧核苷酸溶液中的四种脱氧核苷酸 (A,T,G,C)(A,T,G,C)在在_的作用下的作用下, ,根据根据_ 原

5、则合成新的原则合成新的DNADNA链链90905050碱基互补配对碱基互补配对7272DNADNA聚合酶聚合酶碱基互补配对碱基互补配对二、二、PCRPCR的实验操作的实验操作1.1.实验用具实验用具: :(1)PCR(1)PCR仪仪: :该仪器能自动调控该仪器能自动调控_,_,实现实现DNADNA的扩增。如果没有的扩增。如果没有PCRPCR仪仪, ,可用可用3 3个个_水浴锅代替水浴锅代替, ,操作时按程序在操作时按程序在3 3个水浴锅中个水浴锅中来回转移来回转移PCRPCR反应的微量离心管。反应的微量离心管。(2)(2)微量离心管微量离心管: :总容积为总容积为_mL,_mL,实际上是进行实

6、际上是进行PCRPCR反应的场反应的场所。所。(3)(3)微量移液器微量移液器: :用于向微量离心管中转移用于向微量离心管中转移PCRPCR配方中的液体配方中的液体, ,每每吸取一种试剂后其上的一次性吸液枪头都必须更换。吸取一种试剂后其上的一次性吸液枪头都必须更换。温度温度恒温恒温0.50.52.2.实验步骤实验步骤: :准备准备: :按照按照PCRPCR反应需要的物质和条件反应需要的物质和条件, ,将需要的试剂和仪器准将需要的试剂和仪器准 备好备好移液移液: :用用_按照配方在微量离心管中依次加入各试剂按照配方在微量离心管中依次加入各试剂混合混合: :盖严离心管口的盖子盖严离心管口的盖子,

7、,用手指轻弹用手指轻弹_,_,使反应液混使反应液混 合均匀合均匀离心离心: :将离心管放在离心机上将离心管放在离心机上, ,离心约离心约10s,10s,使反应液集中在使反应液集中在 _反应反应: :将离心管放入将离心管放入_中进行反应中进行反应微量移液器微量移液器管的侧壁管的侧壁离心管底部离心管底部PCRPCR仪仪3.DNA3.DNA含量的测定含量的测定: :(1)(1)原理原理: :利用利用DNADNA在在_的紫外线波段有一强烈的吸收峰。的紫外线波段有一强烈的吸收峰。(2)(2)计算公式计算公式: :DNADNA含量含量(g/mL)=_(g/mL)=_稀释倍数。稀释倍数。260 nm260

8、nm5050(260 nm(260 nm的读数的读数) )【思考辨析】【思考辨析】1.1.判断正误判断正误(1)PCR(1)PCR过程中过程中, ,需要解旋酶打开氢键需要解旋酶打开氢键, ,使使DNADNA双链解旋为单双链解旋为单链。链。( ( ) )【分析】【分析】PCRPCR的解旋过程是用热变性的原理打开氢键的解旋过程是用热变性的原理打开氢键, ,未用到未用到DNADNA解旋酶。解旋酶。(2)PCR(2)PCR的引物是一段与的引物是一段与DNADNA相配对的相配对的RNARNA片段。片段。( ( ) )【分析】【分析】PCRPCR的引物可以是的引物可以是RNARNA片段片段, ,也可以是也

9、可以是DNADNA片段。片段。(3)(3)复性过程中复性过程中,DNA,DNA母链与新合成的子链形成双螺旋。母链与新合成的子链形成双螺旋。( ( ) )【分析】【分析】复性过程是让解旋后的母链通过碱基互补配对与引物复性过程是让解旋后的母链通过碱基互补配对与引物结合。结合。(4)(4)耐热的耐热的DNADNA聚合酶可以从生活在热泉的细菌中提取。聚合酶可以从生活在热泉的细菌中提取。( )( )2.2.问题思考问题思考(1)PCR(1)PCR反应过程中的温度控制为什么要先高温后低温然后再适反应过程中的温度控制为什么要先高温后低温然后再适当升温当升温? ?请分析原因。请分析原因。提示：提示：PCRPC

10、R过程中先高温解旋过程中先高温解旋, ,后低温使引物与模板结合后低温使引物与模板结合, ,然后然后再适当升温尽量达到再适当升温尽量达到TaqDNATaqDNA聚合酶的最适温度聚合酶的最适温度, ,加快反应速度。加快反应速度。(2)PCR(2)PCR过程中过程中, ,经过经过3030次循环次循环, ,一个一个DNADNA分子会扩增成多少个分子会扩增成多少个? ?提示：提示：每循环每循环1 1次次,DNA,DNA分子数会变为原来的分子数会变为原来的2 2倍倍, ,因此经过因此经过3030次次循环循环, ,会扩增成会扩增成2 23030个个DNADNA分子。分子。一、生物体内的一、生物体内的DNAD

11、NA复制与复制与PCRPCR反应的比较反应的比较体内体内DNADNA复制复制PCRPCR反应反应不不同同点点时期时期细胞有丝分裂间期和减数第细胞有丝分裂间期和减数第一次分裂前的间期一次分裂前的间期体外随时进行体外随时进行场所场所活细胞内活细胞内细胞外细胞外酶酶解旋酶、解旋酶、DNADNA聚合酶聚合酶耐高温的耐高温的DNADNA聚合酶聚合酶(TaqDNA(TaqDNA聚合酶聚合酶) )特点特点边解旋边复制边解旋边复制, ,半保留复制半保留复制体外迅速扩增体外迅速扩增是否需是否需缓冲液缓冲液不需缓冲液不需缓冲液严格配制严格配制1010倍浓缩倍浓缩扩增缓冲液扩增缓冲液设备设备无无严格控制温度变化严格

12、控制温度变化的温控设备的温控设备体内体内DNADNA复制复制PCRPCR反应反应相相同同点点原料原料4 4种脱氧核苷酸种脱氧核苷酸(A(A、G G、C C、T)T)复制原理复制原理严格遵循碱基互补配对原则严格遵循碱基互补配对原则, ,半保留复制半保留复制模板模板以以DNADNA母链为模板母链为模板引物引物都需要分别与两条模板链相结合的两种引物都需要分别与两条模板链相结合的两种引物【易错提醒】【易错提醒】(1)(1)解旋酶的作用是使解旋酶的作用是使DNADNA两条链的氢键断开两条链的氢键断开, ,而而DNADNA聚合酶与聚合酶与DNADNA连接酶的作用都是催化形成磷酸二酯键。连接酶的作用都是催化

13、形成磷酸二酯键。(2)DNA(2)DNA聚合酶是将单个核苷酸加到已有的单链片段的聚合酶是将单个核苷酸加到已有的单链片段的33端上端上, ,需要模板需要模板; ;而而DNADNA连接酶连接的是两条连接酶连接的是两条DNADNA片段的缺口片段的缺口, ,不需要模不需要模板。板。【典例训练【典例训练1 1】PCRPCR过程与细胞内的过程与细胞内的DNADNA复制过程相比复制过程相比, ,主要有两主要有两点不同点不同, ,它们是它们是( () )PCRPCR过程需要的引物是人工合成的单链过程需要的引物是人工合成的单链DNADNA或或RNARNAPCRPCR过程不需要过程不需要DNADNA聚合酶聚合酶P

14、CRPCR过程中过程中DNADNA的解旋不依靠解旋酶的解旋不依靠解旋酶, ,而是通过对反应温度的而是通过对反应温度的控制来实现的控制来实现的PCRPCR过程中过程中,DNA,DNA不需要解旋不需要解旋, ,直接以双链直接以双链DNADNA为模板进行复制为模板进行复制A.A. B.B. C.C. D.D.【解题关键】【解题关键】解答本题的关键是解答本题的关键是: :明确明确PCRPCR过程需要人工合成的过程需要人工合成的引物引物, ,利用热变性的原理打开利用热变性的原理打开DNADNA的双链。的双链。【解析】【解析】选选C C。PCRPCR过程与细胞内的过程与细胞内的DNADNA复制过程相比较复

15、制过程相比较, ,主要有主要有两点不同两点不同:(1)PCR:(1)PCR过程需要的引物是人工合成的单链过程需要的引物是人工合成的单链DNADNA或或RNA,RNA,长度通常为长度通常为20203030个核苷酸。个核苷酸。(2)PCR(2)PCR过程中过程中,DNA,DNA解旋不依赖解解旋不依赖解旋酶旋酶, ,而是通过对反应温度的控制来实现的。而是通过对反应温度的控制来实现的。【误区警示】【误区警示】无论无论DNADNA是在细胞内还是在体外复制的过程都需是在细胞内还是在体外复制的过程都需要解旋要解旋, ,因为只有解旋使碱基暴露因为只有解旋使碱基暴露, ,母链才能和子链配对母链才能和子链配对,

16、,进行进行半保留复制。但在细胞内半保留复制。但在细胞内, ,解旋通过解旋酶完成。生物体外解旋通过解旋酶完成。生物体外, ,利利用用DNADNA的热变性原理的热变性原理:80:80100100时时DNADNA的双螺旋结构将解体的双螺旋结构将解体, ,双双链分开。其结果相同链分开。其结果相同, ,但过程不同。但过程不同。二、二、PCRPCR操作操作1.PCR1.PCR解旋与复旋的原理解旋与复旋的原理: :DNADNA热变性与复性：热变性与复性：(80100 )DNADNA 变性复性 温度缓慢降低双链单链()2.PCR2.PCR的反应过程的反应过程( (如图如图):):3.PCR3.PCR扩增的计算

17、与扩增的计算与DNADNA含量的测定含量的测定: :(1)(1)理论上理论上DNADNA呈指数方式扩增。若开始只有一个呈指数方式扩增。若开始只有一个DNADNA提供模板提供模板, ,则循环则循环n n次后有次后有2 2n n个个DNA;DNA;若开始有若开始有N N0 0个个DNADNA提供模板提供模板, ,则循环则循环n n次次后获得的子代后获得的子代DNADNA数目为数目为N N0 022n n个。个。(2)DNA(2)DNA含量的测定含量的测定: :DNADNA在在260 nm260 nm的紫外线波段有一强烈的吸收峰的紫外线波段有一强烈的吸收峰, ,峰值的大小与峰值的大小与DNADNA含

18、量有关。可以利用含量有关。可以利用DNADNA的这一特点进行的这一特点进行DNADNA含量的测定含量的测定, ,具具体方法如下体方法如下: :【易错提醒】【易错提醒】(1)PCR(1)PCR过程中无解旋酶过程中无解旋酶, ,需要升高温度才能打开需要升高温度才能打开氢键氢键, ,但此时的温度还不能破坏磷酸二酯键但此时的温度还不能破坏磷酸二酯键, ,因此因此, ,热变性后是热变性后是DNADNA单链单链, ,并未分解成单体。并未分解成单体。(2)(2)复性时只是在引物和复性时只是在引物和DNADNA单链之间形成氢键单链之间形成氢键, ,两条单链之间两条单链之间并未形成氢键并未形成氢键, ,因此复性

19、后因此复性后, ,无双链无双链DNADNA分子形成。分子形成。【典例训练【典例训练2 2】PCR(PCR(多聚酶链式反应多聚酶链式反应) )技术是一项在生物体外复技术是一项在生物体外复制特定制特定DNADNA片段的核酸合成技术片段的核酸合成技术, ,下图表示合成过程下图表示合成过程, ,请据图分请据图分析回答析回答: :(1)A(1)A过程高温使过程高温使DNADNA变性解旋变性解旋, ,对该过程的原理叙述对该过程的原理叙述, ,正确的是正确的是 ( () )A.A.该过程用到耐高温的解旋酶破坏氢键该过程用到耐高温的解旋酶破坏氢键B.B.该过程用到限制酶破坏磷酸二酯键该过程用到限制酶破坏磷酸二

20、酯键C.C.该过程不需要解旋酶的作用该过程不需要解旋酶的作用D.D.该过程与人体细胞的过程完全相同该过程与人体细胞的过程完全相同(2)C(2)C过程要用到的酶是过程要用到的酶是。这种酶在高温下仍。这种酶在高温下仍保持活性保持活性, ,因此在因此在PCRPCR扩增时可以扩增时可以加入。加入。PCRPCR反应除提反应除提供酶外供酶外, ,还需要满足的基本条件有还需要满足的基本条件有:_:_。(3)(3)如果把模板如果把模板DNADNA的两条链用的两条链用1515N N标记标记, ,游离的脱氧核苷酸不做游离的脱氧核苷酸不做标记标记, ,控制控制“9595555572”72”温度循环温度循环3 3次次

21、, ,则在形成的子则在形成的子代代DNADNA中含有中含有1515N N标记的标记的DNADNA占占。(4)(4)如果模板如果模板DNADNA分子共有分子共有a a个碱基对个碱基对, ,其中含有胞嘧啶其中含有胞嘧啶m m个个, ,则该则该DNADNA复制复制1010次次, ,需要加入胸腺嘧啶脱氧核苷酸需要加入胸腺嘧啶脱氧核苷酸个。个。(5)PCR(5)PCR中由碱基错配引起的变异属于中由碱基错配引起的变异属于。假。假设对一个设对一个DNADNA进行扩增进行扩增, ,第一次循环时某一条模板链上发生碱基第一次循环时某一条模板链上发生碱基错配错配, ,则扩增若干次后检测所有则扩增若干次后检测所有DN

22、ADNA的扩增片段的扩增片段, ,与原与原DNADNA相应片相应片段相同的占段相同的占。【解题关键】【解题关键】首先要明确首先要明确DNADNA复制的特点复制的特点: :半保留复制半保留复制, ,其次掌其次掌握握DNADNA的复制是呈的复制是呈“指数指数”增长的。此外还要理解增长的。此外还要理解DNADNA复制原则复制原则: :碱基互补配对原则。碱基互补配对原则。【解析】【解析】(1)(1)高温所起的作用类似于解旋酶高温所起的作用类似于解旋酶, ,使双链使双链DNADNA解聚为解聚为单链。单链。(2)C(2)C过程为过程为PCRPCR技术的延伸阶段技术的延伸阶段, ,当系统温度上升至当系统温度

23、上升至7272左右时左右时, ,溶液中的四种脱氧核苷酸在溶液中的四种脱氧核苷酸在TaqDNATaqDNA聚合酶的作用下合聚合酶的作用下合成新的成新的DNADNA链。链。TaqDNATaqDNA聚合酶是耐热的聚合酶是耐热的, ,高温下不变性高温下不变性, ,所以一所以一次性加入即可。次性加入即可。PCRPCR即为体外即为体外DNADNA复制复制, ,所需条件与体内所需条件与体内DNADNA复制复制基本相同基本相同, ,都需要模板、原料、能量、酶都需要模板、原料、能量、酶, ,只不过为了便于控制只不过为了便于控制DNADNA复制过程复制过程, ,通过设置高温解旋代替了解旋酶的作用通过设置高温解旋代

24、替了解旋酶的作用, ,省掉了省掉了解旋酶作用过程中所需能量的供应解旋酶作用过程中所需能量的供应, ,同时同时, ,加入了与模板链相结加入了与模板链相结合的引物作为子链延伸的起点合的引物作为子链延伸的起点, ,省掉了切除引物的过程省掉了切除引物的过程, ,使使PCRPCR过程更简洁。过程更简洁。(3)PCR(3)PCR技术遵循半保留复制的特点。经过技术遵循半保留复制的特点。经过3 3次次循环循环, ,共产生共产生2 23 3个个DNADNA分子分子, ,其中有其中有2 2个个DNADNA分子含有分子含有1515N N标记。标记。(4)(4)在一个双链在一个双链DNADNA分子中分子中,(C+T)

25、,(C+T)占碱基总数的一半占碱基总数的一半, ,故故T T的数的数目为目为a-m,a-m,复制复制1010次次, ,相当于新增加了相当于新增加了(2(21010-1)-1)个个DNADNA分子分子, ,故需故需补充补充T T的数目为的数目为(2(21010-1)(a-m)-1)(a-m)。(5)(5)基因中的碱基对改变属于基因中的碱基对改变属于基因突变。对一个基因突变。对一个DNADNA进行扩增进行扩增, ,第一次循环时某一条模板链第一次循环时某一条模板链上发生碱基错配上发生碱基错配, ,以后按正常配对方式进行扩增以后按正常配对方式进行扩增, ,错配链作模错配链作模板扩增的都是错误的板扩增的都是错误的DNADNA分子分子, ,原正常链扩增得到的原正常