生物化学和分子生物学七年制实验一

1、1生物化学和分子生物学实验生物化学和分子生物学实验1 1 必须穿白大褂；必须穿白大褂；2 2 书包放在实验台的上层架子上；书包放在实验台的上层架子上；3 3 实验报告在实验课后实验报告在实验课后2424小时内由组长统一上交；小时内由组长统一上交； 值日生注意事项强调：值日生注意事项强调：1 1 清洁实验台上层架子；清洁实验台上层架子；2 2 用湿抹布擦黑板；用湿抹布擦黑板；3 3 清洁比色皿；清洁比色皿；4 4 将所有移液枪调到最大量程。将所有移液枪调到最大量程。2第一节第一节 分光光度法分光光度法(Spectrophotometry)(Spectrophotometry) 定义： 根据物质对

2、光的吸收物质对光的吸收特性和吸收强度，对物质进行定性和定量定性和定量的分析方法。3 溶液的颜色溶液的颜色实质实质是是它所吸收的色光的互补它所吸收的色光的互补色色。如：日光照射。如：日光照射KMnO4，其中，其中绿光绿光被吸收，被吸收，故溶液呈故溶液呈紫色紫色。CuSO4呈呈蓝色蓝色是由于溶液吸收是由于溶液吸收了了黄光黄光。 溶液越浓，光选择吸收越多，颜色越深。溶液越浓，光选择吸收越多，颜色越深。 比较溶液颜色的深浅，比较溶液颜色的深浅，实质实质比较溶液对光比较溶液对光的吸收程度的吸收程度。溶液的颜色4互补色互补色光互补色光如：黄光和蓝光；如：黄光和蓝光； 红光和绿光。红光和绿光。5光 光是一种

3、电磁波。自然光是由波长（光是一种电磁波。自然光是由波长（ ）不同的电磁波组成的混合光。不同的电磁波组成的混合光。6可见光可见光，可见光， 在在400760nm范围。范围。7光的吸收定律光的吸收定律To a specific wavelength, LA=KLC 8A=KLC C C：物质的浓度，：物质的浓度， g/L molg/L molL L L L：光程，：光程，cmcm， K K：吸光系数：吸光系数 摩尔消光系数摩尔消光系数：当溶液浓度为：当溶液浓度为lmollmolL L，光程为，光程为1cm1cm时所测得的一定波长下的吸光度。时所测得的一定波长下的吸光度。 百分比吸光系数百分比吸光系

4、数K K：当溶液浓度为当溶液浓度为l00gl00gL L，光程，光程为为1cm1cm时所测得的一定波长下的吸光度。时所测得的一定波长下的吸光度。 吸光系数只与物质的性质和入射光的波长有关。吸光系数只与物质的性质和入射光的波长有关。9波长的选择波长的选择 波长的选择一般是选择待测物质最大吸波长的选择一般是选择待测物质最大吸收峰的波长收峰的波长(max) (max) 101 1应使被测溶液有适当的光密度，应使被测溶液有适当的光密度，适当的光适当的光密度为密度为0.10.70.10.7，而以，而以0.20.60.20.6最理想最理想。2 2应使干扰影响降低至最低限度。应使干扰影响降低至最低限度。3

5、3应使标准曲线在尽可能大的范围内接近直应使标准曲线在尽可能大的范围内接近直线。线。11待测溶液浓度的计算待测溶液浓度的计算 1.利用标准管法计算待测溶液的浓度利用标准管法计算待测溶液的浓度 2.利用标准曲线进行换算利用标准曲线进行换算 3.利用利用LambertBeer定律定律 计算计算 A=KLC C=A/KL12利用标准管法计算待测溶液的浓度利用标准管法计算待测溶液的浓度AxAsCx =CsVsVx1稀释倍数13实验步骤 1 2 3 4 5 6 7 标 准 管 测定管 空白管试剂蛋白质标准液（蛋白质标准液（ml） 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 蛋白质测定液（蛋白质测定液（ml）

6、1.0 0.9%NaCL （ml） 0.8 0.6 0.4 0.2 1.0 双缩脲试剂双缩脲试剂 （ml） 4.0 4.0 4.0 4.0 4.0 4.0 4.0 蛋白质标准液浓度：蛋白质标准液浓度：Cs=10mg/ml14实验记录双缩脲法测定蛋白质浓度双缩脲法测定蛋白质浓度 日期日期 室温室温A 1 2 3 4 5 6 7 标 准 管测定空白0.101 0.202 0.303 0.404 0.505 0.375 0.00015公式计算法求蛋白质浓度AxAsCx =CsVsVx1稀释倍数0.3750.404Cx =10mg/ml0.8ml1ml110=74.3mg/ml161标准曲线的作用(1

7、)(1) 从浓度一从浓度一 光密度直线的直线特性，可以判断所采光密度直线的直线特性，可以判断所采用方法的呈色反应是否符合用方法的呈色反应是否符合LambenBeerLambenBeer氏定律。氏定律。(2)(2)作多次平行测定绘制标准曲线，可判断在整个测定作多次平行测定绘制标准曲线，可判断在整个测定过程中操作，仪器等误差的大小，从而确定该测定方过程中操作，仪器等误差的大小，从而确定该测定方法的可靠性。法的可靠性。(3)(3)从绘制标准曲线的斜率可以比较各种方法的灵敏度。从绘制标准曲线的斜率可以比较各种方法的灵敏度。(4)(4)当进行大批样品分析时，可省略多次计算，从光密当进行大批样品分析时，可

8、省略多次计算，从光密度值直接查阅标准曲线而求得被测物质的浓度。度值直接查阅标准曲线而求得被测物质的浓度。172标准曲线的作法标准曲线的作法 (1)(1)标准液浓度的选择：标准液浓度选择标准液浓度的选择：标准液浓度选择一般应能包括待一般应能包括待测样品的可能变异最低测样品的可能变异最低与最高值与最高值，一般可选择，一般可选择5 5种浓度种浓度。浓度差浓度差距最好是成倍增加或等级增加距最好是成倍增加或等级增加。(2)(2)标准液的测定：在比色时，读取光密度标准液的测定：在比色时，读取光密度至少读至少读2323次，求其平均值，以减少仪次，求其平均值，以减少仪器不稳定而产生的误差。器不稳定而产生的误差

9、。18实验步骤 1 2 3 4 5 6 7 标 准 管 测定管 空白管试剂蛋白质标准液（蛋白质标准液（ml） 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 蛋白质测定液（蛋白质测定液（ml） 1.0 0.9%NaCL （ml） 0.8 0.6 0.4 0.2 1.0 双缩尿试剂双缩尿试剂 （ml） 4.0 4.0 4.0 4.0 4.0 4.0 4.0 19 3.标准曲线图的绘制：标准曲线图的绘制：用普通方格纸作图。以横轴为浓度，纵轴为光密度。用普通方格纸作图。以横轴为浓度，纵轴为光密度。若各点不在一直线，则可通过原点，尽可能使直线通过若各点不在一直线，则可通过原点，尽可能使直线通过更多点，使不在直

10、线上的点尽量均匀地分布在直线的更多点，使不在直线上的点尽量均匀地分布在直线的两边。两边。标准曲线绘制完毕以后，应在座标纸上注明实验项目的标准曲线绘制完毕以后，应在座标纸上注明实验项目的名称，所使用比色计的型号和仪器编号、滤光片号码名称，所使用比色计的型号和仪器编号、滤光片号码或单色光波长以及绘制的日期、室温。或单色光波长以及绘制的日期、室温。绘制好的标准曲线只能供以后在相同条件下操作测定相绘制好的标准曲线只能供以后在相同条件下操作测定相同物质时使用。同物质时使用。20绘制标准曲线A 1 2 3 4 5 6 7 标 准 管测定空白0.101 0.202 0.303 0.404 0.505 0.3

11、75 0.000C(mg/ml) 20 40 60 80 100 ? 021C mg/mlA206040801000.10.20.30.40.5.项目、日期、室温仪器型号、编号、波长22第二节第二节 蛋白质定量分析蛋白质定量分析 蛋白质定量分析即蛋白质溶液的浓度测定；蛋白质定量分析即蛋白质溶液的浓度测定； 现实应用：现实应用：1. 临床检测临床检测血清蛋白浓度测定；血清蛋白浓度测定；2. 科学研究科学研究纯化蛋白的浓度测定；纯化蛋白的浓度测定；23主要方法主要方法 根据蛋白质元素组成根据蛋白质元素组成凯氏定氮法；凯氏定氮法； 根据蛋白质组成特点建立的比色法根据蛋白质组成特点建立的比色法双缩脲双

12、缩脲法，法，lowry改良法，考马斯亮蓝染色法，改良法，考马斯亮蓝染色法，BCA法；法； 根据蛋白质的吸收特性建立的紫外分光光度法；根据蛋白质的吸收特性建立的紫外分光光度法；24双缩脲法一、实验原理双缩脲反应OH-蓝色蓝色紫红色紫红色25蛋白质的双缩脲反应蛋白质的双缩脲反应Cu2+OH-26实验步骤 1 2 3 4 5 6 7 标 准 管 测定管 空白管试剂蛋白质标准液（蛋白质标准液（ml） 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 蛋白质测定液（蛋白质测定液（ml） 1.0 0.9%NaCL （ml） 0.8 0.6 0.4 0.2 1.0 双缩尿试剂双缩尿试剂 （ml） 4.0 4.0 4.

13、0 4.0 4.0 4.0 4.0 27标准曲线标准曲线根据Lambert-Beer定律，定律， A与与C成正比成正比配制一系列标准液配制一系列标准液C1、C2、C3，在在 max下，测相应的下，测相应的A1、A2、A3。C / (mol L-1)AxCx28蛋白质的紫外吸收蛋白质的紫外吸收TyrTrp蛋白质分子中含有共轭双键的芳香族氨基酸。蛋白质分子中含有共轭双键的芳香族氨基酸。它们具有吸收紫外光的性质。它们具有吸收紫外光的性质。其最高吸收峰在其最高吸收峰在280nm波长处，且在此波长内波长处，且在此波长内吸收峰的光密度值与其浓度成正比。吸收峰的光密度值与其浓度成正比。要有待测的蛋白质的标准

14、品作比较，才能进行要有待测的蛋白质的标准品作比较，才能进行准确定量。准确定量。29实验步骤样品 测定管 空白管待测血清样本 0.4 生理盐水 3.6 4.030BCA测定蛋白质浓度 在碱性条件下蛋白质与二价铜离子在碱性条件下蛋白质与二价铜离子Cu2+络合，络合，并将其还原成一价铜离子并将其还原成一价铜离子Cu1+。 Cu1+和和BCA试剂反应试剂反应, 形成稳定的紫蓝色复合物。形成稳定的紫蓝色复合物。 反应所生成的复合物，在反应所生成的复合物，在562 nm处有强烈的光处有强烈的光吸收，且吸光值和蛋白质浓度在广泛范围内有吸收，且吸光值和蛋白质浓度在广泛范围内有良好的线性关系，可用于蛋白质浓度的

15、测定。良好的线性关系，可用于蛋白质浓度的测定。31待测样品：将双缩脲待测样本稀释待测样品：将双缩脲待测样本稀释1010倍，即取双倍，即取双缩脲待测样本缩脲待测样本100ul+100ul+生理盐水生理盐水900ul900ul稀释成稀释成1000ul1000ul待测样本。待测样本。32双缩脲法：双缩脲法：540nm540nm，玻璃比色杯，玻璃比色杯，vis-7220vis-7220紫外法：紫外法：260260，280nm280nm，石英比色杯，石英比色杯，uv-9200uv-9200或者或者uv-uv-96009600或者或者uv-2000uv-2000。调节不同波长时需要再次调零。调节不同波长时

16、需要再次调零BCABCA法法562nm562nm，用，用0.5cm0.5cm的比色杯，同时应特别注意，的比色杯，同时应特别注意，BCABCA法的标准品与双缩脲和紫外法的不同法的标准品与双缩脲和紫外法的不同双缩脲与双缩脲与BCABCA需做标准曲线。紫外法不需做标准曲线。需做标准曲线。紫外法不需做标准曲线。33实验报告 一 原始记录 记录实验所获得的原始数据。标准 测定 空白A0.00原始记录需实验课结束教师签字原始记录需实验课结束教师签字34双缩尿/BCA法测定蛋白质浓度 1 2 3 4 5 6 7 A空白A260 A280紫外法测定蛋白质浓度A260/A280=测定35实验报告将原始记录置于第

17、一页，装订一同上交。将原始记录置于第一页，装订一同上交。实验原理（清晰）实验原理（清晰）实验步骤（简略但清晰）实验步骤（简略但清晰）数据处理（数据带入的过程，若为定性实验数据处理（数据带入的过程，若为定性实验则为观察到的现象）则为观察到的现象）实验结果实验结果1实验讨论（讨论实验成败的原因，实验可改实验讨论（讨论实验成败的原因，实验可改良的地方等）良的地方等）36双缩脲测定蛋白质浓度计算AxAsCx =CsVsVx1稀释倍数0.3750.404Cx =10mg/ml0.8ml1ml11037BCA测定蛋白质浓度AxAsCx =CsVsVx1稀释倍数0.3750.404Cx =1.5mg/ml8

18、0l100 l110038紫外分光光度法测定蛋白质浓度Cx=A 280KL稀释倍数K= 0.63L /cm.gL=1cm稀释倍数=10039404142 双缩脲双缩脲(NH2CONHCONH2)在碱性溶液中与在碱性溶液中与硫酸铜反应生成紫红色化合物，称为硫酸铜反应生成紫红色化合物，称为。43 双缩脲法是测定蛋白质浓度的常用方法之一；双缩脲法是测定蛋白质浓度的常用方法之一； 测定浓度范围：测定浓度范围：2-10mg/ml2-10mg/ml； 操作简便、迅速；操作简便、迅速； 受蛋白质种类性质的影响较小，常用于蛋白质分离纯化的受蛋白质种类性质的影响较小，常用于蛋白质分离纯化的早期步骤。早期步骤。 灵敏度较差；灵敏度较差； 而且特异性不高，除而且特异性不高，除-CONH-CONH-有此反应外，有此反应外，-CONH-CONH2 2、-CH-CH2 2NHNH2 2、-CS-NH-CS-NH2 2等基团也有此反应。等基团也有此反应。44451、在座标纸上以光密度为纵座标，以蛋白质浓度为、在座标纸上以光密度为纵座标，以蛋白质浓度为横座标绘制标准曲线。横座标绘制标准曲线。2、从标准曲线中查出待测血清样本的蛋白质浓度、从标准曲线中查出待测血清样本的蛋白质浓度(g/L)，并求出人血清样本的蛋白质