大肠埃希氏菌ppt课件

1、大肠埃希氏菌药典法生化检查大肠埃希氏菌药典法生化检查潘庆玲大肠埃希菌检查大肠埃希菌检查l大肠埃希菌Escherichia coil即大肠杆菌，为肠杆菌科埃希菌属的方式种。大肠埃希菌是人和温血动物肠道内的栖居菌，随粪便排出体外。在药品中检出大肠埃希菌，阐明该样品遭到人和温血动物粪便的污染，即能够是污染肠道病原体。大肠埃希菌除普通大肠埃希菌外，还有致病性大肠埃希菌，可引起婴幼儿、成人迸发性腹泻。为了保证人体安康，口服给药制剂必需检查大肠埃希菌。规范规范l2019年版二部l口服给药制剂l细菌总数每1ml不得过100cful霉菌和酵母菌总数每1ml不得过100cful大肠埃希菌总数不得检出备料单增菌培

2、育备料单增菌培育序号序号品名品名规格规格数量数量备注备注1锥形瓶锥形瓶250ml42刻度吸管刻度吸管10ml23刻度吸管刻度吸管1ml14烧杯烧杯250ml15量筒量筒100ml16胆盐乳糖培养基胆盐乳糖培养基100ml3装锥形瓶装锥形瓶7pH7.0无菌氯化无菌氯化钠钠-蛋白胨缓冲液蛋白胨缓冲液150ml1装锥形瓶装锥形瓶灭菌参数：灭菌参数：121、20min操作过程操作过程样品10ml90ml供试液稀释液阴样阳10ml10ml10ml菌悬液1mlBL培育基BL培育基BL培育基培育温度：36培育时间：1824h必要时可延伸至48h备料单快速生化实验备料单快速生化实验序号序号品名品名规格规格数量

3、数量备注备注1刻度吸管刻度吸管1ml32试管试管中中43MUG培养培养基基5ml4分装到试分装到试管中管中4靛基质靛基质灭菌参数：灭菌参数：115、20min操作过程操作过程阴样阳阴样阳本底靛基质实验紫外荧光0.2ml0.2ml0.2ml培育温度：361培育时间：1824h备料单分别培育备料单分别培育序号序号品名品名规格规格数量数量备注备注1EMB或麦或麦康凯琼脂康凯琼脂培养基培养基60ml1置皿置皿2平皿平皿3灭菌参数：灭菌参数：121、15min操作过程操作过程阴样阳EMB或麦康凯琼脂培育基或麦康凯琼脂培育基接种环四区划线法接种环四区划线法培育温度：361培育时间：1824h生化实验中生化

4、实验中MUG在紫外等下显荧在紫外等下显荧光的原理光的原理l大肠埃希氏菌是指能产生-半乳糖苷酶分解ONPG使培育液呈黄色，能产生-葡萄糖醛酸酶分解MUG使培育液在波长366nm紫外光下 产生荧光的细菌。BL培育基培育基l配方每升：l胨20.0g 提供碳氮源 l乳糖 5.0g 可发酵的糖类 l氯化钠 5.0g 维持平衡的浸透压 l磷酸氢二钾4.0g 缓冲剂l磷酸二氢钾1.3gl去氧胆酸钠/牛胆盐0.5g/2.0 g 选择性抑菌剂 运用方法运用方法l1、称取本品35.8g，参与蒸馏水或去离子水1 L，搅拌加热煮沸至完全溶解，分装三角瓶，每瓶100mL，121灭菌20min，待冷至常温后，备用。2、样

5、品的处置。略。3、取胆盐乳糖增菌液3份，2份分别参与规定量的供试液，其中一份参与对照菌50100个作阳性对照，第三份参与与供试液等量的稀释液作阴性对照。4、将三角瓶放入3035恒温培育箱内培育1824h。必要时可延伸至48h。5、察看结果。阳性对照应生长良好，阴性对照应无菌生长。l质量控制：本质量控菌株接种后，于361培育1824h，培育结果肉汤呈混浊。MUG培育基培育基l配方每升：l胰蛋白胨 20.0g 提供碳氮源 l3号胆盐 1.5g 抑制革兰氏阳性菌 l乳糖5.0g 可发酵的糖类 l磷酸氢二钾4.0g 缓冲剂 l磷酸二氢钾 1.5gl氯化钠5.0g 维持平衡的浸透压 lMUG0.05g运

6、用方法运用方法l1、称取本品37.05g，参与蒸馏水或去离子水1 L，搅拌加热煮沸至完全溶解，分装于带有小倒管的试管中，115高压灭菌20min，待冷至常温，备用。2、将总大肠菌群多管发酵法初发酵产酸或产气的管进展大肠埃希氏菌检测。用烧灼灭菌的金属接种环或无菌棉签将上述试管中液体接种到EC-MUG肉汤管中。3、将已接种的EC-MUG管在培育箱或恒温水浴中44.50.5培育24h2h。如运用恒温水浴，在接种30min内进展培育，水浴箱的液面应高于EC-MUG肉汤液面。4、察看结果：将培育基管置366nm紫外灯下约5cm处，以未接种培育物的EC-MUG培育基作空白对照，察看有无蓝白色荧光。空白对看

7、管应无蓝白色荧光，实验管出现蓝白色荧光为阳性反响。 l质量控制：大肠埃希菌菌株接种后于361培育1824h，结果产气，紫外灯下显荧光。 EMB琼脂培育基琼脂培育基l配方每升：l胨 10.0g 提供氮源、维生素、氨l牛肉浸出粉3.0g 基酸和碳源 l氯化钠5.0g 维持平衡的浸透压 l乳糖 10.0g 可发酵的糖类 l琼脂 14.0g 培育基凝固剂 l曙红钠 0.4g 抑菌剂革兰氏阳性菌l亚甲蓝0.065g pH指示剂l在酸性条件下产生沉淀，构成紫黑色菌落或具黑色中心的外围无色透明的菌落。运用方法运用方法l1、称取本品42.5g，参与蒸馏水或去离子水1 L，搅拌加热煮沸至完全溶解，分装三角瓶，1

8、21高压灭菌15min。2、待培育基冷至50左右，以无菌手续，倾注灭菌平皿，待凝固后，备用。3、将供试液划线接种于平板上。4、将平板翻转，放入恒温培育箱中，3035培育1824h。5、察看结果。l质量控制：本培育基倾注平皿待冷却后呈紫色，可有细微沉淀。大肠埃希菌菌株接种后。361培育1824h， 培育结果呈黑心，有绿色金属光泽。麦康凯琼脂培育基麦康凯琼脂培育基l配方每升l胨 20.0g 碳氮源、维生素和生长因子 l牛胆盐 5.0g 抑制革兰氏阳性菌的生长 l氯化钠 5.0g 维持平衡的浸透压 l琼脂 14.0g 培育基的凝固剂 l乳糖 10.0g 可发酵的糖类 l中性红 0.03g pH指示剂

9、 l细菌发酵乳糖产酸时菌落呈粉红色并在菌落周围出现胆盐沉淀的浑浊圈。运用方法运用方法l1、 称取本品54.0g，参与蒸馏水或去离子水1 L，搅拌加热煮沸至完全溶解，分装三角瓶，121高压灭菌15min。2、待培育基冷至5055倾注灭菌平皿，待凝固后，备用。3、取待检样品划线接种于麦康凯平板。4、将平板置培育箱于3035培育1824h。5、察看结果。在做致泻大肠埃希氏菌检验时，察看结果不但要留意乳糖发酵的菌落，同时也要留意不发酵和缓慢发酵的菌落。 l质量控制：大肠埃希菌菌株经361培育1824h菌落特征呈粉红或红，周围有混浊胆盐沉淀圈。IMViCl用来测定菌的生理生化特征的4个实验.lI:吲哚实

10、验 lM:甲基红实验 lV:V.P实验 lC:柠檬酸实验 li是为个好读加上去的 吲哚吲哚indole实验实验l原理：有些细菌如大肠埃希菌、变形杆菌、霍乱弧菌原理：有些细菌如大肠埃希菌、变形杆菌、霍乱弧菌等能分解培育基中的色氨酸生成吲哚靛基质，经等能分解培育基中的色氨酸生成吲哚靛基质，经与试剂中的对二甲基氨基苯甲醛作用，生成玫瑰吲哚与试剂中的对二甲基氨基苯甲醛作用，生成玫瑰吲哚而呈红色，是为吲哚实验阳性。而呈红色，是为吲哚实验阳性。l实验菌用蛋白胨水培育基实验菌用蛋白胨水培育基37培育培育24小时小时.l在培育液中参与乙醚在培育液中参与乙醚1ml(使呈明显的乙醚层使呈明显的乙醚层)充分充分振荡

11、振荡,使吲哚试剂溶于乙醚使吲哚试剂溶于乙醚.静置片刻静置片刻,待乙醚浮于培育待乙醚浮于培育液上面时沿管壁渐渐参与吲哚试剂液上面时沿管壁渐渐参与吲哚试剂10滴滴.呈玫瑰红的呈玫瑰红的为阳性为阳性,不变色的为阴不变色的为阴.l(注注:参与吲哚试剂后参与吲哚试剂后,不可再摇动不可再摇动,否那么红色不明显否那么红色不明显)甲基红实验甲基红实验lM:甲基红实验为肠道细菌的甲基红实验为肠道细菌的IMViC四类测试中四类测试中的的M，甲基红为一种酸性指示剂，根据肠道细，甲基红为一种酸性指示剂，根据肠道细菌的糖代谢途径的不同，最终产生酸性产物不菌的糖代谢途径的不同，最终产生酸性产物不一，一，PH值有所差别，导

12、致甲基红显示出不同值有所差别，导致甲基红显示出不同的颜色，从而用于鉴别肠道细菌。呈现红色为的颜色，从而用于鉴别肠道细菌。呈现红色为阳性；橘红色为弱阳性；黄色为阴性。阳性；橘红色为弱阳性；黄色为阴性。l实验菌用葡萄糖蛋白胨培育基实验菌用葡萄糖蛋白胨培育基37培育培育24小时小时.l沿管壁参与沿管壁参与M.R.(甲基红甲基红)试剂试剂3-4滴滴.红的为红的为阳性阳性,黄的为阴性黄的为阴性.甲基红实验甲基红实验l原理原理:某些细菌在糖代谢过程中，分解葡萄糖某些细菌在糖代谢过程中，分解葡萄糖产生丙酮酸，丙酮酸可进一步分解，产生甲酸、产生丙酮酸，丙酮酸可进一步分解，产生甲酸、乙酸、乳酸等，使培育基的乙酸

13、、乳酸等，使培育基的pH降至降至4.5以下，以下，当参与甲基红试剂那么呈红色，为甲基红实验当参与甲基红试剂那么呈红色，为甲基红实验阳性。假设细菌分解葡萄糖产酸量少，或产生阳性。假设细菌分解葡萄糖产酸量少，或产生的酸进一步转化为其他物质如醇、酮、醚、的酸进一步转化为其他物质如醇、酮、醚、气体和水等，那么培育基的酸度仍在气体和水等，那么培育基的酸度仍在pH6.2以上，故参与甲基红指示剂呈黄色，是为阴性。以上，故参与甲基红指示剂呈黄色，是为阴性。V.P实验乙酰甲基甲醇实验实验乙酰甲基甲醇实验 l某些细菌在葡萄糖蛋白胨水培育液中能分解葡某些细菌在葡萄糖蛋白胨水培育液中能分解葡萄糖产生丙酮酸，丙酮酸缩合

14、，脱羧成乙酰甲萄糖产生丙酮酸，丙酮酸缩合，脱羧成乙酰甲基甲醇，后者在强碱环境下，被空气中氧，氧基甲醇，后者在强碱环境下，被空气中氧，氧化为二乙酰，二乙酰与蛋白胨中的胍基生成红化为二乙酰，二乙酰与蛋白胨中的胍基生成红色化合物，称色化合物，称VP+反响。反响。l实验菌用葡萄糖蛋白胨培育基实验菌用葡萄糖蛋白胨培育基37培育培育24小时小时.l参与参与40%KOH 10-20滴滴,再参与等量再参与等量-茶酚茶酚,用力振荡用力振荡(拔去棉塞拔去棉塞)再放入再放入374h后再察看后再察看,仍无色产生为阴仍无色产生为阴.柠檬酸实验柠檬酸实验 l柠檬酸盐培育基系一综合性培育基，其中柠檬酸钠为柠檬酸盐培育基系一

15、综合性培育基，其中柠檬酸钠为碳的独一来源。而磷酸二氢铵是氮的独一来源。有的碳的独一来源。而磷酸二氢铵是氮的独一来源。有的细菌如产气杆菌，能利用柠檬酸钠为碳源，因此能在细菌如产气杆菌，能利用柠檬酸钠为碳源，因此能在柠檬酸盐培育基上生长，并分解柠檬酸盐后产生碳酸柠檬酸盐培育基上生长，并分解柠檬酸盐后产生碳酸盐，使培育基变为碱性。此时培育基中的溴麝香草酚盐，使培育基变为碱性。此时培育基中的溴麝香草酚蓝指示剂由绿色变为深蓝色。不能利用柠檬酸盐为碳蓝指示剂由绿色变为深蓝色。不能利用柠檬酸盐为碳源的细菌，在该培育基上不生长，培育基不变色。源的细菌，在该培育基上不生长，培育基不变色。 l将实验菌培育在柠檬酸盐培育基斜面上将实验菌培育在柠檬酸盐培育基斜面上37培育培育24-28小时小时.l察看有无细菌生长与培育基颜色变化察看有无细菌生长与培育基颜色变化.假设含有溴假设含有溴麝香草酚蓝的斜面蓝色者为阳性反响麝香草酚蓝的斜面蓝色者为阳性反响,呈绿色的为阴呈绿色的为阴性反响性反响;含苯酚红的斜面假设呈红色为阳性反响含苯酚红的斜面假设