融合蛋白分离及多克隆抗体的制备

1、Te iR融合蛋白分离及多克隆抗体的制备摘要: 提取睾丸酮丛毛单胞菌(Com am onas testosteroni)基因组DNA, PCR扩增teiR基因,将扩增产物克隆到pET28a中,经酶切验证后获得teiR基因表达载体pET28a2teiR. 将重组质粒转化大肠杆菌( Escherichia coli)BL21,添加终浓度为1 mmol·L - 1的IPTG进行诱导,提取细菌总蛋白进行蛋白的SDS2PAGE电泳. 并根据融合蛋白特性,利用Ni2NTA Sp in Column对TeiR融合蛋白进行分离纯化,经分离纯化后的重组蛋白在SDS2PAGE上呈现出单一条带. 进一步以

2、获得的TeiR融合蛋白为抗原,制备兔抗TeiR多克隆抗体,经EL ISA测定该抗体的效价为110000,该抗体与睾丸酮丛毛单胞菌天然TeiR蛋白反应良好,说明该抗体特异性良好.关键词: 睾丸酮丛毛单胞菌; teiR; SDS2PAGE; 多克隆抗体类固醇类物质、农药、杀虫剂等化合物大量排入环境造成生态破坏,人类不育、癌症等各种疾病日益增多. 在众多的环境激素物质中,类固醇物质不但稳定而且其激素活性大大高于其他环境激素类物质,对人类的生存和发展具有巨大威胁.睾丸酮丛毛单胞菌(Com am onas testosteroni)是革兰氏阴性菌,具有降解类固醇化合物的关键酶32羟基类固醇脱氢酶/碳酰基

3、还原酶(32hydroxysteroiddehydrogenase / carbonyl reductase, 32HSD /CR) ,能够以各种类固醇化合物作为唯一碳源和能源,通过许多复杂代谢途径完全消化类固醇化合物 1 ,因此对环境修复具有重要意义. 近年来睾丸酮丛毛单胞菌的研究备受欧盟、日本等国家的重视. 在睾丸酮丛毛单胞菌基因组DNA中至少包含2个编码类固醇降解酶基因的基因簇, teiR 基因位于基因簇邻位开裂酶基因tesB下游,对tesH基因的表达起调控作用 2 - 3 . teiR基因编码391个氨基酸,蛋白N端有1个自主诱导物结合区域, C端存在1个LuxR类型的HTH DNA结

4、合结构域, TeiR蛋白与根癌农杆菌(Agrobacterium tum efa2ciens)特异性转录调控蛋白TraR具有很高的相似性,构建突变菌发现teiR基因突变抑制了1 2dehydrogen2ase和32dehydrogenase的表达,同时突变菌丧失了以睾丸酮作为唯一碳源和能源的能力 4 . 为了更好地利用和改造睾丸酮丛毛单胞菌,本研究构建了teiR 基因高效表达载体,并在大肠杆菌中进行蛋白的诱导表达,纯化了TeiR融合蛋白,并制备了多克隆抗体.1材料与方法1. 1材料1. 1. 1菌种、质粒和培养基睾丸酮丛毛单胞菌(C. testosteron i ATCC11996, Ampr

5、 ) 、大肠杆菌( Escherichiacoli)BL21和DH5、质粒pET28a (Kanr )均由本实验室保存. LB 培养基: 10 g·L - 1蛋白胨, 5 g·L - 1酵母粉, 5 g·L - 1 NaCl, pH 7. 0;M8培养基: 12. 8 g·L - 1 Na2HPO4 ·7H2O, 3 g·L - 1 KH2 PO4 , 2. 5 g·L - 1 NaCl, 5g·L - 1 NH4Cl, 0. 5 g·L - 1 MgSO4 , 0. 01 g·L - 1 Ca

6、Cl2 , 0. 2 g·L - 1酵母粉, pH 7. 0. 培养基120 高压灭菌18 min, 4 保存备用.1. 1. 2酶、生化试剂及试剂盒TaqTM DNA聚合酶、胶回收试剂盒( PCR Fragment Recovery Kit) 、IPTG、限制性内切酶和T4 连接酶均购自TaKaRa公司(大连) ;卡那霉素(Kan) 、氨苄青霉素(Amp )购自AMERSCO公司(America, Solon) ;琼脂糖(B iowest agarose) 、质粒提取试剂盒(MediBEST Plasmid Purification Kit )和Ni2NTA Sp in Colum

7、n购自Qiagen公司(上海) ; PCR引物和BCA蛋白定量检测试剂盒购自Sangon公司(上海). 其余药品为国产分析纯生化试剂.1. 2方法1. 2. 1细菌培养以含60g·mL - 1氨苄青霉素的LB液体培养基和M8培养基培养睾丸酮丛毛单胞菌,培养条件为30 、180 r·min- 1 ;大肠杆菌以LB液体培养基进行培养,培养条件为37 、180 r·min- 1.1. 2. 2睾丸酮丛毛单胞菌基因组DNA提取按照Frederick et al 5 的方法从振荡过夜培养的睾丸酮丛毛单胞菌中提取细菌总DNA.1. 2. 3转化按照Sambrook et al

8、 6 的方法制备感受态细胞及细菌转化操作.1. 2. 4teiR 基因PCR扩增根据已发表的teiR 基因序列(GenBank登录号: AY363220)设计PCR扩增引物如下.5端引物P1: 52 CCGGAATTCATGTGCCCATATTTCGACACC23; 3端引物P2: 52 CCCAAGCTTTCACTT2GTTCCCCAG23.P1、P2引物分别添加了EcoR、Hind酶切位点(划线处)及保护碱基. PCR反应条件为: 94 预变性5 min; 94 变性45 s, 60 退火45 s, 72 延伸1 min 20 s, 30个循环; 72 延伸10 min. PCR产物经1.

9、 0%琼脂糖凝胶电泳后,胶回收试剂盒回收目的片段.1. 2. 5质粒pET28a2teiR的构建质粒和PCR回收产物分别经EcoR和Hind双酶切后,在常温下以T4 连接酶连接并转化大肠杆菌DH5. 在含30g·mL - 1卡那霉素的固体培养基上37 培养过夜,挑选单克隆. 将挑选的单克隆在含30g·mL - 1卡那霉素的液体培养基上37 、180 r·min- 1振荡培养进行繁殖,提取质粒进行EcoR和Hind双酶切验证,即获得teiR 基因表达载体pET28a2teiR.1. 2. 6融合蛋白的诱导表达参照黄天培等 7 的方法,将重组质粒pET28a2teiR

10、转化大肠杆菌BL21,在含30g·mL - 1卡那霉素的液体培养基中37 、180 r·min- 1进行培养. 当细菌培养至D595 nm = 0. 6时,加入终浓度为1 mmol·L - 1 IPTG进行诱导培养6 h. 取1 mL细菌诱导培养物, 13000 r·min- 1离心30 s,去掉上清液,加入20L PBS溶液涡旋. 取5L涡旋液沸水浴加热5 min后,进行SDS2聚丙烯酰胺凝胶电泳.1. 2. 7TeiR融合蛋白的柱纯化利用Qiagen公司的Ni2NTA Sp in Column进行TeiR融合蛋白的分离纯化. 用含0 - 0. 5 m

11、ol·L - 1咪唑的0. 05 mol·L - 1磷酸盐缓冲液(pH 7. 4)进行梯度洗脱,将含有纯化的重组TeiR蛋白收集后,进行SDS2PAGE.1. 2. 8多克隆抗体的制备参照张正坤等 8 的方法,取100g纯化的TeiR融合蛋白用适当体积生理盐水稀释后,加等体积完全福氏佐剂充分乳化,于新西兰兔背部皮下多点注射,此为预免疫. 预免疫7 d后,取50g纯化的TeiR蛋白,加等体积不完全福氏佐剂进行免疫,每隔14 d加强免疫1次. 最后一次免疫后7 - 10 d,颈动脉取血分离血清.1. 2. 9抗体效价分析将制备的TeiR多克隆抗体梯度稀释至150000,以Tei

12、R融合蛋白为抗原包被,包被浓度为25 ng·mL - 1 ,以免疫前兔子血清为对照,采用EL ISA法检测血清的效价. EL ISA检测参见Fred2erick et al 5 的方法.1. 2. 10抗体特异性分析将睾丸酮丛毛单胞菌培养于LB 或M8培养基中,取3 mL 细菌过夜培养物13000 r·min- 1离心30 s,去掉上清液,用PBS洗3遍后加入150L PBS溶液和150L“B”溶液(8 mol·L - 1尿素, 0. 1 mol·L - 1 NaH2 PO4 , 0. 01 mol·L - 1 Tris2Cl, pH 8. 0

13、)重悬沉淀,加入3L 1 mg·mL - 1的溶菌酶. 反复冻融3次( - 20 30 min, RT 30 min) ,每次30 min以上, 然后13000 r·min- 1离心20 min, 取上清液用BCA法进行蛋白质含量的测定,并将细菌蛋白浓度调整为1 mg·mL - 1. 将制备纯化的TeiR蛋白(10g·mL - 1 )用包被液稀释成200、100、50、25、12. 5、6. 25 ng·mL - 1后进行包被,制作标准曲线;将浓度调整好的细菌蛋白用包被液稀释100倍后进行EL ISA测定 5 .M. DNA分子质量标准; 1.

14、 PCR产物.图1睾丸酮丛毛单胞菌teiR基因PCR扩增结果Fig. 1The amp lification of teiR gene from C. testosteroni2结果与分析2. 1teiR基因PCR扩增以睾丸酮丛毛单胞菌总DNA为模板,以P1、P2为引物进行PCR扩增, PCR扩增产物经1. 0%琼脂糖凝胶电泳显示单一的条带,且该条带大小与GenBank登录的基因大小一致(图1) ,用Kit回收该目标条带.2. 2teiR基因表达载体pET28a2te iR的构建质粒pET28a和目的片段酶切连接后,转化大肠杆菌DH5. 挑选单克隆进行振荡培养后,分别以P1、P2为引物进行PC

15、R扩增,筛选正确的克隆子. 提取PCR检测阳性的克隆子重组质粒,以EcoR和Hind进行双酶切验证(图2). 从图2可见,重组质粒pET28a2teiR的双酶切产物进行1. 0%琼脂糖凝胶电泳有2个条带,且大小与预期结果一致,说明重组质粒构建正确. 将质粒pET28a2teiR (图3)送大连宝生物公司测序,测序结果与已报道序列一致.2. 3重组质粒在大肠杆菌中的诱导表达将重组质粒pET28a2teiR转化大肠杆菌BL21,当细菌培养至D595 nm = 0. 6时,加入终浓度为1 mmol·L - 1 IPTG进行诱导培养6 h. 诱导产物经12% SDS2PAGE电泳,结果如图4

16、 所示. 从图4 可见,诱导后pET28a2teiR的TeiR产物为一个大约45 ku的蛋白. 该蛋白为融合蛋白,具有6个组氨酸尾巴,进一步可将这种蛋白通过特殊的Ni柱进行纯化.2. 4融合蛋白的分离纯化利用Qiagen公司的Ni2NTA Sp in Column进行TeiR融合蛋白的分离纯化. 用含0 - 0. 5 mol·L - 1咪唑的0. 05 mol·L - 1磷酸盐缓冲液(pH 7. 4)进行梯度洗脱,将含有纯化的重组TeiR蛋白收集后进行SDS2PAGE (图5). 从图5可见,纯化的蛋白在SDS2PAGE中呈现单一条带,表明已成功获得了TeiR融合蛋白,其纯

17、度高,可以进行下一步多克隆抗体的制备.2. 5多克隆抗体效价及特异性分析将制备的TeiR多克隆抗体梯度稀释,以TeiR融合蛋白为抗原进行包被,采用EL ISA法检测血清的效价, 当阳性与阴性的比值( P /N)大于2. 1时,相对应抗体稀释度即为该抗体的效价. 经检测发现该抗体可以与制备的TeiR融合蛋白进行特异性反应,其效价可达110000 (图6). 以不同培养条件下的睾丸酮丛毛单胞菌细菌总蛋白为抗原,制备的TeiR多克隆抗体进行EL ISA检测,发现该抗体能够与睾丸酮丛毛单胞菌天然TeiR蛋白进行特异性反应(图7). 从图7检测发现,以LB培养基和M8无机盐培养基培养的睾丸酮丛毛单胞菌其teiR 基因的表达量存在明显差异,而在培养过程中发现,睾丸酮丛毛单胞菌在M8无机盐培养基中的生长速度明显低于在LB培养基中的生长速度. 以两种基本培养基为培养条件的睾丸酮丛毛单胞菌teiR 基因表达量差异的原因可能是由睾丸酮丛毛单胞菌在两种基本培养基中生长不一致而引起.3小结与讨论睾丸酮丛毛单胞菌teiR基因编码蛋白与根癌农杆菌(A. tum efaciens)特异转录调控蛋白TraR具有很高的相似性,属于Lux