聚合酶链反应

1、核酸扩增技术核酸扩增技术 Nucleic acid amplification orPolymerase Chain Reaction, PCR PCR (Polymerase chain reaction) PCR (Polymerase chain reaction) ：即：即聚合酶链反应，是模拟体内聚合酶链反应，是模拟体内DNADNA复制过程，复制过程，在试管内，利用模板在试管内，利用模板DNADNA、引物和、引物和4 4种种dNTPdNTP，依赖于依赖于DNADNA聚合酶的酶促反应，通过变性，聚合酶的酶促反应，通过变性，退火，延伸三个基本反应的循环过程，使退火，延伸三个基本反应的循环过

2、程，使靶靶DNADNA片段得到大量扩增。片段得到大量扩增。什么是什么是PCRPCR？ PCR的用途的用途体外扩增特异体外扩增特异DNADNA片段片段的技术，能的技术，能快速快速、特特异异地扩增目的地扩增目的DNADNA片段。片段。p 能通过试管内的数小时反应将特定的能通过试管内的数小时反应将特定的DNA DNA 片段扩增数百万倍。片段扩增数百万倍。p 迅速获取大量的单一核酸片段，为分子生迅速获取大量的单一核酸片段，为分子生 物学研究提供了强大的工具。物学研究提供了强大的工具。| PCR的发展历程的发展历程| PCR的基本原理的基本原理| PCR反应体系及条件反应体系及条件| PCR产物的不同检

3、测技术产物的不同检测技术| PCR相关技术相关技术 主要内容主要内容DNA的复制聚合酶链反应的发明ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC53TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG35解旋酶解链酶DNA解旋解链合成引物子链延长PCR PCR 的发展历程的发展历程1953年，年，Watson和和Crick提出提出DNA双螺旋结构及双螺旋结构及半保留复制半保留复制模型。模型。1958年，年，Meselson和和Stahl用实验证实用实验证实DNA半保留半保留复制模型。复制模型。ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC53TAGCGCTATCGCATCGA

4、CGCTGGATCG35DNA解旋解链合成引物子链延长GGAUCG5AUCGCG5引物酶引物酶RNA引物RNA引物DNA的复制聚合酶链反应的发明PCR PCR 的发展历程的发展历程ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC53TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG35DNA解旋解链合成引物子链延长GGAUCG5AUCGCG5TAGCGCTATCGCATCGACGCT3ATAGCGTAGCTGCGAGGATCG3DNA聚合酶DNA聚合酶DNA的复制聚合酶链反应的发明PCR PCR 的发展历程的发展历程19711971年，年，KhoranaKhorana提出：经过提出：

5、经过DNADNA变变性，与合适引物杂交，用性，与合适引物杂交，用DNADNA聚合酶聚合酶延伸引物，并不断重复该过程便可延伸引物，并不断重复该过程便可克隆基因。克隆基因。但由于测序和引物合成的困难，以但由于测序和引物合成的困难，以及及7070年代基因工程技术的发明使克年代基因工程技术的发明使克隆基因成为可能，所以，隆基因成为可能，所以，KhoranaKhorana的的设想被人们遗忘了设想被人们遗忘了DNA的复制聚合酶链反应的发明PCR PCR 的发展历程的发展历程70年代以来，人们采用两种思路去尝试建立基因的无年代以来，人们采用两种思路去尝试建立基因的无性繁殖体系，一是性繁殖体系，一是基因克隆基

6、因克隆技术，二是技术，二是体外扩增体外扩增技术。技术。19761976年，台籍科学家钱嘉韵（年，台籍科学家钱嘉韵（Alice ChienAlice Chien）从黄）从黄石国家公园的嗜热菌石国家公园的嗜热菌Thermus aquaticusThermus aquaticus中分离出中分离出热稳定的热稳定的Taq DNATaq DNA聚合酶聚合酶。DNA的复制聚合酶链反应的发明PCR PCR 的发展历程的发展历程()40 50 60 70 80 90 100100 80 60 40 2019851985年，美国年，美国PE-CetusPE-Cetus公司人类遗传研究室的公司人类遗传研究室的Mul

7、lisMullis等人发明了聚合酶链反应（等人发明了聚合酶链反应（PCRPCR）基本原理是在试管中模拟细胞内的基本原理是在试管中模拟细胞内的DNADNA复制复制最初采用最初采用E-coli DNAE-coli DNA聚合酶进行聚合酶进行PCRPCR，由于该酶不，由于该酶不耐热，使这一过程耗时，费力，且易出错耐热，使这一过程耗时，费力，且易出错19881988年年SaikiSaiki将耐热将耐热DNADNA聚合酶应用于聚合酶应用于PCRPCR，扩增特，扩增特异性和效率都明显改善，操作大为简化。随后异性和效率都明显改善，操作大为简化。随后PE-PE-CetusCetus公司推出了第一台公司推出了第

8、一台PCRPCR自动化热循环仪自动化热循环仪SaikiSaiki等首次应用等首次应用PCRPCR法成功地扩增了人法成功地扩增了人 - -珠蛋白珠蛋白的的DNADNA，并应用于镰刀状红细胞贫血的产前诊断。，并应用于镰刀状红细胞贫血的产前诊断。19931993年，年，MullisMullis等因此项技术获诺贝尔化学奖等因此项技术获诺贝尔化学奖DNA的复制聚合酶链反应的发明PCR PCR 的发展历程的发展历程 引物引物引物引物()40 50 60 70 80 90 100100 80 60 40 20“I do my best thinking “I do my best thinking whil

9、e driving”while driving”1993 Nobel prize 生物样品生物样品DNA或或RNA PCR扩增扩增基因诊断基因诊断基因扩增与分离基因扩增与分离基因突变与检测基因突变与检测分子进化研究分子进化研究环境检测环境检测法医鉴定法医鉴定PCR PCR 的基本原理的基本原理试管中进行的试管中进行的DNADNA复制反应，依据复制反应，依据 DNADNA半保留复制半保留复制的机理；的机理； 体外体外DNADNA分子于不同温度下可分子于不同温度下可变性和复性变性和复性的性质；的性质；通过人为控制体外合成系统的温度，使通过人为控制体外合成系统的温度，使 双链双链DNADNA变成单链

10、变成单链， 单链单链DNADNA与人工合成的与人工合成的引物退火引物退火， DNADNA聚合酶使聚合酶使引物沿着单链模板延伸为双引物沿着单链模板延伸为双链链DNADNA。PCR Cycle - Step 1 - Denaturation Template DNA by Heat (94oC)Target SequenceTarget Sequence变性：模板变性：模板DNA经加热至经加热至94左右一定时间后，使左右一定时间后，使模板模板DNA双链或经双链或经PCR扩增形成的双链扩增形成的双链DNA解离，解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮

11、反应作准备；备；PCR Cycle - Step 2 Temperature is lowered (Tm ) and primers anneal to target sequencesTarget SequenceTarget SequencePrimer 1Primer 253553533退火退火(复性复性)：当温度降至特定的：当温度降至特定的55左右，引物与左右，引物与模板模板DNA单链局部的互补序列配对结合成杂化链；单链局部的互补序列配对结合成杂化链；PCR Cycle - Step 3 - At 72 o C Taq DNA polymerase catalyses primer

12、extension as complementary nucleotides are incorporatedTarget SequenceTarget SequencePrimer 1Primer 253553533延伸：延伸：DNA模板模板-引物结合物在引物结合物在TaqDNA聚合酶的作聚合酶的作用下，以用下，以dNTP为反为反应原料，靶序列为应原料，靶序列为模板，按碱基配对模板，按碱基配对与半保留复制原理，与半保留复制原理，合成一条新的与模合成一条新的与模板互补的板互补的DNA 链。链。End of the 1st PCR Cycle Results in two copies of t

13、arget sequenceTarget SequenceTarget Sequence以上三个步骤构以上三个步骤构成一个循环，新成一个循环，新合成的合成的DNADNA分子分子继续作为下一轮继续作为下一轮合成的模板，经合成的模板，经多次循环（多次循环（20204040次）即可达到扩次）即可达到扩增增DNADNA片段的目片段的目的。的。 470-751个个PCR循环循环Target AmplificationNo. ofNo. Amplicon CyclesCopies of Target122438416532664201,048,576301,073,741,8241 cycle = 2 A

14、mplicon2 cycle = 4 Amplicon3 cycle = 8 Amplicon4 cycle = 16 Amplicon5 cycle = 32 Amplicon6 cycle = 64 Amplicon7 cycle = 128 Amplicon5 Essential ComponentsEssential Components of of PCR ReactionPCR Reaction salts (ions)PCRPCR反应体系与条件反应体系与条件PCR反应条件PCR过程PCR的特点标准的PCR反应体系：10X10X缓冲液缓冲液 10 10 L L4 4种种dNTPdN

15、TP混合物混合物 各各200umol/L200umol/L引物引物 各各1010100pmol100pmol模板模板DNA DNA 0.10.12 2 g gTaq DNATaq DNA聚合酶聚合酶 2.5U2.5UMgMg2+ 2+ 1.5mmol/L1.5mmol/L五要素五要素Primers, Template, dNTP, Enzyme, Buffer (Mg2+) 指待扩增的目的基因或其特异片段（靶序指待扩增的目的基因或其特异片段（靶序列）。列）。 来源：来源：genome DNA, plasmid DNA, cDNA 浓度：一般浓度：一般100ng DNA模板模板/100 L 不能

16、混有蛋白酶、核酸酶、不能混有蛋白酶、核酸酶、DNA聚合酶聚合酶抑制剂、抑制剂、DNA结合蛋白类。结合蛋白类。 人工合成的一对可以分别与两条模板人工合成的一对可以分别与两条模板DNA互互补结合的寡核苷酸序列，其中一条为上游引物，补结合的寡核苷酸序列，其中一条为上游引物，另一条为下游引物。另一条为下游引物。使用浓度：使用浓度：0.10.5 mol/L引物是决定引物是决定PCR结果的关键结果的关键PCR特异性主要取决于引物的碱基组成和长度。特异性主要取决于引物的碱基组成和长度。引物设计的原则引物设计的原则 引物长度：引物长度：以以15153030个碱基为宜。过短则降个碱基为宜。过短则降低特异性，过长

17、反应效率下降，同时也增加低特异性，过长反应效率下降，同时也增加引物合成的成本。引物合成的成本。 引物的均衡性：引物的均衡性：G+CG+C含量以含量以40406060为宜。为宜。两个引物中的两个引物中的G+CG+C含量应尽量相似。四种碱含量应尽量相似。四种碱基最好随机分布，应尽量避免基最好随机分布，应尽量避免4 4个以上的单个以上的单一碱基连续出现。一碱基连续出现。 引物引物33端：端：不能进行不能进行任何修饰；引物任何修饰；引物33端，尤其是最末端二个端，尤其是最末端二个碱基，不能发生错配；另外，如果扩增编碱基，不能发生错配；另外，如果扩增编码区域，引物码区域，引物33端要尽量避开密码子的第端

18、要尽量避开密码子的第3 3位，因为密码子第位，因为密码子第3 3位易发生简并，会影位易发生简并，会影响扩增的特异性与效率。响扩增的特异性与效率。 引物的引物的55端：端：引物引物55端修饰包括：加酶端修饰包括：加酶切位点；生物素或荧光素标记；引突变位切位点；生物素或荧光素标记；引突变位点、引入启动子序列等。点、引入启动子序列等。引物设计的原则引物设计的原则3 引物的二级结构：引物的二级结构：避免引物内部出现二级避免引物内部出现二级结构，避免序列内有较长的回文结构，使结构，避免序列内有较长的回文结构，使引物自身形成发夹结构。引物之间不应有引物自身形成发夹结构。引物之间不应有互补性，避免形成引物二

19、聚体。互补性，避免形成引物二聚体。 引物与核酸序列数据库的其他序列无明显引物与核酸序列数据库的其他序列无明显同源性同源性引物设计的原则引物设计的原则 耐高温，具有良好的热稳定性；耐高温，具有良好的热稳定性； 75 75 8080为最适反应温度；为最适反应温度； 53 53聚合酶活性和聚合酶活性和 5353外外 切酶活性，无切酶活性，无3535外切活性外切活性; ; 无校对功能。无校对功能。 用量：用量：100100l l反应体系中为反应体系中为0.50.5 5U5UTaq DNA聚合酶酶活性酶活性(%)温度温度()40 50 60 70 80 90 100100 80 60 40 20 Mg

20、Mg2+2+对对PCRPCR扩增的扩增的特异性特异性和和产量产量有显著的影响有显著的影响 在一般的在一般的 PCRPCR反应中，各种反应中，各种dNTPdNTP浓度为浓度为 200umol/L200umol/L时，时，MgMg2+2+浓度为浓度为1.51.52.0 mmol/L2.0 mmol/L为宜为宜 Mg Mg2+2+浓度过高，反应特异性降低，出现非特异扩浓度过高，反应特异性降低，出现非特异扩增；浓度过低会降低增；浓度过低会降低 Taq DNATaq DNA聚合酶的活性，使聚合酶的活性，使反应产物减少反应产物减少（dATP, dTTP, dCTP, dGTP） 4种种dNTP浓度一定要相

21、等，否则引起错配；浓度一定要相等，否则引起错配； 利用利用NaOH或或Tris-HCl将将pH调节为调节为7.07.5; 小管分装，小管分装，-20保存；保存； PCR体系中，体系中，dNTP浓度为浓度为50200mol/L 。 组成：组成：50mmol/L KCl, 1.5mmol/L MgCl2 1050mmol/L Tris-HCl（pH8.3） 温温度与时间的设置度与时间的设置 设置变性设置变性- -退火退火- -延伸三个温度点延伸三个温度点 标准反应中采用标准反应中采用三温度点法三温度点法，双链，双链DNADNA 在在90909595变性，再迅速冷却至变性，再迅速冷却至4040 60

22、 60退火，然后快速升温至退火，然后快速升温至70707575 延伸，延伸，PCRPCR反应体系与条件反应体系与条件PCR反应条件PCR过程PCR的特点 （1 1）变性的温度与时间）变性的温度与时间 93939595，30 30 60s60s 97 97，15s15s 94 94，30s30s 预变性：预变性：9595，5 5 10m10m (2)(2)退火退火( (复性复性) )温度与时间：温度与时间： 退火温度是影响退火温度是影响PCRPCR特异性的重要特异性的重要因素因素 退火温度与时间，取决于引物的长退火温度与时间，取决于引物的长度、碱基组成及其浓度，还有靶基度、碱基组成及其浓度，还有

23、靶基因序列的长度因序列的长度引物的复性温度引物的复性温度通过以下公式帮助选择合适的温度通过以下公式帮助选择合适的温度 TmTm（解链温度）（解链温度）4(G+C)+2(A+T)4(G+C)+2(A+T) 复性温度复性温度=Tm=Tm值（值（5 51010）在在TmTm值允许范围内，选择较高的复性温度可值允许范围内，选择较高的复性温度可大大减少引物和模板间的非特异性结合，提大大减少引物和模板间的非特异性结合，提高高PCRPCR反应的特异性反应的特异性 复性时间一般为复性时间一般为303060s60s，足以使引物与，足以使引物与模板之间完全结合模板之间完全结合 （3 3）延伸温度和时间）延伸温度和

24、时间 延伸温度：一般选择在延伸温度：一般选择在70707575之间之间常用温度为常用温度为7272过高的延伸温度不利于引物和模板的结合。过高的延伸温度不利于引物和模板的结合。 延伸反应时间：根据待扩增片段长度而定延伸反应时间：根据待扩增片段长度而定1Kb1Kb以内的以内的DNADNA片段，延伸时间片段，延伸时间1min1min（足够）（足够） 3 34kb4kb的靶序列需的靶序列需3 34min4min扩增扩增10Kb10Kb需延伸至需延伸至15min15min 延伸进间过长会导致非特异性扩增延伸进间过长会导致非特异性扩增 对低浓度模板的扩增，延伸时间要稍长些对低浓度模板的扩增，延伸时间要稍长

25、些（4 4）循环次数）循环次数 循环次数循环次数决定决定PCRPCR扩增程度扩增程度 循环次数循环次数主要取决于模板主要取决于模板DNADNA的浓度的浓度 循环次数：选在循环次数：选在20204040次之间次之间 循环次数越多，非特异性产物的量亦循环次数越多，非特异性产物的量亦随之增多随之增多理论上理论上PCRPCR扩增产物呈指数上升；扩增产物呈指数上升；实际反应中，只在初期呈指数增长，随实际反应中，只在初期呈指数增长，随着产物的积累，进入线性增长期直至出现着产物的积累，进入线性增长期直至出现平台效应。平台效应。u理论扩增率：理论扩增率：2 2n n递增递增（n n为循环次数），为循环次数），

26、25253030循环，目标循环，目标DNADNA可增加可增加10109 9倍。倍。u实际扩增率：实际扩增率：( () )n n，X X为为PCRPCR的实际的实际扩增率，扩增率，大多为大多为85%85%左右左右。u由于引物和底物的消耗，酶活力的下降等由于引物和底物的消耗，酶活力的下降等因素，扩增产物的增加，逐渐由指数形式因素，扩增产物的增加，逐渐由指数形式变为线性形式，所以实际上进行变为线性形式，所以实际上进行3030个循环个循环后，扩增倍数一般可达后，扩增倍数一般可达10106 610107 7。PCR反应PCR反应条件PCR过程PCR的特点1234522557294时间（min）温度（）P

27、CR反应PCR反应条件PCR过程PCR的特点适温延伸3高温变性1低温退火2重复13步2530轮目的DNA片段扩增100万倍以上DNA双螺旋DNA单链与引物复性DNA变性形成2条单链子链延伸DNA加倍模板DNA94PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点55引物1引物2DNA引物PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点引物1引物2DNA引物72Taq酶Taq酶PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点72第1轮结束第2轮开始PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点945572TaqTaqTaqTaqPCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点

28、72第2轮结束PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点重复30轮后230=1,073,741,824模板DNA第1轮扩增第2轮扩增第3轮扩增第4轮扩增第5轮扩增第6轮扩增理想拷贝数=2n n 循环次数实际拷贝数=(1+x)n X 平均效率,约为0.85 n 循环次数 特异性强特异性强 引物与模板结合的特异性及聚合酶的忠实性引物与模板结合的特异性及聚合酶的忠实性灵敏度高灵敏度高1.1.皮克皮克(pg=10-12)(pg=10-12)量级扩增到微克量级扩增到微克(ug=10-6)(ug=10-6)水平水平2.2. 能从能从100100万个细胞中检出一个靶细胞万个细胞中检出一个靶细胞3.

29、3. 病毒检测的灵敏度可达病毒检测的灵敏度可达3 3个个RFU(RFU(空斑形成单位空斑形成单位) ) 4.4. 细菌检测的最小检出率为细菌检测的最小检出率为3 3个细菌个细菌简便、快速简便、快速1.1. 一次性加好反应液，一次性加好反应液，2 24 4 小时完成扩增小时完成扩增2.2. 扩增产物一般用电泳分析扩增产物一般用电泳分析对标本的纯度要求低对标本的纯度要求低u 血液、体腔液、洗嗽液、毛发、细胞、活组织等血液、体腔液、洗嗽液、毛发、细胞、活组织等组织的粗提组织的粗提DNADNA，总，总RNARNA均可作为模板均可作为模板PCR反应PCR反应条件PCR过程PCR的特点 提高提高PCRPC

30、R扩增特异性的方法扩增特异性的方法设计特异性高的引物设计特异性高的引物热启动热启动PCRPCR递减递减PCRPCR促进促进PCRPCR的添加剂和助溶剂的添加剂和助溶剂Traditional PCR (no hot start)PCR with hot start 热启动热启动PCRPCR原原 理理蜡封蜡封抗体抑制抗体抑制高温时反高温时反应必须因子应必须因子加入法加入法特特 点点避免非特异性扩增避免非特异性扩增提高提高PCRPCR反应的特异性反应的特异性用用 途途基因组扩增基因组扩增RT-PCRRT-PCR热启动方式下的热启动方式下的PCR产物电泳结果产物电泳结果传统传统方式下的方式下的PCR产

31、物电泳结果产物电泳结果原理：原理：PCRPCR中引物的退火温度决定了退火的特异性，中引物的退火温度决定了退火的特异性，温度越高特异性越强，但过高则不能实现引物和温度越高特异性越强，但过高则不能实现引物和模板的结合，而过低会产生大量非特异性产物。模板的结合，而过低会产生大量非特异性产物。因此进行因此进行PCRPCR时需要寻找合适的退火温度。递减时需要寻找合适的退火温度。递减PCRPCR是先以较高的退火温度进行是先以较高的退火温度进行1-51-5个循环扩增，个循环扩增，之后逐步降低退火温度（每个温度之后逐步降低退火温度（每个温度1-51-5个循环）直个循环）直至至TmTm值，并最终低于这个水平，在

32、低退火温度以值，并最终低于这个水平，在低退火温度以较高的反应循环扩增（较高的反应循环扩增（15-2015-20个循环）。个循环）。递减递减PCRPCR Tm Tm值值 55 94 5min 55 94 5min 94 30s 60 30s 72 1min 2cycles94 30s 60 30s 72 1min 2cycles94 30s 59 30s 72 1min 2cycles94 30s 59 30s 72 1min 2cycles94 30s 58 30s 72 1min 2cycles94 30s 58 30s 72 1min 2cycles94 30s 51 30s 72 1mi

33、n 2cycles94 30s 51 30s 72 1min 2cycles94 30s 50 30s 72 1min 20cycles94 30s 50 30s 72 1min 20cycles72 5min72 5minPCRPCR促进剂促进剂 助溶剂：甲酰胺、二甲基亚砜助溶剂：甲酰胺、二甲基亚砜(DMSO)(DMSO)和甘油和甘油 添加剂：氯化四甲基铵添加剂：氯化四甲基铵(TMAC)(TMAC)、谷氨酸钾、谷氨酸钾、 硫酸铵、离子化及非离子化的除垢硫酸铵、离子化及非离子化的除垢 剂等。剂等。PCR仪参数设置仪参数设置94 3min10min94 3060s 55 3060s 72 306

34、0s72 5min10min4 /-20保存保存PCRPCR产物的不同产物的不同检测技术检测技术 判断有无目的扩增条带：电泳判断有无目的扩增条带：电泳 序列分析序列分析 电电 泳泳 在在 pH pH 值为值为 8.08.08.3 8.3 时，核酸分子时，核酸分子碱基几乎不解离，磷酸全部解离，核酸分子碱基几乎不解离，磷酸全部解离，核酸分子带负电，在电泳时向正极移动。采用适当浓带负电，在电泳时向正极移动。采用适当浓度的凝胶介质作为电泳支持物，在分子筛的度的凝胶介质作为电泳支持物，在分子筛的作用下，使分子大小和构象不同的核酸分子作用下，使分子大小和构象不同的核酸分子迁移率出现较大的差异，从而达到分离

35、核酸迁移率出现较大的差异，从而达到分离核酸片段检测其大小的目的。片段检测其大小的目的。 琼脂糖是一种天然聚合长链状分子，可以琼脂糖是一种天然聚合长链状分子，可以形成具有刚性的滤孔，凝胶孔径的大小决定于形成具有刚性的滤孔，凝胶孔径的大小决定于琼脂糖的浓度。浓度越高，孔隙越小，其分辨琼脂糖的浓度。浓度越高，孔隙越小，其分辨能力就越强。能力就越强。 琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳是鉴定是鉴定DNA片段最常用的方法，分离范围广，片段最常用的方法，分离范围广，适用于适用于100bp60kb的的DNA分子分子（1 1）琼脂糖含液体量大，可达）琼脂糖含液体量大，可达98-99%98-99%，近，近似自由电泳，

36、但是样品的扩散度比自由电泳似自由电泳，但是样品的扩散度比自由电泳小。小。（2 2）操作简便，电泳速度快。）操作简便，电泳速度快。（3 3）透明而不吸收紫外线，凝胶中加入）透明而不吸收紫外线，凝胶中加入EB,EB,可以直接用紫外检测仪作定量测定可以直接用紫外检测仪作定量测定（4 4）样品易回收，常用于制备。）样品易回收，常用于制备。分离不同大小分离不同大小DNADNA片段的片段的合适琼脂糖凝胶浓度合适琼脂糖凝胶浓度四、操作步骤四、操作步骤1.1.用蒸馏水将制胶模具和梳子冲洗用蒸馏水将制胶模具和梳子冲洗干净，放在制胶平板上，封闭模具干净，放在制胶平板上，封闭模具边缘，架好梳子；边缘，架好梳子；2.

37、2.根据欲分离根据欲分离DNADNA片段大小用凝胶缓片段大小用凝胶缓冲液配制适宜浓度的琼脂糖凝胶：冲液配制适宜浓度的琼脂糖凝胶：准确称量琼脂糖干粉，加入到配胶准确称量琼脂糖干粉，加入到配胶用的三角烧瓶内，定量加入电泳缓用的三角烧瓶内，定量加入电泳缓冲液（一般冲液（一般2030 ml2030 ml）3.3.放入到微波炉内加热熔化。冷却放入到微波炉内加热熔化。冷却片刻，加入一滴荧光染料，轻轻旋片刻，加入一滴荧光染料，轻轻旋转以充分混匀凝胶溶液，倒入电泳转以充分混匀凝胶溶液，倒入电泳槽中，待其凝固；槽中，待其凝固；4.4.室温下室温下30304545分钟后，凝胶完分钟后，凝胶完全凝结，小心拔出梳子，

38、将凝胶全凝结，小心拔出梳子，将凝胶安放在电泳槽内；安放在电泳槽内；5.5.向电泳槽中倒入电泳缓冲液，向电泳槽中倒入电泳缓冲液，其量以没过胶面其量以没过胶面1mm1mm为宜，如样为宜，如样品孔内有气泡，应设法除去；品孔内有气泡，应设法除去；6. 6. 在在DNADNA样品中加入样品中加入1010体积的体积的载样缓冲液（载样缓冲液（loading bufferloading buffer），混匀后，用枪将样品混合液缓，混匀后，用枪将样品混合液缓慢加入被浸没的凝胶加样孔内慢加入被浸没的凝胶加样孔内；7. 接通电源，红色为正极，黑色接通电源，红色为正极，黑色为负极，切记为负极，切记DNA样品由负极往样

39、品由负极往正极泳动正极泳动 (靠近加样孔的一端为靠近加样孔的一端为负负)。一般。一般60100V电压，电泳电压，电泳2040min即可即可(110V,30min)8. 根据指示剂泳动的位置，判断根据指示剂泳动的位置，判断是否终止电泳；是否终止电泳；9. 电泳完毕，关上电源，在凝胶电泳完毕，关上电源，在凝胶成像仪上观察电泳带及其位置，成像仪上观察电泳带及其位置，并与核酸分子量标准并与核酸分子量标准Marker比较比较被产物的大小。被产物的大小。 聚丙烯酰胺凝胶电泳（聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）组成：组成：丙烯酰胺和甲叉双丙烯丙烯酰胺和甲叉双丙烯 酰胺交联形成酰胺交联形成优点：优点：机械强度好；

40、化学性质稳定；电渗和吸附机械强度好；化学性质稳定；电渗和吸附作用较弱；分辨率较高作用较弱；分辨率较高不足：不足：有毒，对环境有污染有毒，对环境有污染RFLP RFLP 限制性片段长度多态性限制性片段长度多态性, ,是指用同一种限制性是指用同一种限制性酶消化不同个体的酶消化不同个体的DNADNA时，会得到长度各不相同的时，会得到长度各不相同的限制性片段的类型。限制性片段的类型。PCR-RFLPPCR-RFLP 是在是在 PCR PCR 和和 DNA DNA 序列分析基础上序列分析基础上产生的产生的 RFLP RFLP 技术。该方法是根据突变序列技术。该方法是根据突变序列是否位于限制性核酸内切酶的

41、酶切位点内而是否位于限制性核酸内切酶的酶切位点内而设计的对设计的对PCRPCR产物做限制性片段长度多态性分产物做限制性片段长度多态性分析的技术。析的技术。PCR-RFLPPCR-RFLP 基本流程基本流程: 1.根据基因名称查询序列，设计引物。根据基因名称查询序列，设计引物。 2.提取基因组提取基因组DNA。 3.PCR扩增。扩增。 4.产物酶切，凝胶电泳。产物酶切，凝胶电泳。 可检测某一致病基因已知的点突变，进行可检测某一致病基因已知的点突变，进行直接基因诊断直接基因诊断 也可以此为遗传标记进行连锁分析，进行也可以此为遗传标记进行连锁分析，进行间接基因诊断。间接基因诊断。 应用应用: 目前唯

42、一用于临床诊断的直接基因检测方法 单链单链DNADNA片段成复杂的空间折叠构象，这种片段成复杂的空间折叠构象，这种立体结构主要是由其内部碱基对等分子内相互立体结构主要是由其内部碱基对等分子内相互作用力来维持的。当有一个碱基发生改变时，作用力来维持的。当有一个碱基发生改变时，会或多会少地影响其空间构象，使构象发生改会或多会少地影响其空间构象，使构象发生改变，空间构象有差异的单链变，空间构象有差异的单链DNADNA分子在聚丙烯酰分子在聚丙烯酰胺凝胶中受排阻大小不同，因此通过非变性的胺凝胶中受排阻大小不同，因此通过非变性的聚丙烯酰氨凝胶电泳，可以非常敏锐地将构象聚丙烯酰氨凝胶电泳，可以非常敏锐地将构

43、象有差异的分子分离开。有差异的分子分离开。 PCR-SSCPPCR-SSCP 单链构象多态性单链构象多态性 PCR-SSCP的原理：的原理：在在SSCPSSCP测定中，双链测定中，双链DNADNA（dsDNAdsDNA）被变性）被变性成为单链成为单链DNADNA（ssDNAssDNA），每一条单链），每一条单链DNADNA都都基于它们的内部序列而呈现出一种独有的折基于它们的内部序列而呈现出一种独有的折叠构象，即使同样长度的叠构象，即使同样长度的DNADNA单链因其碱基单链因其碱基顺序不同、甚至单个碱基的不同会形成不同顺序不同、甚至单个碱基的不同会形成不同的构象。这些单链的构象。这些单链DNAD

44、NA在非变性条件下，在非变性条件下，用用聚聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，单链丙烯酰胺凝胶电泳分离，单链DNADNA的迁移的迁移率和带型，都取决于其折叠构象和电泳时的率和带型，都取决于其折叠构象和电泳时的温度温度。PCR-SSCP基本过程：基本过程：1 1PCRPCR扩增靶扩增靶DNADNA( (特异性好特异性好) )。 2 2PCRPCR产物的快速变性形成特定空间结产物的快速变性形成特定空间结构的构的DNADNA单链分子。单链分子。3. 3. 非变性的聚丙烯酰胺凝胶电泳（非变性的聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGEPAGE）4. 4. 通过放射性自显影、银染或溴化乙锭通过放射性自显影、银染或溴化乙锭显色分析

45、结果。显色分析结果。发生发生PCR-SSCP结果判定：结果判定： PCR-SSCPPCR-SSCP技术是在技术是在PCRPCR技术基础上发展起来技术基础上发展起来的，它是一种简单、快速、经济的用来显的，它是一种简单、快速、经济的用来显示在示在PCRPCR反应产物中单碱基突变（点突变）反应产物中单碱基突变（点突变）的手段。的手段。 该方法已被用做癌基因和抑癌基因突变的该方法已被用做癌基因和抑癌基因突变的筛查检测，遗传病的致病基因分析和基因筛查检测，遗传病的致病基因分析和基因诊断，基因制图等领域。诊断，基因制图等领域。 PCR-SSCP的应用：的应用： 局限性局限性需进一步测序才能确定突变的位置和

46、类型需进一步测序才能确定突变的位置和类型电泳条件要求严格电泳条件要求严格当某些位置的点突变对单链当某些位置的点突变对单链DNADNA分子立体构分子立体构象的改变不起作用或作用很小时，再加上象的改变不起作用或作用很小时，再加上其他条件的影响，就可能是聚丙烯酰胺凝其他条件的影响，就可能是聚丙烯酰胺凝胶电泳无法分辨造成漏检。胶电泳无法分辨造成漏检。高温变性的熔解曲线高温变性的熔解曲线 利用利用DNADNA熔解曲线进行核苷酸突变和多态性检测熔解曲线进行核苷酸突变和多态性检测是是2020世纪世纪9090年代后期发展的新技术，是根据正年代后期发展的新技术，是根据正常序列和突变序列因不同的常序列和突变序列因

47、不同的TmTm值而产生不同的熔值而产生不同的熔解曲线而设计的。解曲线而设计的。 TmTm值的大小取决于值的大小取决于DNADNA分子的长度和序列中分子的长度和序列中G+CG+C碱基含量，当被检片段中存在有突变位点，就会碱基含量，当被检片段中存在有突变位点，就会有不同于正常序列而出现的不同的波峰，如果一有不同于正常序列而出现的不同的波峰，如果一个被检片段出现一个以上的突变时，可以出现一个被检片段出现一个以上的突变时，可以出现一个以上的波峰，从而可以将突变序列检测出来。个以上的波峰，从而可以将突变序列检测出来。PCRPCR产物测序产物测序是检测是检测PCRPCR产物特异性的最可靠的方法产物特异性的

48、最可靠的方法直接测序：双脱氧核苷酸链末端终止法直接测序：双脱氧核苷酸链末端终止法 化学裂解法化学裂解法 克隆入载体后再测序克隆入载体后再测序 逆转录逆转录PCR(RT-PCR)实时荧光定量实时荧光定量PCR(RFQ-PCR)多重多重PCR多重连接探针扩增技术多重连接探针扩增技术(MLPA) 将将RNARNA的逆转录与的逆转录与cDNAcDNA的的PCRPCR技术相结合的技术相结合的靶基因分离技术。靶基因分离技术。 主要用于检测细胞中基因表达水平、细胞主要用于检测细胞中基因表达水平、细胞中中RNARNA病毒的含量和直接克隆特定基因的病毒的含量和直接克隆特定基因的cDNAcDNA序列、检测基因表达

49、差异等序列、检测基因表达差异等reverse transcription PCRRT-PCR原理原理总总RNA提取提取反转录成反转录成cDNAPCR扩增扩增获得目的基因获得目的基因RT-PCR的关键步骤是在的关键步骤是在RNA的反转录，的反转录，要求要求RNA模版为完整的，且不含模版为完整的，且不含DNA、蛋、蛋白质等杂质。白质等杂质。RT-PCR体系：体系： 模板模板RNA:总总RNA、 mRNA等等 引物引物: 随机引物、随机引物、oligo多聚体、特异性引物多聚体、特异性引物 逆转录酶：逆转录酶：AMV RT（禽类成髓细胞瘤病毒逆转（禽类成髓细胞瘤病毒逆转录酶）、录酶）、MMLV RT（

50、莫洛尼鼠白血病病毒逆转录（莫洛尼鼠白血病病毒逆转录酶）等酶）等 dNTPs：脱氧核苷酸：脱氧核苷酸 RNase：RNA水解酶水解酶 PCR Buffer：RT-PCR缓冲液缓冲液 MgCl2：Mg2+随机引物随机引物: :当特定mRNA由于含有使反转录酶终止的序列而难于拷贝其全长序列时，可采用随机六聚体引物这一不特异的引物来拷贝全长mRNA。以以oligo(dT)oligo(dT)作为引物作为引物: :是一种对mRNA特异的方法，适用于多数适用于多数RT-PCRRT-PCR。因绝大多数真核细胞mRNA具有3端Poly(A )尾，此引物与其配对，仅mRNA可被转录基因特异性引物：基因特异性引物：

51、仅产生所需要的cDNA，导致更为特异的PCR扩增。适用于目的序列已知的情况。1.1.引物引物2.2.反转录酶反转录酶MMLVMMLV：Money 鼠白血病病毒反转录酶，有强的聚合酶活性，RNA酶H活性相对较弱。最适作用温度为37。AMVAMV：禽成髓细胞瘤病毒反转录酶，有强的聚合酶活性和RNA酶H活性。最适作用温度为42。Tth DNATth DNA聚合酶：聚合酶：嗜热微生物的热稳定性反转录酶：在Mn2+ 存在下，允许高温反转录RNA，以消除RNA模板的二级结构。MMLVMMLV反转录酶的反转录酶的RNase H-RNase H-突变体：突变体：商品名为SuperScript 和SuperSc

52、ript。此种酶较其它酶能将更大部分的RNA转换成cDNA，这一特性允许从含二级结构的、低温反转录很困难的mRNA模板合成较长cDNA。MMLVMMLV和和AMVAMV 缺乏缺乏3535核酸外切酶活性，在催化聚核酸外切酶活性，在催化聚合过程中容易发生错误，并且其反应底物合过程中容易发生错误，并且其反应底物dNTPdNTP的的KmKm值较高，要求反应体系有较高的值较高，要求反应体系有较高的dNTPdNTP浓度。浓度。 AMVAMV具有较高具有较高Rnase HRnase H酶活性，趋向于抑制酶活性，趋向于抑制cDNAcDNA的长度。相对于的长度。相对于AMVAMV，MMLVMMLV的的Rnase

53、 HRnase H酶活性酶活性较弱，不过其反应最适温度较弱，不过其反应最适温度3737较较AMVAMV低，不利低，不利于具有高度二级结构的于具有高度二级结构的RNARNA模板的反转录。模板的反转录。Tth DNATth DNA聚合酶聚合酶 在在MnMn2 2的存在时有反转录酶的活性，并的存在时有反转录酶的活性，并且可以在高温下反转录且可以在高温下反转录RNARNA，可以消除，可以消除RNARNA模模板中的二级结构。由于其在反转录和板中的二级结构。由于其在反转录和PCRPCR两两个阶段都起作用，可以用于个阶段都起作用，可以用于RT-PCRRT-PCR一步法，一步法，在同一反应管中进行，不过起催化

54、的在同一反应管中进行，不过起催化的cDNAcDNA长长度仅度仅1 12kb2kb，并且不能和，并且不能和Oligo(dT)Oligo(dT)及随机及随机六核苷酸引物连用。六核苷酸引物连用。MMLV反转录酶的反转录酶的RNase H-突变体突变体 由于无由于无Rnase HRnase H酶活性，可以合成更长的酶活性，可以合成更长的cDNA,cDNA,并且转录效率更高，且允许在更高的并且转录效率更高，且允许在更高的温度下（温度下（5050）下合成）下合成cDNAcDNA，有利于消除，有利于消除RNARNA模板中的二级结构。模板中的二级结构。 RTRT与与PCRPCR分开进行，各自分开进行，各自在最

55、优化的条件下进在最优化的条件下进行，行，灵敏度低灵敏度低RTRT与与PCRPCR同时进行，容易同时进行，容易相互干扰，灵敏度高相互干扰，灵敏度高实时荧光定量实时荧光定量PCRPCR 在在PCRPCR反应体系中加入反应体系中加入荧光基团荧光基团，利，利用荧光信号累积用荧光信号累积实时监测实时监测整个整个PCRPCR进程，进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法量分析的方法 常规常规vsvs实时实时 常规常规PCRPCR：借助电泳对扩增反应的终产物进行半定：借助电泳对扩增反应的终产物进行半定量及定性分析量及定性分析 定量定量PCRPCR技术：利用荧光信号的

56、变化实时检测技术：利用荧光信号的变化实时检测PCRPCR扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化，最终扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化，最终精确的对起始模板的精确的对起始模板的 在在PCR扩增过程中，以扩增过程中，以荧光荧光化合物化合物对对每次每次PCR循环后产物总量进行实时检测。循环后产物总量进行实时检测。 在在PCR扩增的指数时期，模板的扩增的指数时期，模板的Ct值值和该和该模板的起始拷贝数存在线性关系，成为定模板的起始拷贝数存在线性关系，成为定量的依据量的依据。实时荧光定量实时荧光定量PCR原理原理荧光化合物荧光化合物 特异性荧光探针特异性荧光探针嵌入性荧光染料嵌入性荧光染料 嵌入性荧光

57、染料嵌入性荧光染料可与双链可与双链DNA结合结合最为常用的是最为常用的是SYBR Green SYBR Green SYBR Green SYBR Green 法工作机理法工作机理q SYBR Green SYBR Green 能结合到双链能结合到双链DNADNA的小沟部位的小沟部位q SYBR Green SYBR Green 只有和双链只有和双链DNADNA结合后才发荧光结合后才发荧光q 变性时，变性时，DNADNA双链分开，无荧光双链分开，无荧光q 复性和延伸时，形成双链复性和延伸时，形成双链DNADNA， SYBR Green SYBR Green 发荧光，发荧光，在此阶段采集荧光信号

58、。在此阶段采集荧光信号。SYBR SYBR Green Green 在在PCR反应体系中，加入过量反应体系中，加入过量SYBR荧光染荧光染料，料，SYBR荧光染料特异性地掺入荧光染料特异性地掺入DNA双链双链后，发射荧光信号，而不掺入链中的后，发射荧光信号，而不掺入链中的SYBR染料分子不会发射任何荧光信号，从而保证染料分子不会发射任何荧光信号，从而保证荧光信号的增加与荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步产物的增加完全同步。 SYBR Green SYBR Green 法优缺点法优缺点 q 对对DNADNA模板没有选择性模板没有选择性 -适用于任何适用于任何DNADNAq 使用方便使用方便

59、 -不必设计复杂探针不必设计复杂探针q 非常灵敏非常灵敏q 便宜便宜优优 点点q 容易与非特异性双链容易与非特异性双链DNADNA结合，产生假阳性结合，产生假阳性 但可以通过但可以通过融解曲线的分融解曲线的分析析，优化反应条件，优化反应条件q 对引物特异性要求较高对引物特异性要求较高缺缺 点点特异性荧光探针特异性荧光探针TaqManTaqMan探针法探针法TaqMan MGB TaqMan MGB 探针法探针法TaqMan-TaqMan-分子信标分子信标分子信标分子信标FRETFRET探针探针荧光标记引物荧光标记引物利用探针与靶序列的特异性杂交来利用探针与靶序列的特异性杂交来指示指示PCRPC

60、R产物的扩增产物的扩增TaqManTaqMan探针法探针法 TaqMan TaqMan探针是一种水解型寡核苷酸探探针是一种水解型寡核苷酸探针，它的应用归功于两个重要发现针，它的应用归功于两个重要发现Taq DNATaq DNA聚合酶的聚合酶的5-35-3外切酶活性和荧光共振能外切酶活性和荧光共振能量传递量传递与目标序列互补与目标序列互补 荧光共振能量传递特性：当一个荧光基团荧光共振能量传递特性：当一个荧光基团的发射谱与另一个荧光基团的吸收谱重叠的发射谱与另一个荧光基团的吸收谱重叠时，能量可以从高能量（短波长）传递到时，能量可以从高能量（短波长）传递到低能量（长波长），相当于短波长的荧光低能量（