第三章__载体

1、第三章第三章 载体载体vectors在基因工程操作中，把能携带外源在基因工程操作中，把能携带外源DNA进入受体进入受体细胞的细胞的DNA分子分子叫载体。叫载体。一、一、载体载体 （Vectors）广义上通常把能携带外源基因进入受体细胞的运广义上通常把能携带外源基因进入受体细胞的运载工具叫载体。载工具叫载体。载体的本质是载体的本质是DNA。经过人工构建的载体，不但能与外源基因相连接，经过人工构建的载体，不但能与外源基因相连接，导入受体细胞，还能利用本身的调控系统，使外源导入受体细胞，还能利用本身的调控系统，使外源基因在新细胞中复制以致功能的表达。基因在新细胞中复制以致功能的表达。 发展概况发展概

2、况 1.1.第一阶段（第一阶段（19771977年前）：年前）：天然质粒和重组质粒的利用，天然质粒和重组质粒的利用，如如pSC101, colE1, pCR, pBR313pSC101, colE1, pCR, pBR313和和pBR322 (1977, Bolivar pBR322 (1977, Bolivar et alet al) ) 2.2.第二阶段：第二阶段：增大载体容量（降低载体长度），建立多克增大载体容量（降低载体长度），建立多克隆位点区和新的遗传标记基因。如隆位点区和新的遗传标记基因。如pUCpUC系列载体。系列载体。 3.3.第三阶段：第三阶段：进一步完善载体功能以满足基因工

3、程克隆中的进一步完善载体功能以满足基因工程克隆中的不同要求，如不同要求，如M13mpM13mp系列载体，含系列载体，含T3T3，T7T7，sp6sp6启动子载体，启动子载体，表达型载体及各种探针型载体。表达型载体及各种探针型载体。 基因工程中常用的主要载体基因工程中常用的主要载体质粒质粒(Plasmid)，主要指人工构建的质粒，主要指人工构建的质粒噬菌体载体噬菌体载体 柯斯质粒柯斯质粒 (cosmid)单链单链DNA噬菌体噬菌体M13动物病毒动物病毒人工染色体人工染色体 (artificial chromosome)（1）具有对受体细胞的）具有对受体细胞的可转移性可转移性，可提高载体导入受体细

4、胞的，可提高载体导入受体细胞的效率。效率。（2）具有与特定受体细胞相适应的）具有与特定受体细胞相适应的复制原点复制原点或或整合位点整合位点，使得，使得外源基因可在受体细胞中大量繁殖或稳定遗传。外源基因可在受体细胞中大量繁殖或稳定遗传。（3）具有）具有多种单一的核酸酶切位点多种单一的核酸酶切位点(多克隆位点多克隆位点)，可用于外源可用于外源基因的插入，同时不影响载体的扩增和繁殖。基因的插入，同时不影响载体的扩增和繁殖。（4）具有合适的选择标记，便于重组）具有合适的选择标记，便于重组DNA分子的检测。分子的检测。（5）具有较好的安全性，不能任意转移，避免基因的非控制性）具有较好的安全性，不能任意转

5、移，避免基因的非控制性扩散，给人类造成危害扩散，给人类造成危害2. 基因工程对载体的要求基因工程对载体的要求pBR3224363 bp遗传标记基因遗传标记基因 1. 1. 标记基因的作用标记基因的作用 1 1）指示外源）指示外源DNADNA分子（载体或重组分子）分子（载体或重组分子）是否是否进入宿主细胞进入宿主细胞 这种指示可以是选择性的（这种指示可以是选择性的（ApApr r ，TcTcr r ，KanKanr r），），也可以是非选择性的（如也可以是非选择性的（如lacZlacZ） 2 2）指示外源）指示外源DNADNA分子分子是否插入载体分子是否插入载体分子形成了重组子。形成了重组子。

6、* * 这种指示也可以是这种指示也可以是选择性选择性的（如的（如TcTcS S），也可以是），也可以是非选择性非选择性的（如的（如TcTcS S， lacZ, GUSlacZ, GUS），绝大多数为后），绝大多数为后者。者。 * * *有的遗传标记基因可以完成上述两项作用。当充任有的遗传标记基因可以完成上述两项作用。当充任第一作用时，最好是选择性标记基因；当完成第二作用第一作用时，最好是选择性标记基因；当完成第二作用时，目前多采用非选择性的时，目前多采用非选择性的检测性标记基因。有的基检测性标记基因。有的基因是不能用作选择性标记基因（因是不能用作选择性标记基因（lacZlacZ，GUSGUS等

7、）。等）。2.2.标记基因的种类标记基因的种类 1 1）抗性标记基因抗性标记基因（可直接用于选择转化子）（可直接用于选择转化子） a.a. 抗生素抗性基因抗生素抗性基因: Ap: Apr r ，TcTcr r ，CmCmr r，KanKanr r，G418G418r r，HygHygr r ，NeoNeor r b. b. 重金属抗性基因重金属抗性基因: Cu: Cur r ，ZnZnr r ，Cd Cd r r c. c. 代谢抗性基因代谢抗性基因: TK: TK，抗除草剂基因，抗除草剂基因 2 2）营养标记基因营养标记基因（可直接用于选择转化子）（可直接用于选择转化子） 主要是参与氨基酸，

8、核苷酸及其他必需营养物主要是参与氨基酸，核苷酸及其他必需营养物合成酶类的基因，合成酶类的基因， 这类基因在酵母转化中使用最频繁，这类基因在酵母转化中使用最频繁，如如TRP1TRP1，URA3URA3，LEU2LEU2，HIS4HIS4等。等。 3 3）生化标记基因生化标记基因 其表达产物可催化某些易检测的生化反应，如其表达产物可催化某些易检测的生化反应，如lacZ, lacZ, GUS, CATGUS, CAT 4 4） 噬菌斑噬菌斑 3.3.使用标记基因注意要点使用标记基因注意要点 1 1）标记基因与宿主细胞）标记基因与宿主细胞 2 2）标记基因产物的作用机制）标记基因产物的作用机制: Ap

9、: Apr r 3 3）标记基因的结构与适用范围）标记基因的结构与适用范围: : 基因启动子基因启动子, , 翻译起翻译起始序列始序列, , 密码子偏爱性密码子偏爱性 4 4）标记基因的结构变化对功能的影响）标记基因的结构变化对功能的影响: LacZ, GUS: LacZ, GUS 4.4.常用的遗传标记基因常用的遗传标记基因 1) 1) 四环素抗性基因四环素抗性基因（TcTcr r） Tetracycline Tetracycline 可结合在核糖体可结合在核糖体30s30s亚基中亚基中的一种蛋白质分子上，抑制核糖体的转位过程。四环的一种蛋白质分子上，抑制核糖体的转位过程。四环素抗性基因编码

10、一种素抗性基因编码一种399 AAs399 AAs蛋白质，与细菌细胞膜蛋白质，与细菌细胞膜结合，阻止四环素分子进入细菌细胞。结合，阻止四环素分子进入细菌细胞。2) 2) 氨苄青霉素抗性基因氨苄青霉素抗性基因（ApApr r） AmpicillinAmpicillin可抑制细菌细胞膜上参与细胞壁合成酶类的活性。可抑制细菌细胞膜上参与细胞壁合成酶类的活性。ApApr r抗性基因编码一种分泌到细菌细胞周间质的酶，催化抗性基因编码一种分泌到细菌细胞周间质的酶，催化内酰胺内酰胺环的环的水解水解，使氨苄青霉素失活。，使氨苄青霉素失活。3) 3) 氯霉素抗性基因氯霉素抗性基因（CmCmr r） Chloro

11、phenicolChlorophenicol可结合在核糖体可结合在核糖体50 S50 S亚基上，阻止蛋白质合亚基上，阻止蛋白质合成。成。CmCmr r基因编码氯霉素乙酰转移酶，使氯霉素基因编码氯霉素乙酰转移酶，使氯霉素乙酰化乙酰化，导致乙酰化，导致乙酰化的氯霉素不能结合在核糖体上。的氯霉素不能结合在核糖体上。4) 4) 卡那霉素卡那霉素(Kan(Kanr r), ), 新霉素新霉素(Neo(Neor r) )和和G418G418抗性抗性(G418(G418r r) )基因基因 KanamycinKanamycin，NeomycinNeomycin和和G418G418均属脱氧链霉胺氨基葡萄糖苷均

12、属脱氧链霉胺氨基葡萄糖苷类抗生素，可结合在核糖体上阻止蛋白质的合成。来自转座子类抗生素，可结合在核糖体上阻止蛋白质的合成。来自转座子Tn5Tn5和和Tn903Tn903的的KanKanr r抗性基因均可使这类抗生素抗性基因均可使这类抗生素磷酸化磷酸化，使之不能进入细胞，使之不能进入细胞内。内。 5 5）半乳糖苷酶基因（半乳糖苷酶基因（lacZ lacZ 和和lacZlacZ） 半乳糖苷酶基因有半乳糖苷酶基因有1021 AAs1021 AAs，基因产物不具酶活，基因产物不具酶活性，装配为四聚体后才有酶活。该蛋白质可分为两部分：性，装配为四聚体后才有酶活。该蛋白质可分为两部分：链和链和链。前者负责

13、四聚体装配，后者具链。前者负责四聚体装配，后者具半乳糖苷酶活性；只有半乳糖苷酶活性；只有当两者都存在时，才会表现出酶活性，该作用称之为当两者都存在时，才会表现出酶活性，该作用称之为-互补作互补作用用。这两个部分可独立存在，。这两个部分可独立存在， 分别由两个基因编码。为分别由两个基因编码。为链编链编码的基因称之为码的基因称之为lacZlacZ( (编码编码145 AAs)145 AAs)。这两个基因（。这两个基因（LacZLacZ和和LacZLacZ）均可作为标记基因。）均可作为标记基因。 半乳糖苷酶基因的优点半乳糖苷酶基因的优点: : a.a.酶催化酶催化X-GalX-Gal水解为兰色产物，

14、检测直观水解为兰色产物，检测直观 b. lacZb. lacZ编码编码5-5-端可容许很大的变化而不影响酶活性端可容许很大的变化而不影响酶活性 c. lacZc. lacZ和和链基因的分别表达可使载体小而容量大链基因的分别表达可使载体小而容量大 6 6）葡萄糖苷酸酶基因（葡萄糖苷酸酶基因（GUSGUS） 该基因编码一种可分解各种该基因编码一种可分解各种-葡萄糖苷酸酶基因衍生物的水葡萄糖苷酸酶基因衍生物的水解酶。该标记基因除具有上述解酶。该标记基因除具有上述lacZlacZ基因的优点外，它的适用范围十基因的优点外，它的适用范围十分广泛，因为许多生物中没有这种基因。分广泛，因为许多生物中没有这种基

15、因。 7 7）荧光素酶基因荧光素酶基因 荧光素酶或由萤火虫产生的可催化蜜蜂荧光素氧化的酶，并产荧光素酶或由萤火虫产生的可催化蜜蜂荧光素氧化的酶，并产生荧光，若在反应中加入生荧光，若在反应中加入CoACoA，可使灵敏度提高，可使灵敏度提高1010倍；或由发光细倍；或由发光细菌（菌（Photobacterium fischeriPhotobacterium fischeri）产生的荧光素酶，它与）产生的荧光素酶，它与FMN-FMN-氧化氧化还原酶联用，通过还原酶联用，通过NAD(P)HNAD(P)H的变化测定酶活的变化测定酶活。 8 8）发光蛋白质基因发光蛋白质基因 发光蛋白是由水母产生的一种可发

16、光的蛋白质，该蛋白质可使发光蛋白是由水母产生的一种可发光的蛋白质，该蛋白质可使大肠杆菌菌落呈蓝色。大肠杆菌菌落呈蓝色。3. 载体载体 的种类的种类 基因工程中基因工程中常用常用的载体有的载体有5类：类： 质粒（质粒（plasmid） 单链单链DNA噬菌体噬菌体M13 噬菌体的衍生物噬菌体的衍生物 柯斯质粒（柯斯质粒（cosmid） 动物病毒（动物病毒（virus） 来源来源克隆载体克隆载体（cloning vector）对目的基因克隆，建立对目的基因克隆，建立DNA文库文库和和cDNA文库，其上有复制子即可文库，其上有复制子即可按功能分类按功能分类表达载体表达载体（expression vec

17、tor）使目的基因在宿主细胞中表达，既有使目的基因在宿主细胞中表达，既有复制子，又有强启动子复制子，又有强启动子穿梭载体穿梭载体（shuttle vector）可以在原核细胞中复制，也可在真可以在原核细胞中复制，也可在真核细胞中扩增和表达。核细胞中扩增和表达。功能功能克隆载体克隆载体: 克隆一个基因或克隆一个基因或DNA片段片段表达载体表达载体: 用于一个基因的蛋白表达用于一个基因的蛋白表达整合载体整合载体: 把一个基因插入到染色体组中把一个基因插入到染色体组中第一节第一节 质粒载体质粒载体 一、质粒（一、质粒（plasmid） 是独立于染色体以外的能自主复制的是独立于染色体以外的能自主复制的

18、双链闭合环状双链闭合环状DNA分子。分子。存在于细菌、霉菌、蓝藻、酵母等细胞中。存在于细菌、霉菌、蓝藻、酵母等细胞中。大肠杆菌的质粒大肠杆菌的质粒（1）分子小：）分子小： 1. 质粒的一般生物学特性质粒的一般生物学特性1500 kb（2）编码基因少：）编码基因少： 23个中等大小的蛋白质。个中等大小的蛋白质。 （3）环形状：）环形状：双链环状双链环状DNA。（酵母的（酵母的“杀伤质粒杀伤质粒”是是RNA,编码毒性糖蛋白编码毒性糖蛋白）。）。如抗菌素抗性、代谢特征等，赋予细菌如抗菌素抗性、代谢特征等，赋予细菌一些额外的特性（非必须）。一些额外的特性（非必须）。质粒质粒DNA分子大小分子大小（4）

19、质粒的空间构型：）质粒的空间构型： 共价闭合环状共价闭合环状DNA（cccDNA)呈超螺旋（呈超螺旋（SC）（）（super coil）Covalent close circular DNA 线形线形DNA （ linear ，lDNA）一条链上有一至数个缺口。一条链上有一至数个缺口。 开环开环DNA（ open circular， ocDNA）（5）质粒空间构型与电泳速率）质粒空间构型与电泳速率同一质粒尽管分子量相同，不同的构同一质粒尽管分子量相同，不同的构型电泳迁移率不同：型电泳迁移率不同：scDNA最快、最快、l DNA次之、次之、ocDNA最慢。最慢。SCOCL（6）氯化铯密度梯度离心

20、提取质粒）氯化铯密度梯度离心提取质粒超螺旋质粒超螺旋质粒开环和线性质粒开环和线性质粒染色体染色体DNA加入加入EB加入加入EB结合结合EB少少结合结合EB多多紧密密度高紧密密度高松散密度低松散密度低密度梯度离心分离密度梯度离心分离二、质粒的类型二、质粒的类型在大肠杆菌中的质粒，可以分为：在大肠杆菌中的质粒，可以分为： 接合型质粒接合型质粒:非接合型质粒非接合型质粒能自我转移能自我转移不能自我转移不能自我转移1、依据质粒自身传递的性质分类、依据质粒自身传递的性质分类除了带有自我除了带有自我复制复制所必需的遗传信息外所必需的遗传信息外还带有一套控制细菌还带有一套控制细菌配对配对和质粒和质粒接合转接

21、合转移移的基因。的基因。如：如：F质粒（性质粒、或质粒（性质粒、或F因子）：因子）：甚至能使寄主染色体上的基因随其一道甚至能使寄主染色体上的基因随其一道转移到原先不存在该质粒的受体菌中。转移到原先不存在该质粒的受体菌中。又叫又叫自我转移型质粒自我转移型质粒。1. 接合型质粒：接合型质粒：不符合基因工程的安全要求。不符合基因工程的安全要求。大肠杆菌接合（大肠杆菌接合（conjunction）2. 非接合型质粒：非接合型质粒：虽然带有自我虽然带有自我复制复制所必需的遗传信息，但失所必需的遗传信息，但失去了控制去了控制细菌配对细菌配对和和质粒接合转移质粒接合转移的基因，的基因，因此不能从一个细胞转移

22、到另一个细胞。因此不能从一个细胞转移到另一个细胞。（1）R质粒（抗性质粒）：质粒（抗性质粒）：带有一种或数种带有一种或数种抗生素抗性基因抗生素抗性基因，使寄主获，使寄主获得同样的抗生素抗性性状（得同样的抗生素抗性性状（resistance）。）。符合基因工程的安全要求。符合基因工程的安全要求。磺胺氨苄青霉素卡那霉素四环素链环素汞盐抗性带有控制带有控制大肠杆菌素（大肠杆菌素（colicin）合合成的基因。成的基因。（2）Col质粒：质粒：大肠杆菌素对不带大肠杆菌素对不带Col质粒的大肠杆菌有毒。质粒的大肠杆菌有毒。Col质粒或质粒或R质粒如果带有转移基因，质粒如果带有转移基因，也可以成为接合型质

23、粒。也可以成为接合型质粒。2、依据可否引起宿主细胞出现新性状分类、依据可否引起宿主细胞出现新性状分类显性质粒显性质粒:宿主细胞由于含有宿主细胞由于含有质粒而获得新性状质粒而获得新性状隐蔽质粒隐蔽质粒:宿主细胞含有此类质粒而无异样性状宿主细胞含有此类质粒而无异样性状隐蔽是因为受检测的手段的限制，而不能观测到新性状隐蔽是因为受检测的手段的限制，而不能观测到新性状A. 严紧型质粒（严紧型质粒（stringent plasmid）拷贝数少拷贝数少，只有，只有13份拷贝。份拷贝。B. 松弛型质粒（松弛型质粒（relaxed plasmid）拷贝数多拷贝数多，有，有1060份拷贝。份拷贝。（接合型质粒分子

24、量大，一般属严紧型）。（接合型质粒分子量大，一般属严紧型）。（非接合型质粒分子量小，一般属松弛型）。（非接合型质粒分子量小，一般属松弛型）。3、依据质粒的复制特性分类、依据质粒的复制特性分类低或单拷贝质粒的复制必需由复制子本身编码一个必不低或单拷贝质粒的复制必需由复制子本身编码一个必不可少的顺式作用蛋白可少的顺式作用蛋白(repA)来对复制起点作正调控作用，来对复制起点作正调控作用，如如psc101等，同时其复制受宿主蛋白合成的影响。所以等，同时其复制受宿主蛋白合成的影响。所以这些质粒的拷贝数不能通过诸如这些质粒的拷贝数不能通过诸如氯霉素氯霉素等蛋白质合成抑等蛋白质合成抑制剂来增加拷贝数制剂来

25、增加拷贝数1） 松弛复制型松弛复制型多拷贝质粒（多拷贝质粒（pMB1或或ColE1等）的复制不受等）的复制不受宿主菌蛋白合成的影响的影响；当蛋白质合成宿主菌蛋白合成的影响的影响；当蛋白质合成不能进行时，复制依然进行不能进行时，复制依然进行2)严紧型复制严紧型复制三、质粒的不亲和性三、质粒的不亲和性亲缘关系密切的质粒一般属于不亲和性质粒，如野生型质粒与其衍生的重组质粒往往属于不亲和性质粒。 （攘外必先安内） 不同质粒有的可共存于同一细胞之中，但有的不行。把能同寓于一细胞中的不同质粒称为亲和性质粒。相反不能同寓于一细胞中的不同质粒称为不亲和性质粒或不相容性质粒。（1）分子量大，拷贝数低）分子量大，

26、拷贝数低四、质粒载体的构建四、质粒载体的构建1. 天然质粒的局限性天然质粒的局限性第一个用于基因克隆的天然质粒第一个用于基因克隆的天然质粒pSC101，分子长，分子长 9.1 kb。但只有一个但只有一个EcoR I切点充当克隆位切点充当克隆位点，点，Tetr 作为筛选标志。作为筛选标志。ColE1质粒的筛选标志是大肠杆菌质粒的筛选标志是大肠杆菌素素E1（colicin E1）。）。（2）筛选标志不理想）筛选标志不理想可以通过插入失活筛选。但细菌群体容可以通过插入失活筛选。但细菌群体容易自发突变出抗易自发突变出抗colicin E1的细胞的细胞.colicin E1能杀死不含能杀死不含ColE1

27、 质粒的菌，质粒的菌，形成形成“噬菌斑噬菌斑”。唯一的克隆位点唯一的克隆位点 EcoR I 正好位于这个正好位于这个基因的内部。基因的内部。ColE1（1）具有复制起点（）具有复制起点（ORI）2. 质粒载体必须具备的基本条件质粒载体必须具备的基本条件（2）具有抗菌素抗性基因）具有抗菌素抗性基因（3）若干限制性内切酶的单一位点：）若干限制性内切酶的单一位点：是筛选的标志。理想的载体应该有两是筛选的标志。理想的载体应该有两种抗菌素抗性基因。种抗菌素抗性基因。用来插入外源用来插入外源DNA片段。且插入后不影片段。且插入后不影响复制功能。响复制功能。（4）具有较小的分子量和较高的拷贝数。）具有较小的

28、分子量和较高的拷贝数。3. 构建构建质粒克隆载体的基本原则质粒克隆载体的基本原则A、选用合适的出发质粒。出发质粒（也称为亲本质粒）中应含有克隆载体必备的元件，如复制起始原点、用于选择标记的基因、克隆位点 B、获得构建质粒克隆载体的元件。 C、组装合适的选择标记基因。 D、构建过程中，应尽可能的删除载体上不必要的DNA序列，以缩小质粒的分子量，提高外源DNA的装载量。 E、构建过程中，需要灭活出发质粒上的某些编码基因 氨苄青霉素抗性（氨苄青霉素抗性（Ampr） 卡那霉素抗性卡那霉素抗性 （Kanr） 四环素抗性四环素抗性 （Tetr） 链霉素抗性链霉素抗性 （Strr） 氯霉素抗性氯霉素抗性 （

29、Cmlr）4. 质粒的选择标记及其工作原理：质粒的选择标记及其工作原理：（1）选择标记）选择标记绝大多数质粒载体都是用抗菌素抗性绝大多数质粒载体都是用抗菌素抗性标记：标记： 氨苄青霉素抗性基因氨苄青霉素抗性基因（Ampicillin resistance gene, ampr）氨苄青霉素抗性基因是基氨苄青霉素抗性基因是基因操作中使用最广泛的选择标因操作中使用最广泛的选择标记，绝大多数在大肠杆菌中克记，绝大多数在大肠杆菌中克隆的质粒载体带有该基因。青隆的质粒载体带有该基因。青霉素可抑制细胞壁肽聚糖的合霉素可抑制细胞壁肽聚糖的合成，与有关的酶结合并抑制其成，与有关的酶结合并抑制其活性，抑制转肽反应

30、。活性，抑制转肽反应。 四环素可与核糖体四环素可与核糖体 30S 亚基的一亚基的一种蛋白质结合，从而抑制核糖体的种蛋白质结合，从而抑制核糖体的转位。四环素抗性基因编码一个由转位。四环素抗性基因编码一个由 399 个氨基酸组成的膜结合蛋白，个氨基酸组成的膜结合蛋白，可阻止四环素进入细胞。可阻止四环素进入细胞。 pBR322 质粒除了带有氨苄青霉素抗性基因质粒除了带有氨苄青霉素抗性基因外，还带有四环素抗性基因。外，还带有四环素抗性基因。 四环素抗性基因四环素抗性基因（Tetracycline resistance gene, tetr） 氯霉素抗性基因氯霉素抗性基因（chloramphenicol

31、 resistance gene, Cmr, cat） 氯霉素可与核糖体氯霉素可与核糖体 50S 亚基结亚基结合并抑制蛋白质合成。目前使用的合并抑制蛋白质合成。目前使用的氯霉素抗性基因来源于转导性氯霉素抗性基因来源于转导性 P1 噬噬菌体（也携带菌体（也携带 Tn9）。）。cat 基因编码氯霉素乙酰转移酶，基因编码氯霉素乙酰转移酶，一个四聚体细胞质蛋白（每个亚基一个四聚体细胞质蛋白（每个亚基 23kDa）。在乙酰辅酶）。在乙酰辅酶 A 存在的条存在的条件下，该蛋白催化氯霉素形成氯霉件下，该蛋白催化氯霉素形成氯霉素羟乙酰氧基衍生物，使之不能与素羟乙酰氧基衍生物，使之不能与核糖体结合。核糖体结合。

32、 卡那霉素和新霉素抗性基因卡那霉素和新霉素抗性基因（kanamycin/neomycin resistance gene, kanr, neor） 卡那霉素和新霉素是一种脱氧链霉胺氮基糖苷，都可与核卡那霉素和新霉素是一种脱氧链霉胺氮基糖苷，都可与核糖体结合并抑制蛋白质合成。糖体结合并抑制蛋白质合成。 卡那霉素和新霉素抗性基因实际卡那霉素和新霉素抗性基因实际就是一种编码氨基糖苷磷酸转移酶（就是一种编码氨基糖苷磷酸转移酶（APH（3）-, 25kDa）的基因，氨基糖苷磷酸转移酶可使这两种抗生素磷酸化，从而的基因，氨基糖苷磷酸转移酶可使这两种抗生素磷酸化，从而干扰了它们向细胞内的主动转移。在细胞中合

33、成的这种酶可以干扰了它们向细胞内的主动转移。在细胞中合成的这种酶可以分泌至外周质腔，保护宿主不受这些抗生素的影响。分泌至外周质腔，保护宿主不受这些抗生素的影响。 kanamycin/neomycin resistance gene, kanr, neor在基因的编码区中，若某个密码子发生突变后变成终止密码在基因的编码区中，若某个密码子发生突变后变成终止密码子，则称这样的突变为子，则称这样的突变为赭石突变（突变为赭石突变（突变为 UAA），或琥珀突变），或琥珀突变（突变为（突变为 UAG），或乳白突变（突变为），或乳白突变（突变为 UGA）。 supF 基因编码细菌的抑制性基因编码细菌的抑制性

34、tRNA ，可在，可在 UAG 密码子上编密码子上编译酪氨酸。译酪氨酸。 琥珀突变抑制基因琥珀突变抑制基因 supF如果在某一宿主中含具琥珀突变的如果在某一宿主中含具琥珀突变的 tetr 基因和基因和 ampr 基因，只基因，只有当宿主含有有当宿主含有 supF 基因时才会对基因时才会对 Amp 和和 Tet 具有抗性。具有抗性。supE 基因在基因在 UAG 密码子上编译谷氨酰氨。密码子上编译谷氨酰氨。来自淀粉水解芽胞杆菌来自淀粉水解芽胞杆菌 （Bacillus amyloliquefa- ciens） ，编码果聚糖蔗糖酶。，编码果聚糖蔗糖酶。在含蔗糖的培养基上在含蔗糖的培养基上 sacB

35、基因的表达对大肠杆菌来基因的表达对大肠杆菌来说是致死的，因此该基因可用说是致死的，因此该基因可用于插入失活筛选重组子。于插入失活筛选重组子。 蔗糖致死基因蔗糖致死基因 SacB使受体菌发生遗传性状的改变的基因。使受体菌发生遗传性状的改变的基因。营养标记营养标记其他标记：如蓝白斑筛选其他标记：如蓝白斑筛选当带有当带有抗菌素抗性基因抗菌素抗性基因的的载体载体进入受体菌进入受体菌后，受体菌才能生长。后，受体菌才能生长。不带有不带有抗菌素抗性基因抗菌素抗性基因的受体菌不能在的受体菌不能在含有抗菌素的培养基（选择培养基）中含有抗菌素的培养基（选择培养基）中生长。生长。（2）抗菌素选择原理）抗菌素选择原理

36、活活死死抗性基因抗性基因抗菌素抗菌素（1）高拷贝数的质粒载体）高拷贝数的质粒载体ColE1、pMB1派生质粒具有高拷贝数派生质粒具有高拷贝数的特点。的特点。而且在没有菌体蛋白质合成的条件下而且在没有菌体蛋白质合成的条件下（蛋白质合成抑制剂，氯霉素等存在（蛋白质合成抑制剂，氯霉素等存在下）仍能复制，达到每个细胞的拷贝下）仍能复制，达到每个细胞的拷贝数数1000100030003000个！个！适合大量增殖克隆基因、或需要表达适合大量增殖克隆基因、或需要表达大量的基因产物。大量的基因产物。（2）低拷贝数的质粒载体）低拷贝数的质粒载体 但有特殊用途但有特殊用途:由由pSC101派生来的载体特点是分子量

37、小，派生来的载体特点是分子量小，拷贝数低。拷贝数低。当有些被克隆的基因的表达产物过多时会当有些被克隆的基因的表达产物过多时会严重地影响寄主菌的正常代谢活动，导致严重地影响寄主菌的正常代谢活动，导致寄主菌死亡时，就需要低拷贝的载体。寄主菌死亡时，就需要低拷贝的载体。pLG338、pLG339、pHSG415等等不适合大量扩增不适合大量扩增DNA用。用。（3）失控的质粒载体）失控的质粒载体这是一类这是一类温度敏感型复制控制温度敏感型复制控制质粒。质粒。温度低（低于温度低（低于35 oC），拷贝数很少；），拷贝数很少； 温度增加（温度增加（35 oC）时，拷贝数会很快增）时，拷贝数会很快增加到加到1

38、000个以上。个以上。如如pBEU1、pBEU2。runaway plasmid vectors1979年年B. E. Uhlin等构建。等构建。（4） 插入失活型质粒载体插入失活型质粒载体载体的克隆位点位于其某一个选择性载体的克隆位点位于其某一个选择性标记基因内部。标记基因内部。如如pDF41、pDF42、pBR329。抗菌素抗性抗菌素抗性外源外源DNA无抗菌素抗性无抗菌素抗性正选择的质粒载体正选择的质粒载体如如pUR2、pTR262等。等。只有带有选择标记基因的转化菌细胞才只有带有选择标记基因的转化菌细胞才能在选择培养基上生长。能在选择培养基上生长。直接选择转化后的细胞。直接选择转化后的细

39、胞。目前通用的绝大部分质粒载体都是正目前通用的绝大部分质粒载体都是正选择载体。选择载体。Direct selection vectorsSmaIBamHIEcoRIHpaIEcoRIHindKil基因Pkn80（17kb）PKN80质粒带有来自Mu噬菌体DNA的EcoRI-C片段，它编码一种kil基因，使Mu噬菌体非溶源菌株致死。 HindIII位点上插入外源DNA HindIII位点无插入外源DNA Kil基因无活性Kil基因有活性Mu噬菌体非溶源菌株致死Mu噬菌体非溶源菌株存活（6） 表达型质粒载体表达型质粒载体主要用来使外源基因表达出蛋白质产物。主要用来使外源基因表达出蛋白质产物。如果在

40、大肠杆菌里表达，必须把所克隆如果在大肠杆菌里表达，必须把所克隆的真核生物的基因置于大肠杆菌的转的真核生物的基因置于大肠杆菌的转录录翻译信号控制之下。翻译信号控制之下。注意启动子的性质，终止子、起始注意启动子的性质，终止子、起始密码、终止密码的阅读正确。密码、终止密码的阅读正确。复制起始点复制起始点ORI、 选择标记、选择标记、 多克隆位点多克隆位点MCS2）大肠杆菌操纵子元件）大肠杆菌操纵子元件阻遏基因阻遏基因 I 操纵基因操纵基因O 启动基因启动基因P 核糖体结合位点序列（核糖体结合位点序列（SD） 转录终止信号区。转录终止信号区。1）普通载体元件）普通载体元件 表达载体的表达载体的结构结构

41、1）普通载体元件）普通载体元件复制起始点复制起始点ORI、 选择标记、选择标记、 多克隆位点多克隆位点MCS2）大肠杆菌操纵子元件）大肠杆菌操纵子元件阻遏基因阻遏基因 I 操纵基因操纵基因O 启动基因启动基因P 核糖体结合位点序列（核糖体结合位点序列（SD） 转录终止信号区。转录终止信号区。五、经典的大肠杆菌质粒载体五、经典的大肠杆菌质粒载体1. pSC101第一个成功地用于克隆实验的大肠杆菌质第一个成功地用于克隆实验的大肠杆菌质粒载体。粒载体。（1）类型）类型天然质粒，属低拷贝型。天然质粒，属低拷贝型。（2）长度）长度9.09 kb。（3）选择标记）选择标记四环素抗性四环素抗性Tetr6个克

42、隆位点：个克隆位点： EcoR I、Xho I、Pvu I、Hind III、BamH I、Sal I 主要使用主要使用EcoR I。（其中（其中Hind III、BamH I、Sal I 3个位个位于选择标记于选择标记Tetr的内部）的内部）（4）克隆位点）克隆位点2. ColE1（1）类型）类型天然质粒，属高拷贝型。天然质粒，属高拷贝型。（2）长度）长度6.3 kb。（3）选择标记）选择标记大肠杆菌素（大肠杆菌素（colicin）E1和对和对E1免疫的基因（免疫的基因（immE1）特点是在培养基中加入氯霉素抑制细菌特点是在培养基中加入氯霉素抑制细菌蛋白质合成后，质粒仍然能复制达到每蛋白质合

43、成后，质粒仍然能复制达到每个细胞个细胞1000-30001000-3000拷贝之多！拷贝之多！ colicin E1基因的结构基因的结构ceaimmkil结构基因结构基因免疫基因免疫基因溶菌基因溶菌基因 杀死不含有杀死不含有ColE1细菌的原因细菌的原因cea + kil基因产物基因产物 不被其他细菌的不被其他细菌的colicin E1所杀死的原因所杀死的原因imm基因基因EcoR I位于位于E1内部，插入外源内部，插入外源DNA会导会导致致E1失活，使受体菌不能合成失活，使受体菌不能合成E1（ColE1- -），但仍然表现出对），但仍然表现出对E1免疫型免疫型（ImmE1+ +）。）。Eco

44、R I（4）克隆位点）克隆位点Colicin E1外源外源DNA无无Colicin用对外源用对外源colicin E1的免疫性和自身不能的免疫性和自身不能合成合成colicin E1作选择，操作非常繁杂。作选择，操作非常繁杂。 对对colicin E1敏感的细菌群体中自发突变敏感的细菌群体中自发突变产生抗产生抗colicin E1的频率很高！的频率很高！（5）ColE1的选择缺陷的选择缺陷ColE1抗抗 colicinE1杀杀ColE1- -仍抗仍抗 colicinE1不杀不杀ColE1- -插入片段插入片段ColE1pSP2124质粒的质粒的Ampr基因基因3. pBR322：（1）元件来源

45、）元件来源F. Bolivar和和R.L. Rodriguez人工构建载体。人工构建载体。 复制起点复制起点 oripMB1系列（来源于系列（来源于ColE1）的的高拷贝高拷贝型复制起点型复制起点 Ampr基因基因 Tetr基因基因pSC101的的Tetr 基因。基因。（2）长度）长度4363bp（3）选择标记）选择标记氨苄青霉素和四环素抗性。氨苄青霉素和四环素抗性。（4）克隆位点）克隆位点其中其中9个会导致个会导致Tetr基因失活（如基因失活（如BamH I、Hind 、Sal I）；）； 3个会导致个会导致Ampr基因失活（基因失活（Sca I、PvuI、Pst I）。）。24个克隆位点。

46、个克隆位点。（5）pBR322的优点的优点 双抗菌素抗性选择标记双抗菌素抗性选择标记 插入失活，分两次先后选择：插入失活，分两次先后选择：没有获得载体的寄主细胞没有获得载体的寄主细胞 在在Amp或或Tet中中都都死亡。死亡。获得载体的寄主细胞获得载体的寄主细胞 在在Amp或或Tet其中之一其中之一中死亡。中死亡。外源基因外源基因BamH IAmp中存活中存活但在但在Tet中死亡中死亡外源基因外源基因Pst ITet中存活中存活但在但在Amp中死亡中死亡氯霉素扩增之后，每个细胞可达氯霉素扩增之后，每个细胞可达10003000copy 安全安全失去了转移蛋白基因失去了转移蛋白基因mob（mobil

47、ization）。）。不能通过接合转移。不能通过接合转移。高拷贝数高拷贝数 分子小，克隆能力大分子小，克隆能力大载体越小越好。载体越小越好。 10kb的的DNA在纯化过程中容易段裂。在纯化过程中容易段裂。保留了转移蛋白（保留了转移蛋白（mob）的）的作用位点作用位点。能够被能够被ColK质粒编码的质粒编码的mob蛋白识别，蛋白识别，如果再有如果再有F质粒的参与，就有可能转移！质粒的参与，就有可能转移！ 删除删除mobmob识别位点识别位点（如质粒（如质粒pBR327、pAT153等）。等）。pAT153：从从pBR322上切去上切去HaeII片段，既除片段，既除去了去了mob识别位点，又增加质

48、粒的识别位点，又增加质粒的拷贝数。拷贝数。（7）PBR322的改进的改进pBR325：在在pBR322位点上接入一段来自噬菌位点上接入一段来自噬菌体体PICm的的HaeII酶切片段（带有氯霉酶切片段（带有氯霉素抗性基因素抗性基因cmlr）。）。 cmlr上也带一个上也带一个EcoRI位点位点。使使EcoRI 也成为插入失活型位点。也成为插入失活型位点。 改造改造EcoR I 位点位点University of California的的J. Messing和和J. Vieria于于1978年，在年，在pBR322的基础上改的基础上改造而成。属正选择载体。造而成。属正选择载体。pUC7、pUC8、

49、pUC9、pUC10、pUC11、pUC18、pUC19 复制起点复制起点pBR322的的 ori但其上失去了克隆位点。但其上失去了克隆位点。 Ampr 基因基因（1）元件来源）元件来源 lacZ的启动子的启动子大肠杆菌大肠杆菌 lacZ基因基因大肠杆菌大肠杆菌lacZ的的 -肽链序列，肽链序列， 是是LacZ 的氨基端片段。的氨基端片段。pBR322的的Ampr基因基因（2）长度）长度约约2.7kb（3）克隆位点）克隆位点10个连续的单一限制酶切位个连续的单一限制酶切位点，位于点，位于lacZ基因的基因的5端。端。Ampicillin 抗性抗性和和 lacZ的的 肽互补肽互补（蓝白（蓝白斑）

50、相结合。斑）相结合。（4）选择标记）选择标记蓝白斑选择原理：蓝白斑选择原理： Xgal（5-Bromo-4-chloro-3-indolyl- -D-galactoside） -半乳糖苷酶半乳糖苷酶能把无色的化合物能把无色的化合物Xgal分解成半乳糖和一个分解成半乳糖和一个深蓝色深蓝色的的物质物质5-溴溴-4-氯靛蓝。氯靛蓝。Xgal半乳糖半乳糖5-溴溴-4-氯靛蓝氯靛蓝 -半乳糖苷酶半乳糖苷酶 -半乳糖苷酶半乳糖苷酶Xgal显色反应：显色反应：lacZ的的 肽互补肽互补1） -肽（肽（ lacZ ）：）： -半乳糖苷酶半乳糖苷酶N端的一段氨基酸片段端的一段氨基酸片段（11-41氨基酸）。氨基

51、酸）。lacZ只有在只有在4 4聚体的状态下才有功能聚体的状态下才有功能. .C端大部分端大部分N端的端的11-41aaC端大部分端大部分N端的端的11-41aaC端大部分端大部分N端的端的11-41aaC端大部分端大部分N端的端的11-41aa4聚体聚体2）受体菌）受体菌lacZ突变突变受体菌基因组的受体菌基因组的 -半乳糖苷酶基因的半乳糖苷酶基因的氨基端有缺失（缺失氨基端有缺失（缺失 肽），不能形成肽），不能形成4聚体的活性酶，不能分解聚体的活性酶，不能分解Xgal 。受体菌株：受体菌株：JM系列系列、TG1、TG2、XL1-blue、XS127、XS101、KK2186、MV1184、D

52、H5a。pUC质粒载体上的质粒载体上的lacZ 编码编码 肽与这个肽与这个缺失突变的缺失突变的 -半乳糖苷酶半乳糖苷酶“互补互补”，使它，使它能形成能形成4聚体。又能分解聚体。又能分解Xgal。产生蓝。产生蓝色物质。色物质。C端大部分端大部分N端的端的11-41aapUC lacZ 受体菌受体菌lacZ3）载体）载体lacZ与与 互补互补4） 互补的插入失活互补的插入失活pUC载体上载体上LacZ的的5端有一段多克隆位端有一段多克隆位点点(MCS)区，本身虽不干扰区，本身虽不干扰LacZ的合的合成，但插入外源基因就会阻止成，但插入外源基因就会阻止LacZ的的合成。不能互补。合成。不能互补。 l

53、acZ 5 3 肽移码突变肽移码突变lacZ 5 3 肽肽不互补不互补互补互补MCS外源外源DNAIPTG是乳糖的类似物。能诱导是乳糖的类似物。能诱导lac操操纵子的启动转录，使受体菌基因组中纵子的启动转录，使受体菌基因组中的的lacZ 的的C端部分端部分和载体的和载体的lacZ 肽肽都表达。从而互补。都表达。从而互补。但载体但载体MCSMCS上插入外源上插入外源DNADNA后，仍然后，仍然不能产生不能产生 肽！肽！IPTG通过看培养皿上的菌斑的颜色就能直接知道通过看培养皿上的菌斑的颜色就能直接知道是否有是否有DNADNA插入。插入。MCS无插入时，互补，蓝菌斑。无插入时，互补，蓝菌斑。 MC

54、S有插入时，不互补，白菌斑。有插入时，不互补，白菌斑。IPTG诱导的结果：诱导的结果：无质粒的无质粒的 受体菌受体菌 - -半乳糖苷酶半乳糖苷酶部分缺失，不部分缺失，不能分解能分解XgalXgal；无抗菌素抗性无抗菌素抗性在含抗菌素在含抗菌素和和XgalXgal的培的培养基上培养养基上培养无菌斑无菌斑生长生长质粒转化质粒转化的受体菌的受体菌 - -半乳糖苷酶的半乳糖苷酶的缺失被载体产物缺失被载体产物 互补，能分解互补，能分解XgalXgal。且有抗菌。且有抗菌素抗性素抗性在含抗菌素在含抗菌素和和XgalXgal的培的培养基上培养养基上培养有蓝色有蓝色菌斑生菌斑生长长带外源带外源DNADNA插插

55、入的质粒转化入的质粒转化的受体菌的受体菌载体产物失活，载体产物失活，不能互补不能互补 - -半半乳糖苷酶乳糖苷酶的缺的缺失。不能分解失。不能分解XgalXgal，但有抗，但有抗菌素抗性菌素抗性在含抗菌素在含抗菌素和和XgalXgal的培的培养基上培养养基上培养有白色有白色菌斑生菌斑生长长 更小的分子量：更小的分子量：如如pUC18为为2682bp，pUC8为为2750bp。 选择方便选择方便Xgal显色、抗菌素双重直接选择。显色、抗菌素双重直接选择。 克隆便利克隆便利具有多克隆位点（具有多克隆位点（MCS），使有两个不），使有两个不同粘性末端的外源同粘性末端的外源DNA方便地插入。方便地插入。

56、 测序方便测序方便pUC的的MCS与与M13噬菌体载体的噬菌体载体的MCS完全相同，完全相同，便于把外源便于把外源DNA转移到转移到M13载体上测序。载体上测序。六、其它质粒载体六、其它质粒载体1. pGEM-3Z由由pUC派生而来。派生而来。与与pUC的主要区别是在的主要区别是在MCS的两侧分别的两侧分别加了一个噬菌体加了一个噬菌体启动子启动子T7和和SP6。T7启动子启动子SP6启动子启动子MCSlacZ Amprori可被可被T7和和SP6的的RNA聚合酶识别转录。聚合酶识别转录。 如果加入纯化的如果加入纯化的T7或或SP6 RNA聚合酶，聚合酶，在试管里就可以转录在试管里就可以转录mR

57、NA 外源基因正接反接都可以转录。外源基因正接反接都可以转录。 MCS与与pUC18的完全一样。的完全一样。2. pGEM-4Z：与与pGEM-3Z相同，只是相同，只是T7启动子和启动子和SP6启动子的启动子的位置互换位置互换。pGEM-3Z的特点：的特点：（1 1）穿梭质粒载体的结构）穿梭质粒载体的结构人工构建的、具有人工构建的、具有两种不同复制起点两种不同复制起点和选和选择标记、可以在择标记、可以在两种不同的寄主细胞中存两种不同的寄主细胞中存活和复制活和复制的质粒载体。的质粒载体。Yeast复制起点复制起点E.coli复制起点复制起点E.coli选择标记选择标记Yeast选择标记选择标记M

58、CS大肠杆菌大肠杆菌枯草杆菌穿梭载体枯草杆菌穿梭载体 大肠杆菌大肠杆菌酿酒酵母穿梭载体酿酒酵母穿梭载体 大肠杆菌大肠杆菌动物细胞穿梭载体动物细胞穿梭载体（2 2）常用的穿梭质粒载体）常用的穿梭质粒载体（3 3）穿梭载体的优点）穿梭载体的优点 也能利用其它细胞系统（酵母、枯草杆也能利用其它细胞系统（酵母、枯草杆菌、哺乳动物细胞等）进行基因表达。菌、哺乳动物细胞等）进行基因表达。 可以自如地在两种不同寄主细胞之可以自如地在两种不同寄主细胞之间来回转移基因。间来回转移基因。克隆、构建克隆、构建表达表达E.coliAnimal cell 利用大肠杆菌进行基因克隆、表达利用大肠杆菌进行基因克隆、表达AA

59、TTT vectorPCR productT4 DNA ligaseAA七、质粒载体的不稳定性七、质粒载体的不稳定性1. 质粒稳定遗传必须的两个条件：质粒稳定遗传必须的两个条件：（1）每个世代、每个质粒至少要复制一次）每个世代、每个质粒至少要复制一次（2）在细胞分裂时，复制过的质粒必须分）在细胞分裂时，复制过的质粒必须分 配到两个子细胞中。配到两个子细胞中。有主动分配和随机分配两种假说。有主动分配和随机分配两种假说。（1）主动分配）主动分配天然质粒。天然质粒。具有一个控制质粒拷贝分配的功能区具有一个控制质粒拷贝分配的功能区（Par），能以主动分配的方式确保质），能以主动分配的方式确保质粒能正确

60、分配到两个子细胞中。粒能正确分配到两个子细胞中。人工构建的质粒载体人工构建的质粒载体缺失了缺失了par区区，只，只能以随机分配方式分到子细胞中。能以随机分配方式分到子细胞中。人工质粒。人工质粒。（一般情况下也能保证质粒的稳定遗传）（一般情况下也能保证质粒的稳定遗传）（2）随机分配）随机分配但在一定条件下会出现质粒丢失的现象。但在一定条件下会出现质粒丢失的现象。在寄主菌细胞分裂的过程中，有一个细在寄主菌细胞分裂的过程中，有一个细胞没有获得质粒拷贝，并最终繁殖成无胞没有获得质粒拷贝，并最终繁殖成无质粒的优势群体。质粒的优势群体。3. 分离的不稳定性分离的不稳定性（segregation insta