细胞与原生质体培养

1、10.1.1 概念概念植物细胞培养（植物细胞培养（plant cell culture）是）是指对游离的植物指对游离的植物细胞或细胞小聚体细胞或细胞小聚体进行进行的离体无菌培养。的离体无菌培养。Cell culture for UV-elicitation in a Petri dish根据培养规模根据培养规模: 小规模小规模培养和培养和大批量培养大批量培养；根据培养方式根据培养方式: 悬浮培养悬浮培养、单细胞培养单细胞培养等；等；根据要求产物根据要求产物: 用于用于诱变诱变的的细胞培养和细胞培养和生生产次生产次生产物产物的的细胞培养。细胞培养。Cell cultures for UV-eli

2、citation, one day before UV exposure（1）概念：）概念：是指将植物的细胞是指将植物的细胞和细胞小聚体悬浮在液体培养基和细胞小聚体悬浮在液体培养基中进行培养，使之在体外繁殖、中进行培养，使之在体外繁殖、生长、发育，并在培养过程中能生长、发育，并在培养过程中能保持很好的分散性的技术。保持很好的分散性的技术。（2）来源：）来源：愈伤组织、某个器愈伤组织、某个器官或组织，甚至幼嫩的植株。官或组织，甚至幼嫩的植株。Bioreactor for continuous cell suspensionsShaker for suspension cultureCulture

3、 wheelu细胞可以不断增殖，形成高密度的细胞群细胞可以不断增殖，形成高密度的细胞群体，适于大规模培养；体，适于大规模培养；u能够提供大量较为均匀的细胞，为研究细能够提供大量较为均匀的细胞，为研究细胞的生长、分化创造方法和条件。胞的生长、分化创造方法和条件。 5L 光照植物细胞培养罐光照植物细胞培养罐600600800 mg800 mg生长旺盛的愈伤组织生长旺盛的愈伤组织250 ml250 ml含含303040 ml40 ml培养基的三角瓶中培养基的三角瓶中9090130 r130 rminmin连续振荡培养连续振荡培养2 23 3周周用用100100130130目网过滤除去大的细胞团目网过

4、滤除去大的细胞团滤液离心收集游离细胞，弃上清液滤液离心收集游离细胞，弃上清液加入适当体积的培养基使细胞悬浮加入适当体积的培养基使细胞悬浮图图10-1 由培养的愈伤组织中游离单细胞由培养的愈伤组织中游离单细胞 由培养愈伤组织中游离单细胞由培养愈伤组织中游离单细胞由培养愈伤组织中游离单细胞由培养愈伤组织中游离单细胞由完整植物器官中分离单细胞由完整植物器官中分离单细胞机机械械研研磨磨法：法： 研磨法研磨法分离植物分离植物单细胞程序单细胞程序植物组织进行常规消毒植物组织进行常规消毒切成小块（叶片需先撕去下表皮后切切成小块（叶片需先撕去下表皮后切块）块）用培养基悬浮，洗涤细胞用培养基悬浮，洗涤细胞23次

5、次悬浮在一定体积的培养基中悬浮在一定体积的培养基中收集滤液离心，弃上清液（酶液）收集滤液离心，弃上清液（酶液）120目网过滤，除渣目网过滤，除渣放入酶液中解离放入酶液中解离2h（酶液内含（酶液内含0.5离析酶；离析酶；0.8甘露醇；甘露醇；1硫酸葡聚糖钾）硫酸葡聚糖钾）离心收集细胞离心收集细胞图图 酶法分离植物细胞的程序酶法分离植物细胞的程序由完整植物器官中分离单细胞由完整植物器官中分离单细胞果果胶胶酶酶分分离离法：法：分批培养：分批培养：把植物细胞分散在一定容积的培养基中把植物细胞分散在一定容积的培养基中进行培养，在培养过程中除了气体和挥发性代谢产进行培养，在培养过程中除了气体和挥发性代谢产

6、物可以同外界交换外，一切都是密闭的，物可以同外界交换外，一切都是密闭的，当培养基当培养基中的主要营养物质耗尽时，细胞的分裂和生长即行中的主要营养物质耗尽时，细胞的分裂和生长即行停止。停止。连续培养：连续培养：利用特制的培养容器进行大规模细胞培利用特制的培养容器进行大规模细胞培养的一种培养方式。养的一种培养方式。 在连续培养中，由于新鲜培养基的不断加入，在连续培养中，由于新鲜培养基的不断加入，同时旧培养基不断排出，因而，在培养物的容积保同时旧培养基不断排出，因而，在培养物的容积保持恒定的条件下，持恒定的条件下，培养液中的营养物质能够得到不培养液中的营养物质能够得到不断补充，使培养细胞能够稳定连续

7、生长。断补充，使培养细胞能够稳定连续生长。（1）概念：）概念：是指从植物器官、愈伤组织或是指从植物器官、愈伤组织或悬浮细胞培养液中游离出单个细胞，于无菌悬浮细胞培养液中游离出单个细胞，于无菌条件下，进行体外培养，使其繁殖、生长、条件下，进行体外培养，使其繁殖、生长、发育的一门技术。发育的一门技术。（2）分离：）分离：l由完整的植物器官分离单细胞由完整的植物器官分离单细胞l由培养组织中分离单细胞由培养组织中分离单细胞撕去下表皮露出叶肉细胞用解剖刀刮下细胞机械法机械法:第一种方法：用刀片刮叶片第一种方法：用刀片刮叶片第二种方法：叶片研碎、离心研碎成粉加研磨介质过滤、离心酶解法:Takebe等（19

8、68）最早报道：用果胶酶处理可以分离大量的叶肉细胞加果胶酶过滤、离心由培养组织分离单细胞茎段步骤：步骤： 诱导诱导产生愈伤组织；产生愈伤组织； 愈伤组织愈伤组织反复继代，使组反复继代，使组织不断增殖，提高愈伤组织织不断增殖，提高愈伤组织的松散性；的松散性；摇床用于振荡继代悬浮（Suspension culture)将愈伤组织在液体培将愈伤组织在液体培养基中培养，建立悬养基中培养，建立悬浮培养浮培养物。物。15ml medium/1g120rpm culturetransfer 1time/3d 3 weeks100-130目网过滤Centrifuge(离心） isolation看护培养（看护培

9、养（nurse culture），也称饲喂层），也称饲喂层培养（培养（feeder layer technique），是指用一），是指用一块愈伤组织或植物离体组块愈伤组织或植物离体组织看护单细胞使其生长并织看护单细胞使其生长并增殖的一种单细胞培养方增殖的一种单细胞培养方法。法。平板培养：平板培养：将将悬浮培养的细胞悬浮培养的细胞接种到一薄层固接种到一薄层固体培养基中进行体培养基中进行的培养称之为平的培养称之为平板培养板培养1. 具一定密度的细胞悬浮液；2. 冷却到35的琼脂培养基；3.悬浮细胞与35的液体琼脂培养基混合；4. 倒入无菌培养皿中制成平板。5.在25条件下培养21d形成单细胞无性系

10、 微室培养：微室培养：是指将含是指将含有单细胞的培养液小滴有单细胞的培养液小滴滴入无菌小室中，在无滴入无菌小室中，在无菌条件下，使细胞得以菌条件下，使细胞得以生长和增殖，形成单细生长和增殖，形成单细胞无性系的培养方法。胞无性系的培养方法。10.4.1 植物细胞次生物质的生产植物细胞次生物质的生产植物细胞的次生物质：主要是指那些由植物植物细胞的次生物质：主要是指那些由植物细胞产生的、对其生存不起或很少起作用的细胞产生的、对其生存不起或很少起作用的特定化合物。特定化合物。表10-2 几种植物天然产物的来源和用途（引自Chawla，2002）化合物植物种类用途除虫菊酯茼蒿（Chrysanthemum

11、 cincerarie folium）杀虫剂万寿菊（Tagetus）杀虫剂长春碱、阿马里斯长春花（Catharanthus roseus）抗肿瘤奎宁正金鸡纳树（Cinchona officinalis）抗疟药地高辛、利血平狭叶毛地黄（Digitalis lanlata）强心剂、强胃剂茉莉油茉莉（Jasmium spp）香水甜菊苷甜叶菊（Stevia rebaudiana） 甜味剂藏花素，苦藏花素番红花（Crocus sativus）香料辣椒素辣椒（Capsicum frutescens） 辣味素香草醛香子兰（Vanilla spp）香料利用植物细胞大规模培养技术已能生产许多利用植物细胞大规模培

12、养技术已能生产许多重要的药物和保健品。重要的药物和保健品。 如长春花碱、紫杉醇、地高辛、东莨菪碱、山莨菪碱、奎宁等重要药物的细胞培养已进入了中试阶段或已进入了规模化生产，日本的紫草素、韩国的人参皂苷、德国的咪叠丁香、美国的紫杉醇、中国的白藜芦醇等已进入了产业化的生产和商品化阶段。香料、调料、食品添加剂、杀虫杀菌剂等一些香料、调料、食品添加剂、杀虫杀菌剂等一些化合物。从较多的研究资料来看，这些次生代化合物。从较多的研究资料来看，这些次生代谢物的生产仅仅停留在实验室阶段，培养细胞谢物的生产仅仅停留在实验室阶段，培养细胞积累的次生代谢物的产量还很有限积累的次生代谢物的产量还很有限生物转化就是利用生物

13、系统把一个分子的一小生物转化就是利用生物系统把一个分子的一小部分或一部分转化成某一种分子。部分或一部分转化成某一种分子。 通过廉价前体生产有价值的、珍贵的植物产品。通过廉价前体生产有价值的、珍贵的植物产品。涉及到水解，加氢、羟基化作用及氧化和还原涉及到水解，加氢、羟基化作用及氧化和还原等步骤。等步骤。方法：方法：第一第一种给细胞种给细胞提供提供一般情况下一般情况下植物所不具备的底植物所不具备的底物化合物物化合物，如人工合成化合物、中间产物类似物，如人工合成化合物、中间产物类似物，或其它物种的植物产物，或其它物种的植物产物，以期得到自然中所不存以期得到自然中所不存在的化合物在的化合物；第二第二种

14、方法是给细胞提供种方法是给细胞提供天然产物的中间体天然产物的中间体（如（如某种化合物的前体），以期提高该种某种化合物的前体），以期提高该种天然化合物天然化合物的产量的产量。最成功的例子最成功的例子就是就是-甲基毛地甲基毛地黄的生物转化黄的生物转化。这一化合物是。这一化合物是通过甲基化由毛地黄毒苷制备通过甲基化由毛地黄毒苷制备的。毛地黄细胞培养，将这一的。毛地黄细胞培养，将这一化合物羟基化为化合物羟基化为-甲基异羟基甲基异羟基毛地黄苷毛地黄苷强心苷强心苷。这是经过。这是经过12羟基化作用而形成的，羟基化作用而形成的，这种这种化合物被广泛的应用于医学化合物被广泛的应用于医学，而至今这一化合物基本上

15、还是而至今这一化合物基本上还是由异羟基毛地黄毒苷的由异羟基毛地黄毒苷的化学甲化学甲基化法来生产的。基化法来生产的。细胞培养使人们细胞培养使人们在细胞水平上对植物进行改在细胞水平上对植物进行改良良及及诱导游离植物单细胞胚胎诱导游离植物单细胞胚胎发生成为可能，发生成为可能，由此而产生植物由此而产生植物细胞变异体的选择细胞变异体的选择技术及技术及人人工种子工种子开辟了植物细胞培养与利用的新开辟了植物细胞培养与利用的新领域。领域。这一重要的实验系统，已被成功地用于这一重要的实验系统，已被成功地用于植物细胞的脱分化、再分化及植物原生植物细胞的脱分化、再分化及植物原生质体细胞壁的再生、细胞的分裂、生长质体

16、细胞壁的再生、细胞的分裂、生长等研究。其等研究。其生长动态的观察研究为揭示生长动态的观察研究为揭示植物细胞生长、分化等相关机理提供了植物细胞生长、分化等相关机理提供了重要的细胞学、遗传学证据。重要的细胞学、遗传学证据。南蛇藤原生质体培养与植株再生植物植物原生质体原生质体（protoplast），就是具有细胞质），就是具有细胞质膜而没有细胞壁的植物细胞。膜而没有细胞壁的植物细胞。植物原生质体培养植物原生质体培养就是通过研究植物原生质体分就是通过研究植物原生质体分离、培养的条件和发育机理，利用一定的技术和离、培养的条件和发育机理，利用一定的技术和方法，从植物细胞中分离出原生质体，经过离体方法，从植

17、物细胞中分离出原生质体，经过离体培养，使其分裂、增殖进而分化成完整植株的技培养，使其分裂、增殖进而分化成完整植株的技术。术。 Fig 1 Plant regeneration from protoplasts of K. blossfeldiana（长寿花）a .Axenic plant used as source of leaf explants; b. leaf explants preculture; c. leaf tissue before and D. after enzymatic digestion; e .protoplast purification; f. first

18、cell divisions; g. protoplast-derived colonies; h. visible small calli; i. green calli; J. organogenic green calli; k .calli with shoots; l .rooted shoot; m .plant acclimatization. Bar=25m原生质体培养的操作实例7a: 7a: 分离原生质体分离原生质体1010天后第天后第1 1次次分裂分裂7b,c:27b,c:2和和3 3周龄小细胞团周龄小细胞团 7d,e: 47d,e: 4和和6 6周龄小愈伤组织周龄小愈伤组

19、织 7f: 7f: 转到转到 B5h B5h 培养基前培养基前8 8周龄周龄小愈伤组织小愈伤组织 8a: 8a: 转到转到 B5H B5H 培养基上的小培养基上的小愈伤组织和体细胞胚诱导愈伤组织和体细胞胚诱导 8b: 8b: 转到转到 Boi2y Boi2y 培养基上的培养基上的球形胚球形胚 8c: 8c: 转到转到MSMS培养基上的子叶期培养基上的子叶期胚以转化为小植株胚以转化为小植株 紫花苜蓿叶片原生质体分裂、克隆体的发育及通紫花苜蓿叶片原生质体分裂、克隆体的发育及通过体细胞胚再生小植株过体细胞胚再生小植株 （1）机械分离法）机械分离法 1953年，年，Yotsuynagi在伊乐藻的叶细胞

20、中发在伊乐藻的叶细胞中发现，当把该叶细胞在一定浓度的氯化钙或硝酸现，当把该叶细胞在一定浓度的氯化钙或硝酸钙溶液中质壁分离持续钙溶液中质壁分离持续50 d，细胞质还有典型，细胞质还有典型的原生质流。如果把质壁分离的细胞切开，有的原生质流。如果把质壁分离的细胞切开，有时可能切掉细胞壁而不损伤其内部结构，从而时可能切掉细胞壁而不损伤其内部结构，从而获得机械法分离的原生质体。获得机械法分离的原生质体。 用机械法分离原生质体的主要缺点是：（用机械法分离原生质体的主要缺点是：（1）原生质体的产量一般很低；（原生质体的产量一般很低；（2）方法繁琐）方法繁琐费力；（费力；（3）这种技术只能用于质壁分离会）这种

21、技术只能用于质壁分离会射出原生质体的那些细胞，而不能从分生组射出原生质体的那些细胞，而不能从分生组织细胞中分离原生质体。织细胞中分离原生质体。需要针对使用的材需要针对使用的材料，料，选择适合的分选择适合的分离酶种类和分离方离酶种类和分离方法法。用于酶法分离植物用于酶法分离植物原生质体的酶类主原生质体的酶类主要有要有纤维素酶、果纤维素酶、果胶酶、崩溃酶、半胶酶、崩溃酶、半纤维素酶、和蜗牛纤维素酶、和蜗牛酶等酶等。纯化后的原生质体与机械法相比，酶法分离植物原生质体有以与机械法相比，酶法分离植物原生质体有以下下优点：优点：（1 1）容易分离出大量的完整原生质）容易分离出大量的完整原生质体；（体；（2

22、 2）只需细胞质发生轻微的渗透收缩，）只需细胞质发生轻微的渗透收缩，几乎能从所有植物组织或细胞中分离出原生几乎能从所有植物组织或细胞中分离出原生质体；（质体；（3 3）细胞不会象机械法那样破碎。）细胞不会象机械法那样破碎。图 11-1 分离的马铃薯原生质体（右，Carlberg等，1983） 和烟草原生质体（左，Poewr，1976）（1）体细胞杂交）体细胞杂交依据细胞膜的相似性，依据细胞膜的相似性，进行细胞融合，利用植进行细胞融合，利用植物物原生质体融合技术进原生质体融合技术进行植物种、属、科间，行植物种、属、科间，甚至遗传关系更远的细甚至遗传关系更远的细胞融合胞融合已成为一个比较已成为一个

23、比较成熟的技术。成熟的技术。图12-8 植物原生质体融合程序植物植物原生质体的原生质体的融合融合1978年，年，Melchers等通过诱导番茄和马铃薯原生质体等通过诱导番茄和马铃薯原生质体的融合得到了第一个属间细胞杂种再生植株的融合得到了第一个属间细胞杂种再生植株“泡马豆”（pomato) 。 培育出的培育出的“泡马豆泡马豆”外型倾向于蕃茄，花叶果外型倾向于蕃茄，花叶果实具有杂种特点，遗憾的是地下部分没有长出科学实具有杂种特点，遗憾的是地下部分没有长出科学家们想象中的大土豆。家们想象中的大土豆。 合成图片合成图片植物体细胞杂交过程中已取得的进展：植物体细胞杂交过程中已取得的进展：如：白菜如：白菜甘蓝、烟草甘蓝、烟草海岛烟草、胡萝卜海岛烟草、胡萝卜羊角芹等种间或属间杂种。羊角芹等种间或属间杂种。植物植物细胞融合的新品种细胞融合的新品种柑橙柑橙以植物原生质体为受体，进行细胞器转移、核置以植物原生质体为受体，进行细胞器转移、核置换及摄入微生物等研究开创了植物细胞工程研究