2015--第14章免疫细胞的分离及检测技术

1、检验科检验科(段朝晖段朝晖)TLE:81332290 81332219E-mail: 第十四章第十四章 免疫细胞的分离及其免疫细胞的分离及其表面标志检测技术表面标志检测技术第一节第一节免疫细胞的分离免疫细胞的分离一、一、外周血单个核细胞分离外周血单个核细胞分离二、二、淋巴细胞的分离淋巴细胞的分离三、三、T细胞和细胞和B细胞的分离细胞的分离四、四、T细胞亚群的分离细胞亚群的分离第二节第二节淋巴细胞标志及亚群分类淋巴细胞标志及亚群分类一、一、T细胞表面标志及其亚群细胞表面标志及其亚群二、二、B细胞表面标志细胞表面标志三、三、NK细胞表面标志细胞表面标志第三节第三节其他的免疫细胞其他的免疫细胞第四节

2、第四节免疫细胞表面标志的检测及应用免疫细胞表面标志的检测及应用一、免疫细胞表面标志的检测方法一、免疫细胞表面标志的检测方法二、淋巴细胞表面标志检测的临床意义二、淋巴细胞表面标志检测的临床意义第十四章第十四章 免疫细胞的分离及其免疫细胞的分离及其表面标志检测技术表面标志检测技术 外周血单个核细胞分离外周血单个核细胞分离 淋巴细胞的分离淋巴细胞的分离 T细胞和细胞和B细胞的分离细胞的分离 T细胞亚群的分离细胞亚群的分离第一节第一节 免疫细胞的分离免疫细胞的分离 外周血单个核细胞外周血单个核细胞(peripheralbloodmononuclearcells,PBMC)包括淋巴细包括淋巴细胞和单核细

3、胞胞和单核细胞(monocyte)不同细胞密度不同不同细胞密度不同不同细胞表面生物学特性不同不同细胞表面生物学特性不同不同细胞表面分化抗原不同不同细胞表面分化抗原不同人的红细胞密度为人的红细胞密度为1.093 1.093 粒细胞密度为粒细胞密度为1.092 1.092 单个核细胞的密度在单个核细胞的密度在1.075-1.0901.075-1.090之间之间 （淋巴细胞和单核细胞）（淋巴细胞和单核细胞）泛影葡胺生理盐水泛影葡胺生理盐水Ficoll分离液法分离液法:泛影葡胺生理盐水泛影葡胺生理盐水主要用于分离外周血主要用于分离外周血中的单个核细胞，是中的单个核细胞，是一种单次差速密度梯一种单次差速

4、密度梯度离心的分离法。度离心的分离法。分离时先将分层液置试分离时先将分层液置试管底层，然后将肝素抗管底层，然后将肝素抗凝全血以凝全血以Hanks液或液或PBS液做适当稀释后，轻轻液做适当稀释后，轻轻叠加在分层液上面，使叠加在分层液上面，使两者形成一个清晰的界两者形成一个清晰的界面。面。水平离心后，离心管中水平离心后，离心管中会出现几个不同层次的会出现几个不同层次的液体和细胞带。液体和细胞带。与分层液密度相当的单与分层液密度相当的单个核细胞密集在血浆层个核细胞密集在血浆层核分液层的界面之中核分液层的界面之中用用1.0770.001的分层液可将细胞分离的分层液可将细胞分离（去除单核细胞）（去除单核

5、细胞）贴壁黏附法贴壁黏附法吸附柱过滤法吸附柱过滤法磁铁吸引法磁铁吸引法Percoll分离液法分离液法(聚乙烯吡咯烷酮处理硅胶聚乙烯吡咯烷酮处理硅胶颗粒颗粒)贴壁黏附法贴壁黏附法将单个核细胞悬液于平皿中培养，单核细胞和粒细胞贴附于平将单个核细胞悬液于平皿中培养，单核细胞和粒细胞贴附于平皿壁上，而未贴壁的细胞几乎全为淋巴细胞皿壁上，而未贴壁的细胞几乎全为淋巴细胞吸附柱过滤法吸附柱过滤法利用单核细胞具有贴壁生长的特点利用单核细胞具有贴壁生长的特点将单个核细胞悬液中注入装有玻璃纤维或葡聚糖凝胶将单个核细胞悬液中注入装有玻璃纤维或葡聚糖凝胶SephadexG10的层析柱中，淋巴细胞无黏附能力，被洗脱的层

6、析柱中，淋巴细胞无黏附能力，被洗脱 磁铁吸引法磁铁吸引法在单个核细胞悬液中加入直径为在单个核细胞悬液中加入直径为3m的羰基铁颗粒。将磁铁置的羰基铁颗粒。将磁铁置于官邸，吸引吞噬铁颗粒的单核细胞，上层液中即为淋巴细胞于官邸，吸引吞噬铁颗粒的单核细胞，上层液中即为淋巴细胞利用单核细胞具有吞噬的特性利用单核细胞具有吞噬的特性Percoll分离液法分离液法(连续密度梯度离心分离法连续密度梯度离心分离法)Percoll法分离单个核细胞中各细胞成分的分布示意图法分离单个核细胞中各细胞成分的分布示意图 E花环沉降法花环沉降法 尼龙毛柱分离法尼龙毛柱分离法利用利用T细胞有绵羊红细胞受体（细胞有绵羊红细胞受体（

7、E受体），其可以受体），其可以与绵羊红细胞结合形成大的细胞集团，进而将与绵羊红细胞结合形成大的细胞集团，进而将T细细胞和胞和B细胞分离细胞分离利用利用B细胞和单核细胞具有易黏附于尼龙纤维表面细胞和单核细胞具有易黏附于尼龙纤维表面的特性，可将的特性，可将T和和B细胞分开细胞分开亲和板结合分离法亲和板结合分离法 磁性微球分离法磁性微球分离法 荧光激活细胞分离仪分离法荧光激活细胞分离仪分离法 NoImageNoImage亲和分离法示意图亲和分离法示意图微球表面包被免疫物质者称为免疫磁珠微球表面包被免疫物质者称为免疫磁珠（Immunomagneticbead，IMB）分选原理分选原理 正选正选 磁珠结

8、合的细磁珠结合的细胞就胞就 是所要分离获是所要分离获得的得的 细胞细胞 负选负选 磁珠结合的细磁珠结合的细胞为胞为 不需要的细胞，不需要的细胞，而而 游离于上清液游离于上清液的细的细 胞为所需要的胞为所需要的细胞细胞 比较项目比较项目大磁珠大磁珠小磁珠小磁珠对细胞的影响对细胞的影响对细胞造成机械压力，影响对细胞造成机械压力，影响其生物学活性，不利于分离其生物学活性，不利于分离后培养后培养对细胞温和，不影响分离细对细胞温和，不影响分离细胞的后续培养胞的后续培养对流式细胞仪的影响对流式细胞仪的影响阻塞流式细胞仪的喷嘴，影阻塞流式细胞仪的喷嘴，影响散射光响散射光可直接上流式细胞仪检测，可直接上流式细

9、胞仪检测，不影响散射光不影响散射光分离条件要求分离条件要求技术简单，分离可在试管中技术简单，分离可在试管中完成完成需要很强的磁场来分离细胞需要很强的磁场来分离细胞收率收率得率高得率高得率不高得率不高纯度纯度纯度低纯度低纯度高纯度高分离时间分离时间分离速度快分离速度快分离速度慢分离速度慢分离成本分离成本成本低成本低需要很强的磁场来分离细胞，需要很强的磁场来分离细胞，需要一次性的分离柱，不能需要一次性的分离柱，不能在普通试管进行在普通试管进行常用于鉴定和检测淋巴细胞表面常用于鉴定和检测淋巴细胞表面标志是簇分化抗原（标志是簇分化抗原（Clusterofdifferentiation，CD）适用于适用

10、于T、B细胞的分离细胞的分离已知已知CD抗原细胞亚群的分离抗原细胞亚群的分离未知未知CD抗原细胞亚群的分离抗原细胞亚群的分离（阴性分选）（阴性分选） CD3+CD4+CD8-辅助性辅助性T细胞细胞 （helpTcell,Th） CD3+CD4-CD8+细胞毒性细胞毒性T细胞细胞 （cytotoxicTcell,TcorCTL） CD4+CD25+调节性调节性T细胞细胞 （regulatoryTcell,TrorTreg） B细胞表面的膜免疫球蛋白细胞表面的膜免疫球蛋白(SmIg)、Fc受体、补体受体、补体受体、受体、EB病毒受体、小鼠红细胞受体以及部分病毒受体、小鼠红细胞受体以及部分CD分子是

11、分子是B细胞的重要表面标志，其中以细胞的重要表面标志，其中以SmIg为为B细细胞所特有，是鉴定胞所特有，是鉴定B细胞可靠的指标细胞可靠的指标 CD19/CD5分子：可将分子：可将B细胞区分为细胞区分为B1细胞和细胞和B2细细胞，胞，B1细胞为细胞为CD19和和CD5双阳性，而双阳性，而B2细胞仅为细胞仅为CD19阳性，阳性，B2细胞为通常所指的细胞为通常所指的B细胞细胞人类人类NK细胞细胞(Naturalkillercell，NK)表面标志主要以表面标志主要以CD16、CD56来认定，来认定，临床上将临床上将CD3-CD56+CD16+淋巴细胞认定淋巴细胞认定为为NK细胞细胞抗原提呈类细胞表面

12、标志抗原提呈类细胞表面标志 免疫细胞表面标志的检测方法免疫细胞表面标志的检测方法 淋巴细胞表面标志检测的临床意义淋巴细胞表面标志检测的临床意义 抗体致敏细胞花环法抗体致敏细胞花环法 免疫细胞化学法免疫细胞化学法 免疫荧光法免疫荧光法 流式细胞分析法流式细胞分析法 淋巴细胞表面标志检测是评价免疫功能的淋巴细胞表面标志检测是评价免疫功能的重要指标重要指标 在评价免疫功能时经常采用在评价免疫功能时经常采用CD4/CD8比值比值 对对CD4+和和CD8+T细胞的测定，有助于免细胞的测定，有助于免疫缺陷疾病、自身免疫性疾病和移植排斥疫缺陷疾病、自身免疫性疾病和移植排斥反应的监测反应的监测 淋巴细胞并不是

13、功能单一的群体，但其淋巴细胞并不是功能单一的群体，但其在光学显微镜下的形态基本是一样的，在光学显微镜下的形态基本是一样的，因此要对其进行进一步的分类和观察就因此要对其进行进一步的分类和观察就不能采用形态学的方法，而要依靠对其不能采用形态学的方法，而要依靠对其表面标志的检测。常用于鉴定和检测计表面标志的检测。常用于鉴定和检测计数淋巴细胞的表面标志是数淋巴细胞的表面标志是CD抗原抗原 进一步区分淋巴细胞亚群可使某一类进一步区分淋巴细胞亚群可使某一类淋巴细胞的功能趋向一致和单一。但淋巴细胞的功能趋向一致和单一。但目前看来，还很少有只通过一个目前看来，还很少有只通过一个CD抗原就能将某一类淋巴细胞亚群

14、指示抗原就能将某一类淋巴细胞亚群指示出来的出来的CD抗原，抗原，CD抗原指示出来的抗原指示出来的淋巴细胞亚群多数都是相对特异淋巴细胞亚群多数都是相对特异 根据根据T细胞的免疫效应功能和表面细胞的免疫效应功能和表面CD分子分子表达至少可以分为：辅助性表达至少可以分为：辅助性T细胞、细胞细胞、细胞毒性毒性T细胞和调节性细胞和调节性T细胞；膜免疫球蛋白细胞；膜免疫球蛋白(SmIg)为为B细胞所特有，是鉴定细胞所特有，是鉴定B细胞可靠细胞可靠的指标，以的指标，以CD5和和CD19为标志可将为标志可将B细胞细胞分为分为B1和和B2两个亚群；目前多以两个亚群；目前多以CD3-、CD16+、CD56+作为作为NK细胞的典型标志细胞的典型标志1.免疫细胞都包括哪些细胞？为什么要将其分免疫细胞都包括哪些细胞？为什么要将其分离纯化？离纯化？2.淋巴细胞有哪几类细胞？能用形态学的方法淋巴细胞有哪几类细胞？能用形态学的方法加以区别吗？加以区别吗？3.将细胞分离的原理有哪些？各有什么特点？将细胞分离的原理有哪些？各有什么特点？4.形态学相同的一类细胞为什么还要分亚群？形态学相同的一类细胞为什么还要分亚群？5.T细胞和细胞和B细胞进一步区分亚群的依据是什细