酶促反映的动力 ppt课件

1、实实 验验 二二 酶促反响动力学实验酶促反响动力学实验实实 验验 原原 理理1、酶促反响的特性：高效性、高特异性、高不稳定性、可调理性。反响体系的条件必需严厉控制。2、酶活性测定的根底是化学反响速度的比较，即酶催化的化学反响速度与无酶或酶失活情况下化学反响速度的比较。反响速度通常以测定单位时间内产物生成量或底物的减少量来确定。3、酶催化反响的典型曲线、酶催化反响的典型曲线是随着时间的延伸，反是随着时间的延伸，反响速度下降，由起初的响速度下降，由起初的直线变为曲线。直线变为曲线。 测定酶活性的一切反响测定酶活性的一切反响速率的比较都必需依赖速率的比较都必需依赖该曲线的线性部分，因该曲线的线性部分

2、，因此要测定最初反响速度，此要测定最初反响速度，即底物浓度变化在底物即底物浓度变化在底物起始浓度的起始浓度的5以内的以内的速度。速度。 4、实验对象：碱性磷酸酶、实验对象：碱性磷酸酶AKPv磷酸苯二钠碱性磷酸酶碱性磷酸酶苯酚磷酸氢二钠苯酚磷酸氢二钠4-氨基安替比林氨基安替比林K3FeCN6醌衍生物红色醌衍生物红色碱性条件碱性条件一、pH对酶促反响速度的影响碱性磷酸酶AKP的最适pH值是10。二、温度对酶促反响速度的影响碱性磷酸酶AKP的最适温度是37。三、底物浓度对酶促反响速度的影响碱性磷酸酶米氏常数的测定VmaxS Km + S 米米-曼氏曼氏Michaelis-Menten方程：方程：Li

3、neweaver-bulk林贝氏方程方程： -Km 操作：1、不同浓度基质液的配制：试剂管号（1） （2） （3） （4） （5） （6） （7） （8） （9）0.01 mol/L基质液（ml）011111123蒸馏水（ml）376543220混匀。混匀。2、另取试管9支，做酶促反响：试剂管号123456789吸取上表稀释基质液1ml（1）（2）（3）（4）（5）（6）（7）（8）（9）pH10碳酸钠缓冲液（ml）0.90.90.90.90.90.90.90.90.9混匀，37 水浴保温5分钟左右。酶液（ml）0.10.10.10.10.10.10.10.10.1pH10碳酸钠缓冲液（ml）

4、010/1610/1410/1210/1010/810/610/410/2 参与酶液后立刻计时，各管混匀后在37 准确保温15分钟。3、保温终了，立刻参与0.5mol/L NaOH 1.0 ml 以中止反响。4、各管分别参与0.3% 4-氨基安替比林1.0 ml及0.5 铁氰化钾 2.0 ml，充分混匀，放置10分钟，以管1为对照，于波长510 nm处比色。v酶活性计算及酶活性计算及Km值求取值求取v1、在、在37C下保温下保温15分钟产生分钟产生1mg酚为酚为1个酶活性单位，从规范曲线个酶活性单位，从规范曲线查出释放的酚量查出释放的酚量ug，以此计算处各管的酶活性，以此计算处各管的酶活性v。

5、v2、以、以1/v为纵坐标、为纵坐标、1/S为横坐标，在坐标纸上作图，求出酶的为横坐标，在坐标纸上作图，求出酶的Km值。值。Av1/v1/SKm？四、抑制剂对酶促反响的影响抑制剂抑制剂 无抑制剂无抑制剂 1/V 1/S 竞争性抑制造用竞争性抑制造用抑制剂抑制剂 1 / V 1/S 无抑制剂无抑制剂 非竞争性抑制非竞争性抑制抑制剂抑制剂 1/V 1/S 无抑制剂无抑制剂 反竞争性抑制反竞争性抑制实验所用的抑制剂是磷酸氢二钠。实验所用的抑制剂是磷酸氢二钠。操作1、不同浓度基质液的配制：试剂管号（1） （2） （3） （4） （5） （6） （7） （8） （9）0.01 mol/L基质液（ml）0

6、11111123蒸馏水（ml）376543220混匀。混匀。2、另取试管9支，做酶促反响：试剂管号123456789吸取上表稀释基质液1ml（1）（2）（3）（4）（5）（6）（7）（8）（9）0.04mol/L磷酸氢二钠（ml）0.10.10.10.10.10.10.10.10.1pH10碳酸钠缓冲液（ml）0.90.90.90.90.90.90.90.90.9混匀，37 水浴保温5分钟左右。酶液（ml）0.10.10.10.10.10.10.10.10.1pH10碳酸钠缓冲液（ml）010/1610/1410/1210/1010/810/610/410/2 参与酶液后立刻计时，各管混匀后在

7、37 准确保温15分钟。3、保温终了，立刻参与0.5mol/L NaOH 1.0 ml 以中止反响。4、各管分别参与0.3% 4-氨基安替比林1.0 ml及0.5 铁氰化钾 2.0 ml，充分混匀，放置10分钟，以管1为对照，于波长510 nm处比色。v酶活性计算及酶活性计算及Km值求取值求取v1、在、在37C下保温下保温15分钟产生分钟产生1mg酚为酚为1个酶活性单位，从规范曲线个酶活性单位，从规范曲线查出释放的酚量查出释放的酚量ug，以此计算处各管的酶活性，以此计算处各管的酶活性v。v2、以、以1/v为纵坐标、为纵坐标、1/S为横坐标，在坐标纸上作图，求出酶的为横坐标，在坐标纸上作图，求出酶的Km值，值，并判别该抑制剂属于何种类型。并判别该抑制剂属于何种类型。Av1/v1/SKm？ 该抑制剂为？该抑制剂为？本卷须知：v配制的各种试剂