生物化学与分子生物学课件常用分子生物学技术的原理及其应用

1、目录目录常用分子生物学技术的常用分子生物学技术的原理及应用原理及应用The Principle and Application of Common Used Techniques in Molecular Biology第二十章第二十章1目录目录第一节第一节分子杂交与印迹技术分子杂交与印迹技术Molecular Hybridization and Blotting Technique2目录目录3 核酸分子杂交（核酸分子杂交（nucleotide molecular hybridization） 以以DNA的变性、复性为理论基础的变性、复性为理论基础 指具有一定同源序列的两条核酸单链指具有一定同

2、源序列的两条核酸单链（DNA或或RNA），在一定条件下按碱基），在一定条件下按碱基互补配对原则经过复性处理后，形成异互补配对原则经过复性处理后，形成异源双链的过程源双链的过程 目录目录复性复性RNADNA4目录目录（一）印迹技术（一）印迹技术利用各种物理方法使电泳胶中的生物大分子利用各种物理方法使电泳胶中的生物大分子转移到转移到NC等各种膜上，使之成为固相化分子。等各种膜上，使之成为固相化分子。这一技术类似于用吸墨纸吸收纸张上的墨迹，因这一技术类似于用吸墨纸吸收纸张上的墨迹，因此称之为此称之为“blotting”，译为印迹技术。，译为印迹技术。 5目录目录用放射性核素、生物素或荧光染料标记其用

3、放射性核素、生物素或荧光染料标记其末端或全链的已知序列的多聚核苷酸链被称为末端或全链的已知序列的多聚核苷酸链被称为“探针探针”，探针可以与固定在，探针可以与固定在NC膜上的核苷膜上的核苷酸结合，判断是否有同源的核酸分子存在。酸结合，判断是否有同源的核酸分子存在。 （二）探针技术（二）探针技术6目录目录二、印迹技术的类别及应用二、印迹技术的类别及应用（一）（一）DNA印迹印迹 (Southern blotting)（二）（二）RNA印迹印迹 (Northern blotting)（三）蛋白质的印迹（三）蛋白质的印迹 (Western blotting)用于基因组用于基因组DNA、重组质粒和噬菌体

4、的分析。、重组质粒和噬菌体的分析。 用于用于RNA的定性定量分析。的定性定量分析。用于蛋白质定性定量及相互作用研究。用于蛋白质定性定量及相互作用研究。7目录目录8 由由E. M. Southern在在1975年提出年提出 可用于分析基因拷贝数的变化可用于分析基因拷贝数的变化 基本操作过程包括基本操作过程包括 待测待测DNA样品的制备和基因探针的标记；样品的制备和基因探针的标记； 待测待测DNA样品的电泳分离；样品的电泳分离； 电泳分离的电泳分离的DNA经变性、转移、固定到经变性、转移、固定到合适的固相支持物；合适的固相支持物； 特异性核酸探针与膜上特异性核酸探针与膜上DNA片段杂交，片段杂交，

5、放射自显影或显色检测目的放射自显影或显色检测目的DNA的存在。的存在。 目录目录9滤纸滤纸NC膜膜凝胶凝胶滤纸滤纸电泳电泳 转移转移 杂交，显影杂交，显影酶切酶切DNADNA样品上样样品上样 DNADNA印迹印迹重物重物缓冲液缓冲液目录目录放放射射自自显显影影照照片片10目录目录11 Northern blot是将是将RNA从凝胶中转印到硝从凝胶中转印到硝酸纤维素膜上，定性分析酸纤维素膜上，定性分析mRNA的常用方的常用方法；法； RT-PCR是以是以mRNA为模板反转录合成为模板反转录合成cDNA、再以、再以cDNA为模板进行特异性扩增，为模板进行特异性扩增，进行进行RNA定性或定量分析的一

6、种方法；定性或定量分析的一种方法； 二者均可用于分析基因转录水平的变化二者均可用于分析基因转录水平的变化 。目录目录12目录目录13 Western blot是将是将蛋白蛋白从凝胶中转印到硝酸纤从凝胶中转印到硝酸纤维素膜上，定量定性分析蛋白的常用方法；维素膜上，定量定性分析蛋白的常用方法；目录目录14目录目录三种印迹技术的比较三种印迹技术的比较15目录目录16 原位杂交（原位杂交（in situ hybridization，ISH）即）即利用已知序列核酸作为探针与细菌、细胞利用已知序列核酸作为探针与细菌、细胞活组织切片中的核酸杂交来进行基因及其活组织切片中的核酸杂交来进行基因及其表达产物定位分

7、析的一种技术；表达产物定位分析的一种技术； 包括菌落原位杂交，染色体原位杂交。包括菌落原位杂交，染色体原位杂交。目录目录17 荧光原位杂交（荧光原位杂交（fluorescence in situ hybridization, FISH） 基因组原位杂交（基因组原位杂交（genome in situ hybridization，GISH） 目录目录18FISH箭头所示为杂交信号，结合带型分析可判断染色体位置箭头所示为杂交信号，结合带型分析可判断染色体位置目录目录第二节第二节PCR技术的原理与应用技术的原理与应用The Principle and Application of PCR Techno

8、logy19目录目录20 聚合酶链式反应（聚合酶链式反应（polymerase chain reaction, PCR） 是一种在体外特异地扩增已知基因的方法；是一种在体外特异地扩增已知基因的方法； 可用于分析基因及其产物的水平变化；可用于分析基因及其产物的水平变化； 可进行实时、定量分析可进行实时、定量分析； 可结合免疫沉淀的方法确定蛋白质与可结合免疫沉淀的方法确定蛋白质与DNA序序列的相互作用。列的相互作用。 目录目录5 Primer 15 Primer 2Cycle 2Cycle 15 5 5 5 5 5 Template DNA一、一、PCR技术的工作原理技术的工作原理5 5 5 5

9、5 5 5 5 21目录目录Cycle 35 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 2530 次循环后，模板次循环后，模板DNA的含量的含量可以扩大可以扩大100万倍以上。万倍以上。22目录目录PCR技术原理示意图技术原理示意图 23目录目录n PCR的基本反应步骤的基本反应步骤变性变性95C95C延伸延伸72C退火退火Tm-5C24目录目录由由K. Mullis于于1983年建立年建立1993年，年，Mullis因此项技术荣获诺贝尔化学奖。因此项技术荣获诺贝尔化学奖。25目录目录 模板模板DNA 特异性引物特异性引物 耐热耐热DNA聚合酶聚合酶 dNTPs Mg2+n

10、PCR体系基本组成成分体系基本组成成分26目录目录27目录目录 逆转录逆转录PCR(reverse transcription PCR，RT-PCR)是将是将RNA的逆转录反应和的逆转录反应和PCR反应联合反应联合应用的一种技术。应用的一种技术。（一）逆转录（一）逆转录PCR技术技术二、几种重要的二、几种重要的PCR衍生技术衍生技术28目录目录29mRNA 5 AAAAAA(n) 3 mRNA 5 AAAAAA(n) 3 TTTTTT(n) 5 mRNA 5 cDNA 3 AAAAAA(n) 3 TTTTTT(n) 5 AAAAAA(n) 3 TTTTTT(n) 5 oligo(dT)12-1

11、8反转录酶反转录酶RNase HDNA 聚合酶聚合酶S1 核酸酶核酸酶3 cDNATTTTTT(n) 5 AAAAAA(n) 3 TTTTTT(n) 5 反转录合成反转录合成cDNA目录目录 RT-PCR是目前从组织或细胞中获得目的基因是目前从组织或细胞中获得目的基因以及对已知序列的以及对已知序列的RNA进行定性及半定量分进行定性及半定量分析的最有效方法。析的最有效方法。 30目录目录 原位原位PCR(in situ PCR)是在组织切片或细胞涂片是在组织切片或细胞涂片上的单个细胞内进行的上的单个细胞内进行的PCR反应，然后用特异反应，然后用特异性探针进行原位杂交，即可检出待测性探针进行原位杂

12、交，即可检出待测DNA或或RNA是否在该组织或细胞中存在。是否在该组织或细胞中存在。（二）原位（二）原位PCR技术技术31目录目录 原位原位PCR方法弥补了方法弥补了PCR技术和原位杂交技术技术和原位杂交技术的不足，是将目的基因的扩增与定位相结合的的不足，是将目的基因的扩增与定位相结合的一种最佳方法。一种最佳方法。32目录目录（三）实时（三）实时PCR技术技术实时实时PCR(real-time PCR)技术通过动态技术通过动态监测反应过程中的产物量，消除了产物堆积监测反应过程中的产物量，消除了产物堆积对定量分析的干扰，亦被称为定量对定量分析的干扰，亦被称为定量PCR。 33目录目录n实时实时P

13、CRPCR分类：分类：实时实时PRC非探针类非探针类探针类探针类TaqManTaqMan探针法探针法 分子信标探针法分子信标探针法 FRET FRET探针法探针法 （SYBR GreenSYBR Green）荧光引物荧光引物LUXLUX34目录目录非探针类（非探针类（SYBR Green）SYBR Green 是一种能与双链DNA 结合发光的荧光染料。与双链DNA结合后， 荧光大大增强。SYBR Green 的荧光信号强度与双链DNA的数量相关，可以根据荧光信号检测出PCR体系存在的双链DNA数量。35目录目录36l和SYBR分子结合的PCR产物随温度升高逐渐变为单链，就不能再和SYBR结合。

14、l溶解曲线的反应条件，一般为95-60-95。60时大部分为双链DNA，荧光信号最高，随着温度的上升双链渐渐打开，当温度到TM值时，双链迅速解开，信号迅速降低，最后95时信号为0。l图一为溶解曲线的原始曲线，而第二个图为第一个图的一次微分后的曲线。目录目录引物中任意一条设计为带有末端回文结构并在3端标记荧光素。荧光标记在引物上不会受到引物二聚体的干扰，专一性优于SYBR。在没有单链模板的情况下，该引物自身配对，形成发夹结构，使荧光淬灭。在模板存在的情况下，引物与模板配对，发夹结构打开，产生荧光信号。非探针类非探针类 （荧光引物（荧光引物LUX-light upon extension）37目录

15、目录TaqMan探针法实时PCR原理示意图探针类探针类38目录目录分子信标探针法实时PCR原理示意图探针类探针类39目录目录荧光共振能量传递荧光共振能量传递（ fluorescence resonance energy transfer ,FRET）探针类探针类40目录目录几种实时定量几种实时定量PCRPCR比较比较41目录目录利用特异性引物以利用特异性引物以cDNA或基因组或基因组DNA为模板获为模板获得已知目的基因片段得已知目的基因片段, 或与逆转录反应相结合，直或与逆转录反应相结合，直接以组织和细胞的接以组织和细胞的mRNA为模板获得目的片段；为模板获得目的片段；利用简并引物从利用简并引

16、物从cDNA文库或文库或基因组文库基因组文库中获得中获得序列相似的基因片段；序列相似的基因片段；利用随机引物从利用随机引物从cDNA文库或基因组文库中克隆文库或基因组文库中克隆基因。基因。 三、三、PCR技术技术的主要用途的主要用途（一）目的基因的克隆（一）目的基因的克隆42目录目录利用利用PCR技术可以随意设计引物在体技术可以随意设计引物在体外对目的基因片段进行嵌和、缺失、点突外对目的基因片段进行嵌和、缺失、点突变等改造。变等改造。 PCR技术高度敏感，对模板技术高度敏感，对模板DNA的的量要求很低，是量要求很低，是DNA和和RNA微量分析的微量分析的最好方法。最好方法。 （三）（三）DNA

17、和和RNA的微量分析的微量分析（二）基因突变（二）基因突变43目录目录将将PCR技术引入技术引入DNA序列测定，使测序序列测定，使测序工作大为简化，也提高了测序的速度；工作大为简化，也提高了测序的速度；待测待测DNA片段既可克隆到特定的载体后片段既可克隆到特定的载体后进行序列测定，也可直接测定。进行序列测定，也可直接测定。PCR与其他技术的结合可以大大提高基与其他技术的结合可以大大提高基因突变检测的敏感性因突变检测的敏感性 。（四）（四）DNA序列测定序列测定（五）基因突变分析（五）基因突变分析44目录目录第三节第三节基因文库基因文库Gene Library45目录目录 基因组基因组DNA文库

18、文库 (genomic DNA library) cDNA文库文库(cDNA library) n基因文库基因文库( (gene library)是指一个包含了某一生物体全部是指一个包含了某一生物体全部DNADNA序列序列的克隆群体。的克隆群体。46目录目录一、基因组一、基因组DNA文库文库基因组基因组DNADNA文库是指生物的文库是指生物的基因组基因组DNA的的信息（包括所有的编码区和非编码区）以信息（包括所有的编码区和非编码区）以DNA片段形式贮存的克隆群体。片段形式贮存的克隆群体。 用于构建基因组文库的载体有用于构建基因组文库的载体有 噬菌体、噬菌体、粘粒和酵母人工染色体等。粘粒和酵母人

19、工染色体等。47目录目录cDNA文库是包含某一组织细胞在一定条件下文库是包含某一组织细胞在一定条件下所表达的全部所表达的全部mRNAmRNA经逆转录而合成的经逆转录而合成的cDNA序列序列的克隆群体，它以的克隆群体，它以cDNA片段的形式贮存着该组织片段的形式贮存着该组织细胞的基因表达信息。细胞的基因表达信息。二、二、cDNA文库文库48目录目录n基因组文库和基因组文库和cDNA文库的构建和筛选文库的构建和筛选49目录目录构建基因文库的意义：生物的遗传信息以稳定的重组体形式贮存起来；分离克隆目的基因的主要途径。50目录目录第四节第四节生物芯片技术生物芯片技术Biological Chip Te

20、chnique51目录目录一、基因芯片一、基因芯片n基因芯片基因芯片(gene chip) DNA芯片（芯片（DNA chip） 在固相支持物上有序固化寡核苷酸或在固相支持物上有序固化寡核苷酸或DNA探针，探针，与待测荧光标记样品进行杂交；与待测荧光标记样品进行杂交； 通过对杂交信号的检测、比较和分析，得出样通过对杂交信号的检测、比较和分析，得出样品的遗传信息品的遗传信息(基因序列及表达基因序列及表达)； 亦被称作亦被称作DNA微阵列微阵列(DNA microarray)。52目录目录53目录目录n基因芯片工作流程示意图基因芯片工作流程示意图54目录目录DNA芯片技术芯片技术55目录目录是将高

21、度密集排列的蛋白分子作为探针点是将高度密集排列的蛋白分子作为探针点阵固定在固相支持物上，当与待测蛋白样品反阵固定在固相支持物上，当与待测蛋白样品反应时，可捕获样品中的靶蛋白，再经检测系统应时，可捕获样品中的靶蛋白，再经检测系统对靶蛋白进行定性和定量分析的一种技术。对靶蛋白进行定性和定量分析的一种技术。二、蛋白质芯片二、蛋白质芯片n蛋白质芯片蛋白质芯片(protein chip)n作用原理：作用原理：蛋白质分子间的亲和反应蛋白质分子间的亲和反应56n固定在芯片上的蛋白：固定在芯片上的蛋白：抗原、抗体、小肽、受体和抗原、抗体、小肽、受体和配体、蛋白质配体、蛋白质-DNA-DNA和蛋白质和蛋白质-R

22、NA-RNA复合物等。复合物等。 目录目录57目录目录第五节第五节生物大分子相互作用研究技术生物大分子相互作用研究技术 The Method of Protein-protein and Protein-DNA Interaction Study58目录目录一、蛋白质相互作用研究技术一、蛋白质相互作用研究技术 酵母双杂交酵母双杂交 各种亲和分析（标签蛋白沉淀、免疫共沉淀等）各种亲和分析（标签蛋白沉淀、免疫共沉淀等） 荧光共振能量转换效应分析荧光共振能量转换效应分析 噬菌体显示系统筛选噬菌体显示系统筛选n常用蛋白质相互作用的研究技术常用蛋白质相互作用的研究技术59目录目录标签融合蛋白结合实验是一

23、个基于亲和色谱标签融合蛋白结合实验是一个基于亲和色谱原理的、分析蛋白质体外直接相互作用的方法。原理的、分析蛋白质体外直接相互作用的方法。（一）标签蛋白沉淀（一）标签蛋白沉淀用途：用途：l证明两种蛋白分子是否存在直接物理结合证明两种蛋白分子是否存在直接物理结合l分析两种分子结合的具体结构部位分析两种分子结合的具体结构部位l筛选细胞内与融合蛋白相结合的未知分子筛选细胞内与融合蛋白相结合的未知分子 60目录目录标签融合标签融合蛋白沉淀蛋白沉淀实验流程实验流程示意图示意图61目录目录62目录目录（二）酵母双杂交技术的基本原理（二）酵母双杂交技术的基本原理和用途和用途63目录目录64目录目录n酵母双杂交

24、系统的应用酵母双杂交系统的应用 证明两种已知基因序列的蛋白质可以相互作用证明两种已知基因序列的蛋白质可以相互作用的生物信息学推测。的生物信息学推测。 分析已知存在相互作用的两种蛋白质分子的的分析已知存在相互作用的两种蛋白质分子的的相互作用功能结构域或关键的氨基酸残基。相互作用功能结构域或关键的氨基酸残基。 将拟研究的蛋白质的编码基因与将拟研究的蛋白质的编码基因与BD基因融合成基因融合成为为“诱饵诱饵”表达质粒，可以筛选表达质粒，可以筛选AD基因融合的基因融合的“猎物猎物”基因表达文库，筛选未知的相互作用基因表达文库，筛选未知的相互作用蛋白质。蛋白质。65目录目录电泳迁移率变动测定电泳迁移率变动

25、测定( (electrophoretic mobility shift assay，EMSA)或称凝胶迁移变动实验或称凝胶迁移变动实验( (gel shift assay)最初用于研究最初用于研究DNA结合蛋白与相应结合蛋白与相应DNA序列间的相互作用，可用于定性和定量分析，序列间的相互作用，可用于定性和定量分析，已经成为已经成为转录因子研究转录因子研究的经典方法。目前这一技的经典方法。目前这一技术也被用于研究术也被用于研究RNA结合蛋白和特定结合蛋白和特定RNA序列间序列间的相互作用。的相互作用。二、二、DNA-蛋白质相互作用分子分析技术蛋白质相互作用分子分析技术（一）电泳迁移率变动测定（一）电泳迁移率变动测定66目录目录放放射射自自显显影影未结合探针未结合探针结合有蛋白的探针结合有蛋白的探针标记探针标记探针1X1X1X1X核蛋白提取物核蛋白提取物1X10X10X未标记探针未标记探针10Xn凝胶迁移实验结果示意图凝胶迁移实验结果示意