生物制片显微绘图染色体和核型分析技术

1、生物实验技术2010级硕士研究生第一章 生物制片技术石蜡制片法一、石蜡制片法o 石蜡制片法是生物学的基本实验技术之一。要完整的观察植（动）物的内部构造，必须先将实验样品制成显微标本片，许多植物药材用徒手切片或滑动切片法往往不易得到较薄且均匀的切片，因此，常采用石蜡切片法。o 原理：将液体石蜡渗透到样品材料内部，待石蜡凝固成固体，再进行切片，所得切片薄而均匀，约厚45m。有利于切片的长期保存和常规检查。实验仪器、材料与试剂实验仪器：石蜡切片机、切片刀、小木块（2.521.5cm）、解剖针、刀片、毛笔、酒精灯、培养箱、显微镜等。实验材料：徐长卿根等实验试剂：F.A.A.固定液、酒精、二甲苯、石蜡、

2、甘油蛋白、番红染色剂、固绿（亮绿）染色剂等实验步骤o 取材FAA固定 冲洗 脱水 透明 浸蜡 包埋 切片 黏片 脱蜡 染色 透明 封藏水梯度乙醇二甲苯二甲苯+石蜡蛋白胶梯度乙醇纯蜡梯度乙醇二甲苯树脂实验关键1、取材：取材要有代表性，注意取材的时间、部位和方向。2、固定：F.A.A.固定液（F=福尔马林：40%甲醛5ml；A=乙醇50%或70%90ml；A=冰醋酸5ml），固定时间：1024h以上。3、脱水（上行）：将材料用梯度乙醇（30%、40%、50%（可过夜）、60%、70%（可过夜）、80%、90%、100%）脱水至100%乙醇的过程。4、透明：二甲苯（50%etoh+50%px、70%

3、、100%、100%）透明至完全透明。5、浸蜡：将液体石蜡（熔点：5255）逐级浸入细胞中。6、包埋：使处理后的材料包埋于石蜡中，待冷却后便于固定于切片机上，进行切片。7、切片：修整切片，固定蜡块于切片机上，进行切片。8、粘片：用蛋白黏合剂将蜡片粘在载玻片上。9、脱蜡：用二甲苯将蜡片中的蜡溶解脱去。10、染色（下行） ：用梯度乙醇将溶液逐步过度到染色剂的浓度。 （ 100% 95% 染亮绿试剂 80% 、70%、 60% 、 50%（可过夜）、 40%、 30% 染番红色 ）11、脱水透明（上行）：用梯度乙醇将溶液逐步过度到无水状态。 （30%、40%、50%（可过夜）、60%、70%（可过夜

4、）、80%、90%、100%、50%ETOH+50%PX、100%PX）12、封片：树脂封片二、冰冻制片法o 冰冻切片冰冻切片o 是借助低温冷冻将活体组织或新鲜组织快速是借助低温冷冻将活体组织或新鲜组织快速冻结达到一定的硬度进行制片的一种方法。冻结达到一定的硬度进行制片的一种方法。可省去包埋过程中的一切繁杂手续和时间能可省去包埋过程中的一切繁杂手续和时间能够得到迅速的切片和显微鉴定结果。如手术够得到迅速的切片和显微鉴定结果。如手术中等待冰冻快速病理报告，以病变性质而决中等待冰冻快速病理报告，以病变性质而决定手术方式和范围。定手术方式和范围。 仪器：冰冻切片机、切片刀、二氧化碳、低温仪器：冰冻切

5、片机、切片刀、二氧化碳、低温冰箱等冰箱等试剂：甲醛、二氧化碳、苏木精染色液等试剂：甲醛、二氧化碳、苏木精染色液等o 操作步骤：样品冰冻二氧化碳切片染色封片冰冻切片机苏木精染色脱水、透明冰冻切片的优缺点：（一）优点：（一）优点：1简便，可以不需要对组织固定、脱水、透明、包埋等简便，可以不需要对组织固定、脱水、透明、包埋等手续即可进行切片，减少了一些中间环节。手续即可进行切片，减少了一些中间环节。2快速，用时短。快速，用时短。3组织变化不大。组织变化不大。4能很好保存脂肪，类脂等成分。能很好保存脂肪，类脂等成分。5能够比较完好地保存各种抗原活性及酶类，特别是对能够比较完好地保存各种抗原活性及酶类，

6、特别是对于那些对有机溶剂或热的温度耐受能力较差的细胞膜于那些对有机溶剂或热的温度耐受能力较差的细胞膜表面抗原和水解酶保存较好。表面抗原和水解酶保存较好。 （二）缺点：（二）缺点： 1不容易做连续切片。2切取的组织不能过大，组织过大不容易冻结或者组织冻结不均，影响切片及染色效果。3不容易制作较薄的切片。4组织块在冻结过程中容易产生水的结晶而影响细胞的形态结构及抗原物质的定位，并且组织结构也不如石蜡切片清晰。冰冻切片机的使用及注意事项冰冻切片机的使用及注意事项 （1）新鲜的组织制备）新鲜的组织制备 组织尽可能新鲜、骤冷愈快愈好，才能避免冰晶，常用的骤冷剂有： CO2气（78） 丙酮干冰冷却的轻石油

7、醚、乙烷和庚烷（80） 液氮（190） 液氮冷却的丙烷（19）。液氮适用于组织化学，较安全。缺点：组织块易发生龟裂。（2）固定组织的制备）固定组织的制备 为防止水解酶和其他物质的移位、弥散，常用4、24小时的甲醛固定能很好地保存酶类。但对许多脱氢酶和转移酶能灭活。故不宜使用，低温，冷甲醛短时间固定（10分钟左右）固定，可显示琥珀酸脱氢酶。 （3）恒冷箱温度）恒冷箱温度 一般在冷冻后一般在冷冻后10分钟，到接近冷室温度时再切，一分钟，到接近冷室温度时再切，一般组织在般组织在1520切片最易成功。每种组织切片最易成功。每种组织有其合适的切片温度、刀的温度和冷室温度。应有其合适的切片温度、刀的温度和

8、冷室温度。应根据经验总结。根据经验总结。（4）抗卷板）抗卷板 抗卷板的前缘与刀面须有足够的距离，使切片平滑通抗卷板的前缘与刀面须有足够的距离，使切片平滑通过。抗卷板略高于刀面的最高点。可凭经验调整过。抗卷板略高于刀面的最高点。可凭经验调整刀对组织的角度，一般新刀为刀对组织的角度，一般新刀为20。（5）切片机）切片机操作程序：先接通电源，调定恒冷箱温度，调整切片操作程序：先接通电源，调定恒冷箱温度，调整切片刀的角度，调定切片厚度，标本置载台致冷达所刀的角度，调定切片厚度，标本置载台致冷达所需温度后，将其安放在切片机推进器上。即可切需温度后，将其安放在切片机推进器上。即可切片。片。 恒冷箱视使用情

9、况每周或每月清洁一次冰霜。恒冷箱视使用情况每周或每月清洁一次冰霜。（6）切片刀）切片刀 新刀切片满意，旧刀用自动磨刀机磨刀较好。如果切片刀与抗卷板的位置，角度合乎要求，又有一把锐利的刀，就能获得理想的切片。 三、滑动切片法滑走切片法滑走切片法（永久制片） （1）水浸软化材料（如为鲜材料或固定材料）水浸软化材料（如为鲜材料或固定材料不用软化）不用软化） （2）分割材料成适当大小。）分割材料成适当大小。 （3）如为木质材料用甘油再软化）如为木质材料用甘油再软化 （4）把材料夹入滑走切片机的夹物部（如材）把材料夹入滑走切片机的夹物部（如材料小而不能夹入，可加辅助物，如石蜡泡料小而不能夹入，可加辅助物

10、，如石蜡泡沫塑料等）沫塑料等） （5）切片：调整）切片：调整1025u厚度，推动刀片，厚度，推动刀片，切下材料，用湿毛笔取下片子放表面皿水切下材料，用湿毛笔取下片子放表面皿水中。中。（6）经下列各级乙醇脱水）经下列各级乙醇脱水番红染色番红染色1-3分钟（分钟（50%乙醇配制）乙醇配制） 50%乙醇（乙醇（1-2次）次） 60%乙醇乙醇70%乙醇乙醇 80%乙醇乙醇固绿染色固绿染色2-5秒秒 （90%醇配制）醇配制） 90%乙醇（洗乙醇（洗1-2次）次）95%乙醇乙醇纯酒纯酒 精精 注：以上操作于表面皿中进行，并用吸管及吸注：以上操作于表面皿中进行，并用吸管及吸水草纸吸净乙水草纸吸净乙 醇液；每

11、一级脱水时间醇液；每一级脱水时间3-5分钟；并保证脱水足够。分钟；并保证脱水足够。（7）经下列各级二甲苯透明）经下列各级二甲苯透明25%50%75%纯二甲苯纯二甲苯。 注意注意：透明的每一级透明的每一级3-5分钟，用吸唧或吸水分钟，用吸唧或吸水草纸吸净试剂（注意勿吸去材料），再放入草纸吸净试剂（注意勿吸去材料），再放入下一级。到纯二甲苯如有混浊，须退回下一级。到纯二甲苯如有混浊，须退回95%酒精再脱水并重新按透明步骤进行。酒精再脱水并重新按透明步骤进行。（）封（）封 片：片：1、在玻片上滴一滴树脂，将片子平放在树胶、在玻片上滴一滴树脂，将片子平放在树胶 上，用镊子取盖玻片，使其一边接触树胶上，

12、用镊子取盖玻片，使其一边接触树胶 缓慢盖下。缓慢盖下。 2、贴标签、写编号、名称（横切或纵切）、贴标签、写编号、名称（横切或纵切） 厚度、日期。厚度、日期。第二章 生物绘图与摄影技术o 第一节 显微绘图显微绘图显微绘图1显微描绘器的使用显微描绘器的使用显微描绘器是用于描绘在显微镜下扩大的物象时所用的一种仪器。显显微描绘器是用于描绘在显微镜下扩大的物象时所用的一种仪器。显微描绘器利用两组光学系统将显微镜中的物象和图画的铅笔象相微描绘器利用两组光学系统将显微镜中的物象和图画的铅笔象相迭合，同时送到观察者的眼中，以利准确地依影描绘。迭合，同时送到观察者的眼中，以利准确地依影描绘。显微描绘器种类很多，

13、下面介绍无柄描绘器：显微描绘器种类很多，下面介绍无柄描绘器：（1）构造和原理）构造和原理描绘器是由两个三棱镜描绘器是由两个三棱镜A、B粘合在一起，粘合在一起，A棱镜地粘合面棱镜地粘合面PP上，除上，除中央部位的小圆孔中央部位的小圆孔M外，均涂以水银；旁侧有一反射棱镜外，均涂以水银；旁侧有一反射棱镜C，与，与垂直方向成垂直方向成75角，其底面角，其底面FF上亦涂以水银。上亦涂以水银。D为接目镜，为接目镜，E为接物镜。观察时，载玻片上物体的物象经接物镜为接物镜。观察时，载玻片上物体的物象经接物镜E，接目镜，接目镜D，并通过两个三棱镜粘合面并通过两个三棱镜粘合面PP的中央小孔的中央小孔M而达于眼，同

14、时绘图而达于眼，同时绘图板板G上的铅笔上的铅笔H，也经，也经C棱镜底面棱镜底面FF反射至反射至PP平面而达于眼。平面而达于眼。这样，眼睛能同时看到显微镜下的物体和绘图板上的铅笔，进行这样，眼睛能同时看到显微镜下的物体和绘图板上的铅笔，进行描绘。描绘。（2）使用方法：将显微镜正放于绘图板的左方，按常规放置标本片，调节，使物象清晰。取下接目镜，在镜筒上端装上描绘器的附着器，放回接目镜，再套上描绘器。将绘图纸固定在绘图板上，调节绘图板的倾斜度，使与描绘器的角度相一致，再调节光线，使视野中的物象与铅笔象均清晰，就可进行描绘。（3）描绘方法）描绘方法先描出目的物的图像轮廓，再描绘明显的特征，如较先描出目

15、的物的图像轮廓，再描绘明显的特征，如较大的纹孔、较粗的层纹等。当描绘一个视野容纳不大的纹孔、较粗的层纹等。当描绘一个视野容纳不下的大形或长形物象时，可以先描绘一个视野，然下的大形或长形物象时，可以先描绘一个视野，然后微微移动标本片，再描绘连续的部分，须注意，后微微移动标本片，再描绘连续的部分，须注意，移动前，要确定移动前，要确定23个明显的标志，以免移动后个明显的标志，以免移动后物象与图像衔接不上。移动标本片和图纸要平行进物象与图像衔接不上。移动标本片和图纸要平行进行，每次移动距离不应超过行，每次移动距离不应超过2/3个视野。描出草图个视野。描出草图后，卸除描绘器，再仔细观察目的物，并与图像核

16、后，卸除描绘器，再仔细观察目的物，并与图像核对，作进一步的加工修整和补充必要的细节，成为对，作进一步的加工修整和补充必要的细节，成为铅笔图。然后可根据需要再用硫酸纸依样描绘成墨铅笔图。然后可根据需要再用硫酸纸依样描绘成墨线图。线图。（4）描图像的放大倍数计算和调整常见的两种方法）描图像的放大倍数计算和调整常见的两种方法把镜台量尺的刻度线通过描绘器描绘在图纸上（一般画大把镜台量尺的刻度线通过描绘器描绘在图纸上（一般画大格线，放大倍数很高时用小格线），用量尺测量绘出的两格线，放大倍数很高时用小格线），用量尺测量绘出的两刻度线之间的长度，除以镜台量尺两刻度线之间的实际长刻度线之间的长度，除以镜台量尺

17、两刻度线之间的实际长度，即得图像的放大倍数。度，即得图像的放大倍数。如：图纸上两刻度线之间的长度为如：图纸上两刻度线之间的长度为10mm，而镜台量尺该刻，而镜台量尺该刻度线间的实际长度为度线间的实际长度为0.1mm，放大倍数，放大倍数100.1100（倍）（倍）也可直接用绘出得标尺表示放大倍数。也可直接用绘出得标尺表示放大倍数。用目镜量尺测得物体的长度或大小，除绘图纸上物象在同用目镜量尺测得物体的长度或大小，除绘图纸上物象在同一方向测得得长度、大小，即得图像放大倍数。一方向测得得长度、大小，即得图像放大倍数。如：大黄簇晶在图纸上绘得直径为如：大黄簇晶在图纸上绘得直径为24mm，而在显微镜下得，

18、而在显微镜下得实际长度为实际长度为120m（0.12mm），放大倍数），放大倍数240.12200（倍）（倍）放大倍数的调整，一般可利用伸缩显微镜镜筒或调整绘图纸放大倍数的调整，一般可利用伸缩显微镜镜筒或调整绘图纸的高低，使放大倍数成为整齐数字，调整合适，保持显微的高低，使放大倍数成为整齐数字，调整合适，保持显微镜、描绘器、绘图纸的位置不变，即可描绘。镜、描绘器、绘图纸的位置不变，即可描绘。注意：描绘图像的放大倍数是借助显微量尺和直尺计算而得，注意：描绘图像的放大倍数是借助显微量尺和直尺计算而得，切不可将显微镜本身的放大倍数误认为是物象的放大倍数。切不可将显微镜本身的放大倍数误认为是物象的放大

19、倍数。自动显微成像系统投影式描绘器（5）新型显微描绘器介绍绘图技巧简介绘图技巧简介观察仔细是前提，观察仔细是前提，先绘草图和比例，先绘草图和比例，正确使用好纸笔，正确使用好纸笔，保持规范和清晰，保持规范和清晰，真实准确是第一。真实准确是第一。2药材组织简图绘制法药材组织简图绘制法采用一定的图案符号（图采用一定的图案符号（图12），来表示药材切面中各种组织即某），来表示药材切面中各种组织即某些特殊构造的层次和分布范围，这种组织图，称之组织简图。些特殊构造的层次和分布范围，这种组织图，称之组织简图。绘制方法如下：绘制方法如下：（1）制作标本片）制作标本片 制作反差较大的标本片，如各种二重、三重染色

20、制作反差较大的标本片，如各种二重、三重染色的石蜡切片，经间苯三酚的石蜡切片，经间苯三酚-浓盐酸、氯化锌碘液或其他试剂染色浓盐酸、氯化锌碘液或其他试剂染色后的手切片，要求组织结构清晰，界限分明。后的手切片，要求组织结构清晰，界限分明。（2）观察）观察 描绘前，需要仔细观察标本片，熟悉切片中各种组织的描绘前，需要仔细观察标本片，熟悉切片中各种组织的构造层次，重要鉴别特征的位置、各种组织所占的比例等。构造层次，重要鉴别特征的位置、各种组织所占的比例等。（3）勾画轮廓图）勾画轮廓图 用幻灯机或投影仪，将标本片投像于绘图纸上，用幻灯机或投影仪，将标本片投像于绘图纸上，调整合适的放大倍数，用调整合适的放大

21、倍数，用3H（2H）铅笔轻轻勾画出各个部位）铅笔轻轻勾画出各个部位的轮廓，不清晰的部位在显微镜下，用显微测量加以校正。的轮廓，不清晰的部位在显微镜下，用显微测量加以校正。小型材料，可以直接用描绘器进行勾画。小型材料，可以直接用描绘器进行勾画。徒手勾画法。徒手勾画法。（4）修正铅笔图 用HB型铅笔修正上述轮廓图，将各部位即重要特征，分别用规定的简图符号细心地描绘成铅笔图。（5）图注及图名 简图绘完后，用整齐的引线将各部位依次向右方或上、下方（叶类中药）引出，写上图注，图下方写上图的名称并注明放大倍数。（6）注意事项 绘简图符号时，应注意线条的平直和圆顺，点应均匀圆正，色调一致。简图是平面图，不应

22、绘出立体感，所有部位均用符号表示，不应把某个部位绘成详图。简图一般要求整体性和全面性，但有的药材也可只绘局部或主要部位。3药材组织详图绘制法组织详图是把组织中各种细胞，由外向内一次绘出的组织图。绘制方法如下：（1）、（2）项同组织简图绘制法。（3）勾画轮廓图利用描绘器观察绘图，或显微照相后依次放大的照片绘图。先用3H铅笔绘出草图。直径较小的组织可全部绘出，直径大的组织可由外向内分成数段，选取最有鉴别意义的组织特征描绘。描绘时，各段及各部位细胞的放大倍数应一致，各种细胞及内含物等应依次准确绘出，切忌随意填充。（4）详图中各类细胞的表示法及各种类型铅笔的使用：）详图中各类细胞的表示法及各种类型铅笔

23、的使用：各类细胞的表示法一般有三种：各类细胞的表示法一般有三种：a.单线条法：适用于薄壁细胞。单线条法：适用于薄壁细胞。b.双线条法：适用于略增厚壁的细胞。双线条法：适用于略增厚壁的细胞。c.三线条法：适用于成群的厚壁细胞及导管；如单个散在时，采三线条法：适用于成群的厚壁细胞及导管；如单个散在时，采用双线条法。用双线条法。B、HB铅笔：适于绘粗线条。如绘厚壁细胞、导管的外缘线。铅笔：适于绘粗线条。如绘厚壁细胞、导管的外缘线。H、2H铅笔：适于绘中线条。如绘薄壁细胞，各种结晶体、淀粉粒等。铅笔：适于绘中线条。如绘薄壁细胞，各种结晶体、淀粉粒等。3H铅笔：适于绘细线条。如绘厚壁细胞、导管的内缘线、

24、层纹、纹铅笔：适于绘细线条。如绘厚壁细胞、导管的内缘线、层纹、纹孔等。孔等。（5）修正铅笔图）修正铅笔图 将勾画的轮廓图用不同型号（硬度）的铅笔和（将勾画的轮廓图用不同型号（硬度）的铅笔和（4）项中规定的画法）项中规定的画法修整成铅笔图。修整成铅笔图。（6）图注和图名）图注和图名按简图法写上图注、图名和放大倍数。按简图法写上图注、图名和放大倍数。（7）注意事项）注意事项组织详图是细胞的平面图，但细胞内含物以及厚壁细胞应注意绘出立组织详图是细胞的平面图，但细胞内含物以及厚壁细胞应注意绘出立体感。体感。4药材粉末图绘制法粉末图是描绘粉末药材中具有鉴别意义的组织碎片、细胞或细胞内含物形态的特征图。绘

25、制方法如下：（1）制作合适的粉末标本片，仔细观察。（2）用描绘器作图或镜检时直接作图。（3）选择有鉴别意义的特征，如实描绘。常见的粉末特征：导管、各种厚壁细胞、内含物、分泌组织、毛茸等。注意观察和描绘不同的角度和断面：如表面观、断面观、极面观、赤道面观等。注意绘出立体感：如各种厚壁细胞、内含物、毛茸、导管等。（4）图版的排列、大小和放大倍数：图版排列的原则：各类特征相对集中，又要与其他特征适当交叉、美观、充实、大方。图版大小：一般按各出版社要求的大小或其倍数计算。放大倍数：同一张粉末图中，要求使用同一个放大倍数。（5）修正铅笔图按详图绘制法中4、5项进行。（6）图注和图名：铅笔图绘完后，将各类

26、粉末特征标上数码，在图下写明，图的名称、放大倍数，其下面注明特征数码的图注。（7）注意事项图版排列时，应注意突出重点特征，使占主要版面，次要特征占次要版面或填补空隙，既不能过于密集繁杂，又不能过于稀疏松散，切忌不可纵、横排队式。图片的大小要适中，根据图纸的大小和图的多少确定。5药材解离组织图的绘制法（1）根据材料的性质，选择合适的解离方法、制片，用描绘器进行描绘。（2）解离组织是观察研究药材某一组织中有鉴别意义的单个完整的细胞形态，故描绘时，单个细胞应绘全形图，过长的细胞，如纤维、管胞、筛胞等，可分上下两段描绘。描绘时，应体现立体感，各种细胞的鉴别点要绘出来，如细胞的纹孔、导管穿孔板、纤维末端

27、的分枝等。（3）图版排列，一般各类细胞在图中分类集中纵向排列。同一图版中，可以使用不同的放大倍数，在图注中，分别注明放大倍数。其他与粉末图相同。显微摄影显微摄影 显微摄影技术(microscopic photography)也称显微照像术，是利用摄影技术和显微镜把显微镜中观察到的组织、细胞图像记录下来，并以照片或幻灯片的形式供保存、观察、测量和分析鉴定。 显微摄影仪显微摄影仪 1显微摄影装置显微摄影装置最基本的结构就是：各类显微镜和各类照相机。传统的显微摄影一般使用传统的相机，将镜头去除，装在显微镜上，拍摄显微镜下看到的切片；或者使用专门的照相显微镜，有自己的专用片盒，可以拍35mm胶片，也可

28、拍一次成像和45页片，对焦、光圈、曝光全在显微镜上操作完成，除了连续照明外，甚至装有闪光灯和色温表，自动曝光系统既可点测光也可中心重点测光，曝光补偿、倒记数显示等等，一应俱全。传统的显微摄影有着和传统相机一样的缺点：拍摄的照片，不能立拍即现，照片必须要经过冲洗，在数字化成电子文挡的时候，细节有损失等等。o 数码显微摄影在装置上，一般使用数码相机通过各种接口和显微镜的组合，然后数码相机和计算机相连；数码显微摄影的优点在于，可即时浏览拍摄，拍摄后的照片即时观看，减少废片率；另外拍摄后的照片即时传入到计算机的分析软件，即刻得出分析接结果，大大缩减了因冲洗照片而耽误大量时间，从而解决了实验的连续性的问

29、题；再者，数码显微摄影拍摄的图片为数字化的文档，可即刻用于power point教学或日后的编辑出版工作。第三章第三章 染色体和核型分析技术染色体和核型分析技术 复习1： 细胞的分裂基本概念基本概念 1无丝分裂（amitosis）：细胞核拉长呈哑铃状分裂，中部缢缩形成2个相似的子细胞。分裂中无染色体和纺锤体形成。如：纤毛虫、原生生物、特化的动物组织。 2有丝分裂(mitosis)：即体细胞分裂，通过分裂产生同样染色体数目的子细胞。在分裂中出现纺锤体。 3无性生殖(asexual reproduction)：通过有丝分裂，从个细胞或生物繁殖得到基因型完全相同的细胞或生物。也即克隆（clone）。

30、 4有性生殖(sexual reproduction)：减数分裂减数分裂和受精有规则地交替进行，产生子代的生殖方式。复习复习2：有丝分裂：有丝分裂 1间期(interphase)：为两次分裂的中间时期。通常讲的细胞核的形态和结构就是指的间期核，染色体没有可见的结构。 间期又可分为合成前期（G1）、合成期（S）及合成后期（G2）。在S期，DNA进行了复制。因此有丝分裂中的染色体是已复制了的两条染色单体。前期（prophase）： a. 染色体由细线状逐渐缩短变粗，由2条染色单体缠绕在一起。 b. 前期末核仁崩溃消失（某些低等生物核仁仍保留，分成2份到子细胞中）。 c. 前期末时核膜破裂成碎片，使

31、染色体最大限度地分散于细胞中。有丝分裂过程有丝分裂过程o 中期(Metaphase):主要完成纺锤体的结构及染色体在赤道面上的排列，核膜刚一消失，纺锤体即出现纺锤体即出现，进入中期。o 后期（Anaphase）：姐妹染色单体分开成独立的染色体。并由纺锤体连接着向两极移动，细胞伸长，连续纺锤体拉长。o 末期（Telophase）：染色体到达两极时，末期开始。 a. 核膜形成，核仁消失。 b. 染色体松散成染色质团。 c. 植物细胞中，在赤道板位置出现细胞板，即细胞壁；动物细胞中在赤道板位置胞质缢缩，形成两个子细胞。细胞板及缢缩环的位置是由纺锤体微管决定的。 复习复习3、染色质的基本结构、染色质的

32、基本结构o 染色质是细胞核内能被碱性染料染色的物质。根据染色反应的不同，可分为常染色质和异染色质。常染色质在间期呈高度分散状态（正在进行复制转录等），染色较浅，光镜下难以分辨。中期时发生螺旋化收缩变短。是产生Mendel比率和各类遗传现象的主要物质基础。异染色质在间期呈螺旋状态，染色较深。其基因活性受到影响。o 染色体是DNA和蛋白质组成的复合物。其中DNA占27，组蛋白质占66，RNA占6。一、染色体的结构二、染色体的结构模型二、染色体的结构模型1、核小体-一级结构 染色质是一种纤维状结构，它是由最基本的单位核小体(nucleosome)成串排列而成的，使得DNA、蛋白质、RNA组成为一种致

33、密的结构形式。核小体单位包括：166对bpDNA，一个组蛋白八聚体，一分子的组蛋白质H1。 这种由核小体串联的11nm的染色质纤维称为核丝，染色质的初级结构。2、螺线管(Solenoid)-二级结构由核小体的长链进一步螺旋缠绕形成直径约30nm左右的染色质纤维，即螺线管-染色质的。3、超螺线管-三级结构30nm的染色线（螺线管）进一步压缩形成300nm染色线，称为超螺线管。4、染色体超螺线管再次折迭和缠绕形成染色体。由DNA到核小体30nm染色质是按螺旋方式缩集的，染色体的最高层次结构是由300nm左右的染色线以螺旋方式缩集的，这四个等级的演变都是通过螺旋化实现的，称之为多级螺旋模型（mult

34、iplecoilingmodel）。 染色体（Chromosome）是遗传物质或基因载体的总称，包括原核生物及细胞器的遗传物质在内。但一般是指真核生物体细胞分裂中期具有一定形态的染色质。因这一时期染色体收缩到最短，形态上较为典型。 三、染色体形态及其分析（一）染色体的形态特征 1、大小 不同物种染色体大小差异较大。一般染色体数目少的则体积较大。一般情况下，植物大于动物，单子叶植物大于双子叶植物。如鱼类染色体数量多而体积小，小麦染色体大于水稻染色体。同一物种不同组织的细胞染色体可能有很大的差异。 不同处理方式影响染色体的大小。染色体只有通过制片，借助显微镜才能观察到，故制备方法影响很大。如秋水仙

35、素缩短染色体，高温下染色体缩短。 2、染色体形态结构 典型的染色体通常由长臂和短臂、着丝点和着丝粒、次缢痕和随体、端粒等几部分组成。 （1）着丝点（centromere）和着丝粒(kinetochore) 着丝点即初级缢痕或主缢痕。中期时，着丝点不发生收缩，呈现出透明的缢缩状结构，是纺锤丝（Spindle）附着的部位。着丝点是染色体不可缺少的重要结构。一个染色体可以丢失一个臂或两个臂的大部分也能复制，但若无着丝点，便无法复制而自然丢失。 以前，人们常常将着丝点和着丝粒作为同义词，指主缢痕，中文译作“着丝点”。随着电镜的应用，在着丝点区发现一个在光镜下不能分辨而在电镜下则清晰可见的纺锤体附着的特

36、殊结构。因此，国外学者指出： 着丝点：指两个染色单体保持连接在一起的初缢痕区。 着丝粒：只限于染色体上纺锤体微管附着的精细结构。 所以，着丝点泛指初缢痕区，不含明显的超微结构，光镜下可见，适于光镜下描述染色体使用。 着丝粒仅指纺锤体微管附着于染色体的特殊结构，仅在电镜下适于描述染色体的超微结构时使用。由于我们平时所讲的遗传学上染色体多是在光镜下的结构，所以常用着丝点一词。 通常着丝点在每条染色体上只有一个，且位置恒定，常用作描述染色体的一个标记。根据着丝点的位置，可以将染色体划分为不同的类型。 o 以广泛应用的Levan的四点四区系统为例： 简称着丝点的位置臂比值染色体与MT连结臂比值1984

37、年修改M正中部着丝点1.01.0m中部着丝点区1.01.71.011.70sm亚中部着丝点区1.73.01.713.0st亚端部着丝点区3.07.03.017.0t端部着丝点区7.07.01T端部着丝点 （2）次缢痕（Secondary Constriction）、核仁组织区（Nucleolar organizing region ，NOR）和随体（Satellite） 在一些植物中（尤其是大染色体的植物），在一个细胞的染色体中，至少有一对染色体除有着丝点外还有一个不发生卷曲的、染色很淡的区域，这个区域称做次缢痕。主要位于染色体短臂上。 核仁组织区顾名思义负责组织核仁的区域，含有rDNA基因，

38、能合成RNA。次缢痕与核仁组织区几乎可作同义词，只是在使用上有差别。通常在对染色体一般形态描述时用次缢痕（指有这样一种结构），而在讨论其功能时常用核仁组织区，表示次缢痕具有组成核仁的特殊功能。 随体是指次缢痕区至染色体末端的部分，有如染色体的小卫星。随体主要由异染色质组成，是高度重复的DNA序列。对这三个概念的区分应与功能联系起来。3、端粒(Telomere) 端粒指染色体的自然末端。不一定有明确的形态特征，只是对染色体起封口作用，使DNA序列终止。 端粒是染色体不可缺少的组成部分。保持了染色体的遗传上的独立性，无端粒的染色体就与其它无端粒染色体连接起来，造成后期染色体的缺失或重复。 核型分析

39、 根据染色体的形态特征。可以对物种进行核型分析。 所谓核型是指一个个体或物种的染色体的构成，包括染色体的大小、形态、数目。即指体细胞染色体在光学显微镜下所有可测定的表型特征的总称。 对一组染色体的形态特点进行细胞学研究（进行定性和定量的描述）称为核型分析。大多以有丝分裂中期染色体为标准，也有采用粗线期染色体。核型分析对于研究种内或种间的核型变化，染色体的数量或结构的变异，生物的起源和进化，以及鉴定染色体疾病等具有重要的作用。 （二）染色体的数目 1、染色体的数目特征 恒定性。同一种生物染色体数目是恒定的。 染色体在体细胞中是成对的，在性细胞中总是成单的。通常用2n和n表示，如水稻2n=24，n

40、=12；普通小麦2n=42，n=21。 不同物种染色体数目差异很大。 动物中最少的只有1对染色体（n=1）（即线虫类的一种马蛔虫变种；而另有一种蝴蝶（Lysandra）可达191对染色体（n=191） 植 物 中 ， 菊 科 植 物 H a p l o p a p p u s graxillis只有2对，隐花植物中瓶尔小草属（Ophioglossum）的一些物种含有400-600对以上的染色体。 但染色体数目多少与物种的进化无关。 2、A染色体和B染色体 有些生物的细胞中除具有正常恒定数目的染色体以外，还常出现额外的染色体。通常把正常的染色体称为A染色体；把这种额外染色体 统 称 为 B 染

41、色 体 ， 也 称 为 超 数 染 色 体（supernumerary chromosome）或副染色体（accessory chromosome）。 在640多种植物和170多种动物中发现B染色体，最常见的有玉米、黑麦、山羊草等。 B染色体较A小，多由异染色质组成，不载有基因，但自我复制并传给后代。 B染色体一般对细胞和个代生存没有影响，但当数量增加一定数量时就有一定的影响。玉米超过5个即不利于生存。 3、细菌染色体（原核生物） 原核生物同样具有染色体，但是裸露的DNA分子（细菌等）或RNA分子（病毒等）。DNA呈线状，或环状。细菌只有一个染色体。 如大肠杆菌的染色体呈环状，核苷酸对为310

42、6，长度为1 .1mm。（三）植物染色体制片实验 （一）实验目的（一）实验目的 1掌握染色体制片方法，并自选材料进行染色体制片。掌握染色体制片方法，并自选材料进行染色体制片。 2学会染色体核型分析。学会染色体核型分析。 （二）实验器具及试剂（二）实验器具及试剂 1器具器具 显微镜、载玻片、盖玻片、镊子、吸水纸、纱布块、解剖针、剪刀、显微镜、载玻片、盖玻片、镊子、吸水纸、纱布块、解剖针、剪刀、解剖刀、玻璃棒、铅笔、恒温水浴锅、温度计、冰箱、恒温干燥解剖刀、玻璃棒、铅笔、恒温水浴锅、温度计、冰箱、恒温干燥箱、显微摄影系统、照片打印纸箱、显微摄影系统、照片打印纸 2试剂试剂 酒精、冰醋酸、甲醇、盐酸

43、、铁矾、苏木精（或洋红、石炭酸品红）、酒精、冰醋酸、甲醇、盐酸、铁矾、苏木精（或洋红、石炭酸品红）、秋水仙碱（或对二氯苯饱和水溶液、秋水仙碱（或对二氯苯饱和水溶液、8-羟基奎啉、富民隆乳剂）、羟基奎啉、富民隆乳剂）、二甲苯、中性树胶、石碳酸、甲醛、山梨醇等。二甲苯、中性树胶、石碳酸、甲醛、山梨醇等。 （三）实验内容 1、压片法 在生物技术上，除用切片法观察细胞外，还可用压片法，尤其是观察细胞中的染色体数目，用压片法最为合适，不仅省事，结果也比切片法好。 压片法是将材料置载玻片上，用解剖刀或解剖针拨开，加染液一滴，盖以盖玻片，施以压力，使材料破碎，细胞分散，然后进行观察。压片法种类很多，下面介绍

44、两种： （1 1）醋酸）醋酸洋红法洋红法 此法多用于制备幼小花药，观察花粉母细胞减数分裂的压片。而对根此法多用于制备幼小花药，观察花粉母细胞减数分裂的压片。而对根尖压片有时染色不好尖压片有时染色不好( (但对洋葱根尖染色较好但对洋葱根尖染色较好) )。其步骤如下：。其步骤如下： 将花药或根尖将花药或根尖( (先切成先切成0.5cm0.5cm长长) )，投入卡诺氏固定液中固定，投入卡诺氏固定液中固定1 1刻钟刻钟至至l l小时。小时。 然后移至然后移至7070酒精中保存。酒精中保存。 取固定保存的材料放入盐酸酒精解离液取固定保存的材料放入盐酸酒精解离液(95(95酒精一份，浓盐酸一份，酒精一份，

45、浓盐酸一份，将二者混合即成将二者混合即成) )中中5 58 8分钟。或置分钟。或置1N1N盐酸盐酸( (取比重取比重1.191.19的盐酸的盐酸82.582.5毫升，加水至毫升，加水至10001000毫升即成毫升即成) )中于中于6060的水浴温度下，处理的水浴温度下，处理6 68 8分钟，至透明为止。分钟，至透明为止。 用清水冲洗干净解离液。用清水冲洗干净解离液。 取洗净的材料，放在载玻片上，用醋酸洋红染液取洗净的材料，放在载玻片上，用醋酸洋红染液( (或醋酸苏木精染或醋酸苏木精染液液) )染色染色5 51010分钟。分钟。 然后将材料移至另一清洁的载玻片上。重新用染液装片，覆以然后将材料移

46、至另一清洁的载玻片上。重新用染液装片，覆以盖玻片，以铅笔的橡皮头端轻轻压盖玻片，使材料呈现分散的薄盖玻片，以铅笔的橡皮头端轻轻压盖玻片，使材料呈现分散的薄层，置镜下观察。层，置镜下观察。 （2 2）铁矾）铁矾苏木精法苏木精法 此法一般用于细胞有丝分裂中的染色体计数，由于染色体被染成此法一般用于细胞有丝分裂中的染色体计数，由于染色体被染成紫兰黑色，用于显微照相，效果较好。（由于各种植物有自己的特紫兰黑色，用于显微照相，效果较好。（由于各种植物有自己的特殊性，因此，取材的时间、取材的部位、预处理的时间、固定的时殊性，因此，取材的时间、取材的部位、预处理的时间、固定的时问、水解的时间、染色的时间等，

47、都有可能不同。在此只作了大致问、水解的时间、染色的时间等，都有可能不同。在此只作了大致的介绍，具体材料还需作预备实验进行摸索。另外还要注意，各次的介绍，具体材料还需作预备实验进行摸索。另外还要注意，各次水洗一定要洗干净沾在材料上的药液，以免影响下一个步骤的结水洗一定要洗干净沾在材料上的药液，以免影响下一个步骤的结果。）果。） 染色步骤如下染色步骤如下( (以蚕豆根尖作材料为例以蚕豆根尖作材料为例) )： 取材：将蚕豆种子萌发。待种子根长至取材：将蚕豆种子萌发。待种子根长至1cm1cm左右，在上午左右，在上午8 8时时1111时之间，切下长约时之间，切下长约0.5cm0.5cm的根尖，进行预处理

48、。的根尖，进行预处理。 预处理：目的使分裂细胞的染色体缩短和比较分散，便于压片观预处理：目的使分裂细胞的染色体缩短和比较分散，便于压片观察。预处理是在固定以前进行，方法是将材料切下放入以下溶液：察。预处理是在固定以前进行，方法是将材料切下放入以下溶液： 0.050.050.20.2秋水仙碱水溶液中处理秋水仙碱水溶液中处理2 25 5小时；或：对二氯苯饱和小时；或：对二氯苯饱和水溶液中处理水溶液中处理3-53-5小时；或：小时；或：8-8-羟基奎啉羟基奎啉(0.004(0.0040.0050.005) )，处理，处理2 21212小时；或：富民隆乳剂小时；或：富民隆乳剂(0.01(0.01) )

49、，处理，处理24244848小时；或：在小时；或：在0 033下冷冻处理下冷冻处理2424小时。小时。 固定：通常用固定：通常用9595酒精酒精冰醋酸冰醋酸(3(3：1)1)固定液固定固定液固定1 12424小时。固小时。固定后换入定后换入7070酒精中保存。一般可保存酒精中保存。一般可保存1 12 2星期，如放入冰箱中星期，如放入冰箱中(3(38)8)则可保存数月。则可保存数月。 离析：将保存在离析：将保存在7070酒精中的根尖，用刀纵切成两半，换入蒸馏酒精中的根尖，用刀纵切成两半，换入蒸馏水，然后移入水，然后移入1N1N盐酸中，在盐酸中，在6060的水浴中离析的水浴中离析10101515分

50、钟。分钟。 水洗：离析后必须用水洗净残留盐酸，否则会影响染色。水洗：离析后必须用水洗净残留盐酸，否则会影响染色。 媒染：将根尖移入媒染：将根尖移入4 4铁矾水溶液中，媒染铁矾水溶液中，媒染20203030分钟，然后用水分钟，然后用水洗净。洗净。 染色：放入染色：放入0.50.5苏木精水溶液染色苏木精水溶液染色3 35 5小时，如果需要染色较久小时，如果需要染色较久( (例如过夜例如过夜) )则可将苏木精溶液浓度稀释。则可将苏木精溶液浓度稀释。 压片：用镊子夹取根尖一段，放在载玻片上，滴上一小滴醋酸，压片：用镊子夹取根尖一段，放在载玻片上，滴上一小滴醋酸，迅速捣碎根尖，盖上盖玻片，用铅笔的橡皮头

51、轻压，使材料分散迅速捣碎根尖，盖上盖玻片，用铅笔的橡皮头轻压，使材料分散成一薄层。成一薄层。 镜检：将材料压好后，放置显微镜下观察。镜检：将材料压好后，放置显微镜下观察。 2 2、永久制片法：也可按以下步骤制成永久制片：、永久制片法：也可按以下步骤制成永久制片： 若要作永久保存，可将玻片放在电冰箱中冷冻，结了冰霜后便可若要作永久保存，可将玻片放在电冰箱中冷冻，结了冰霜后便可揭下盖玻片，然后将沾有材料的玻片分别与另外干净的盖玻片和载揭下盖玻片，然后将沾有材料的玻片分别与另外干净的盖玻片和载玻片进行封片处理，制作永久玻片。玻片进行封片处理，制作永久玻片。(1)(1) 将压片直接倒放在盛有将压片直接