工业微生物育种

1、1. 工业微生物育种在发酵工业中的作用如何？其目的是什么？ 工业微生物育种建立在：（1）遗传和变异（微生物遗传学）的基础之上；（2）物理和化学诱变剂的发现和应用；（3）工业自动化（自动仪表装置和微机）。工业微生物育种在发酵工业中占有重要地位，是决定该发酵产品能否具有工业化价值及发酵过程成败与否的关键。2. 工业微生物发展经历了哪几个阶段？ 1)自然选育阶段 2)人工诱变选育阶段 3)杂交育种阶段 4)代谢控制育种阶段 5)基因工程育种阶段3. 工业微生物育种的核心指标有哪些？1) 在遗传上必须是稳定的。稳定性。2) 易于产生许多营养细胞、孢子或其它繁殖体。3) 必须是纯种，不应带有其他杂菌及噬

2、菌体。4) 种子的生长必须旺盛、迅速。5) 产生所需要的产物时间短。转化率。6) 比较容易分离提纯。 7) 有自身保护机制，抵抗杂菌污染能力强。 8) 能保持较长的良好经济性能。产率。9) 菌株对诱变剂处理较敏感，从而可能选育出高产菌株。10）在规定的时间内，菌株必须产生预期数量的目的产物，并保持相对地稳定。4. 革兰氏阳性和阴性菌的细胞壁结构有何差异？它们对溶菌酶和青霉素的敏感有何不同？5. 缺壁细菌有哪些类型和异同？制备缺壁细菌主要有哪些途径？原生质体：G+菌经溶菌酶或青霉素处理；球状体：G-菌，残留部分细胞壁。是研究遗传规律和进行原生质体育种的良好实验材料。L型细菌：自发突变形成细胞壁缺

3、陷菌株；6. 原生质体制备时，为什么不同微生物要选择不同的酶？举例说明。酶在原生质体制备中主要用来酶解细胞壁的，不同的微生物其细胞壁成分及含量可能不同，所以要用不同的酶。 酵母菌的细胞壁主要成分有葡聚糖、甘露聚糖蛋白质、几丁质。霉菌的细胞壁：主要成分是纤维素、几丁质、葡聚糖等 。藻类的细胞壁：主要成分有纤维素构成结构骨架。7. 基因组、基因、密码子、简并、同义密码子的概念是什么？一、基因组1. 原核生物 就是它的整个染色体，原核生物的基因组较小，DNA的含量低，如E.coli的DNA分子质量为2.4×109Da，相当于4.2×106bp，含有3000-4000个基

4、因，SV40病毒仅5个基因。2. 真核生物 能够维持配子或配子体正常功能的最低数目的一套染色体，称为基因组。分子大，达到5×1081010bp。重复序列是基因组结构的一个特点，原核生物少，真核生物多，真核生物DNA序列（1）单一序列：单拷贝；（2）轻度重复序列：2-10个拷贝；（3）中度重复序列：10-几百个拷贝；（4）高度重复序列：几百-几万个拷贝。二、基因基因：是一个遗传信息单位，对应着一段编码多肽氨基酸顺序的不连续DNA片段。基因家族：由一个基因通过基因重复而产生两个或更多的拷贝而构成的一组基因。操纵子：乳糖操纵子多基因家族：简单多基因家族（每个重复单元含有单一的转录和非转录区

5、），复杂多基因家族（每个重复单元含有多个不同的转录区和非转录区）。中心法则：遗传信息以DNARNA蛋白质这种方向进行传递；反转录病毒可以由RNA合成DNA。基因的编码序列在DNA分子上是不连续的，为一系列DNA片段所隔开，编码序列称为外显子，把外显子割裂的DNA片段称为内含子。拟基因：某些基因因DNA序列发生变化，在序列上与活性基因相似，但不具有功能、不能编码蛋白质。转座子：能在同一细胞的不同染色体之间或者同一染色体的不同位点之间转移的一些DNA序列。转座因子的转座会引起极性效应插入突变、缺失和倒位等多种遗传效应。3、 遗传密码 密码子：mRNA上三个连续的核苷酸决定一个特定的氨基酸，这三 个

6、核苷酸称为密码子。 简并：几种密码子编码同一种氨基酸的现象。 同义密码子：对应于同一氨基酸的不同密码子。 基因组:个体或细胞所含的全套基因的总和。在原核生物中为整个染色体。基因:DNA 分子的一个片段。密码子:mRNA 分子中以三个核苷酸为一组，决定一种氨基酸以及多肽链合成起始与终止的信号。 简并:两种或多种核苷酸三联体决定同一种氨基酸。同义密码子:对应同一氨基酸的不同密码子。8. 起始密码子和终止密码子有哪些？起始密码子：AUG 终止密码子：UAA UAG UGAmRNA上的碱基顺序每3个碱基用解读框架划分开，可决定其所生成蛋白质的氨基酸顺序，为了使碱基顺序作为遗传信息能正确转译，通常需要从

7、某个特定的位置开始转译。这个起始点的密码子就叫做起始密码子。起始密码子是定位翻译开始位置的信号标记。AUG 少数细菌(属于原核生物)以GUG(缬氨酸)或UUG为起始密码子。 蛋白质翻译过程中终止肽链合成的信使核糖核酸(mRNA)的三联体碱基序列。一般情况下为UAA、UAG和UGA，它们不编码氨基酸。 9. 什么是可读框？密码子阅读的方向是沿着mRNA的什么方向进行？可读框是以起始密码子开始，在三联体读框的倍数后出现终止密码子之间的一段序列。可读框有可能编码一条多肽链或一种蛋白质。当没有已知蛋白质产物时，该区域被称为可读框,而当确知该可读框编码某一蛋白时，它就被称为编码区，即一个可读框

8、是潜在的编码区。很多情况下，可读框即指某个基因的编码序列。自起始密码子到终止密码子之间的核苷酸三联体序列。一般情况下，可读框即指 某个基因的编码序列。由起始子AUG(甲硫氨酸)开始，每三个为一个密码子翻译，直至遇到终止子。10. 基因突变的特征有哪些，请做简单解释。1、 突变的稀有性 自然突变频率很低，细菌10-410-10，高等生物10-510-8，不同的生物，不同的基因其突变率相差较大。2、突变的重演性和可逆性 指同种生物的同一基因突变为相同的表型，可以在不同个体间重复出现。3、突变的平行性 即可发生回复突变，显性基因可以突变为隐性基因，而隐性基因也可以突变为显性基因，前者称为正向突变，后

9、者称为回复突变。4、突变的多方向性与复等位基因 亲缘关系相近的物种由于遗传物质相近，而发生相似的基因突变，基因的突变可以向多个方向进行，一个基因可以突变为a1、a2、a3an等而构成所谓的复等位基因。这些复等位基因可以从野生型基因突变产生，也可以从其它任何一个突变基因突变产生。5、突变的有害性和有利性 突变大多数是有害的。这是因为生物经长期的自然选择，产生了与外界环境相同协调的关系，这种关系一旦因突变而改变便可能干扰内部的生理生化过程，所以大部分突变对生物体是不利的。少数的突变能促进和加强某些生命活力，所以是有利的突变。例如作物抗病性，微生物的抗药性等，这些突变为生物进化提供了最有利的条件。1

10、1.突变发生后，细胞内有哪些修复突变的机制？DNA结构被改变后：一种是DNA分子在复制过程中排除或克服修复系统的作用而成为突变体；另一种是经修复系统修补后恢复原有DNA分子结构，不能形成突变体。 微生物修复系统：光修复和暗修复（复制前修复和复制后修复） 紫外线诱变作用：主要是使DNA单股链上的邻近两个嘧啶碱基结合形成嘧啶二聚体，DNA链的结构发生变形，失去碱基正常配对，DNA复制、RNA转录都不能正常进行，成为一条有缺口的DNA链。12. 什么是表型延迟？怎样避免表型延迟现象？表型延迟：是指微生物通过自发突变或人工诱变而产生新的基因型个体所表现除了的遗传特性不能在当代出现，其表型的出现必须经过

11、2代以上的复制。（1）与诱变剂性质和细胞壁结构组成有关，有些诱变剂渗入细胞的速度相当慢。（2）若突变发生在多核细胞中的某一个核，该细胞就成为杂核细胞了。如果该核突变的基因是唯一控制突变表型的基因，那么突变是隐性的，只有几代繁殖分裂得到纯的核突变细胞，才能出现由该基因控制的突变表型。（3）原有基因产物的影响 原有基因产物在子细胞中的浓度随着繁殖逐步稀释到最低限度后，突变表型才显现。13. 诱变剂主要有哪三类？诱变剂：凡能诱发生物基因突变，并且突变频率远远超过自发突变率的物理因子或化学物质。（1） 物理诱变剂，例如，电离辐射、紫外线、电磁波等（2） 化学诱变剂，如药品、农药、食品添加剂、调味品、化

12、妆品、洗涤剂、塑料、着色剂、（3） 生物诱变剂，如真菌的代谢产物、病毒、寄生虫等。（4） 生物体内还有一些内源性诱变剂。内源性诱变剂是在人体健康异常的情况下产生的，如遗传因素、内分泌紊乱等。14. 简述紫外线照射诱变育种的原理、方法和基本步骤。1. 紫外线的诱变机制 紫外线引起： DNA与蛋白质的交联；胞嘧啶与尿嘧啶之间的水合作用；DNA链的断裂；嘧啶二聚体的形成（单链上相邻两个胸腺嘧啶之间或双链相对应的两个胸腺嘧啶之间）。最有效波长为253.7 nm（2537Å），即260 nm的紫外线。 绝对剂量单位：erg/mm2相对剂量单位：用照射时间或杀菌率表示。一般认为杀菌率在90%99

13、.9%时，诱变效果较好。不同微生物所需杀菌时间15W功率的紫外灯管和固定距离为30cm的条件下照射微生物，要使杀菌率达到9099.9的效果：芽孢菌约需10 min；照射短小芽孢杆菌的营养体来获得缺陷型需要13 min；一般微生物营养体照射35min；无芽孢菌和革兰氏阳性菌只需0.52 min。紫外线诱变的步骤与方法：（1）出发菌株，把细菌斜面培养到对数期，霉菌或放线菌则培养到孢子刚成熟。（2）前培养，营养丰富的培养基，同时加入抑制修复的物质（咖啡碱或异烟肼），达到最佳生理状态。（3）制备菌悬液；（4）紫外线照射，暗室进行，或诱变后立即浸入冰水中12 h，低温抑制突变修复。（5）后培养，根据延迟

14、现象的原理，照射完毕的菌悬液加入到适合于正突变体繁殖的培养基，在适宜温度下培养1.52 h。（6）稀释涂皿，后培养结束后，从中取一定量培养物，作不同稀释度，涂皿，并且以未经紫外线照射过的菌悬液作对照，培养后，挑取菌落，以待筛选。 15.化学诱变剂主要有哪四类？化学诱变剂：是一类能对DNA起作用、改变起结构、并引起遗传变异的化学物质。包括：碱基类似物、烷化剂、移码突变剂以及其他种类等。化学突变剂具有专一性，只对基因的某部位发生作用。化学诱变剂的剂量主要决定于其浓度和处理时间。剂量使用原则：以诱变效应大，而副反应小为原则。注意：90以上的化学诱变剂都是致癌物质或极毒药品。使用时注意自身安全，并防止

15、污染环境。 一、碱基类似物 是一类和天然的嘌呤嘧啶等四种碱基分子结构相似的物质。既能诱发正向突变，又能诱发回复突变。2、 烷化剂 活性烷基易取代DNA分子中活泼的氢原子，从而改变DNA分子结构，引起突变。3、 脱氨基 亚硝酸的诱变机制 亚硝酸可直接作用于正在复制或未复制的DNA分子，脱去碱基中的氨基变成酮基，改变碱基氨氢键的电位，引起转换而发生变异。还可引起DNA两条单链之间交联。4、 移码诱变剂 移码诱变剂与DNA相互结合引起碱基增添或缺失而造成突变。五、羟化剂 羟胺（HA）1. 羟胺的诱变机制：G:CA:T2. 羟胺的处理方法 六、金属盐类七、其他化学诱变剂1. 秋水仙碱：诱变辅助剂 2.

16、 抗生素: 链黑霉素、争光霉素、丝裂霉素、放线菌素、正定霉素、光辉霉素、阿霉素，诱变辅助剂。 16.烷化剂的作用机制是什么？主要通过烷化基团使DNA分子上的碱基及磷酸部分被烷化，DNA复制时导致碱基配对失误而引起突变。突变的主要位点：鸟嘌呤的N7，鸟嘌呤的O6、胸腺嘧啶O4突变的次要位点：鸟嘌呤的N3，腺嘌呤的N2、腺嘌呤的N7、胞嘧啶N3 17. 简述亚硝基胍诱变育种的原理、过程和安全注意事项。超级诱变剂之称，适合诱发营养缺陷型突变株，还能使多基因并发突变。NTG在水溶液中随不同pH将产生不同的分解产物。通常在pH 6.0的条件下进行诱变处理，常用磷酸缓冲液和Tris缓冲液。 NTG诱变处理

17、方法：步骤： 新鲜斜面制备菌悬液； 配制NTG母液； 菌悬液和NTG溶液混合保温处理； 以冷的生理盐水稀释洗涤菌体终止反应。 平皿分离。其他方法：液体培养后直接加入NTG；NTG与琼脂和菌液混合制平板。 注意：NTG是一种强烈致癌物质，操作时要带橡皮手套，穿工作服，带口罩，用称量瓶称量，最好在通风橱中进行。凡接触过NTG的器皿必须及时、单独处理，例用自来水大量冲洗或用1-2N的NaOH浸泡过夜，洗净。18.生物诱变剂按照诱变方式主要分为哪三类? 1）转导诱发突变2）转化诱发突变3）转座诱发突变19. 什么是菌株分离和筛选？菌株分离：就是将一个混杂着各种微生物的样品通过分离技术区分开，并按照实际

18、要求和菌株的特性采取迅速、准确、有效方法对它们进行分离、筛选，进而得到所需微生物的过程。 20. 分离筛选的基本步骤有哪些？菌种的分离和筛选一般可分为采样、富集、分离、产物鉴别这几个步骤。 21. 抑制不需要菌类的常用方法有哪些？通过高温、高压、加入抗生素等方法减少非目的微生物的数量，使目的微生物的比例增加，同样能够达到富集的目的。 高温处理抑制不产芽孢菌； 胆盐和十二烷基磺酸钠抑制革兰阳性菌 ；硫乙醇酸钠 抑制好氧菌；四环素等抗生素抑制细菌 ；重铬酸钾抑制土壤真菌、细菌 。22. 好气微生物分离的常用方法有哪些？它们的原理如何?粗放：菌落纯 细化：菌株纯、细胞纯（1） 稀释涂布法 （二）划线

19、分离法 （三）利用平皿的生化反应进行分离 1、透明圈法 混浊底物被分解后形成透明圈。如脂肪酶、淀粉酶、蛋白酶、核酸酶、有机酸等。 2、变色圈法：直接用显色剂或指示剂 果胶酶：刚果红（绛红色水解圈）谷氨酸：溴百里酚兰（pH 6.2以下为黄色， pH 7.6以上为蓝色）内肽酶：吲羟乙酸酯被产酶菌落水解为3-羟基吲哚，后者氧化成蓝色物质）乙醇：蓝色的盐类物质在醇脱氢酶和NAD作用下反应产生电子脱色，形成淡白色晕圈。 3、生长圈法 用于分离筛选氨基酸、核苷酸和维生素的产生菌。 利用某些具有特殊营养要求的微生物（营养缺陷型菌株）作为工具菌，要分离的微生物能在一般培养条件下生长而合成该营养物而使工具菌能生

20、长，形成生长圈 。 4. 抑菌圈法 常用于抗生素产生菌的 分离筛选。 （四）组织分离 1. 对一般有病组织的分离方法清洗组织表面0.1升汞表面消毒无菌水冲洗适宜温度培养挑取菌落2. 食用菌孢子分离方法（1）组织块分离法：组织块切小块，斜面直接培养。（2）多孢子分离：表面消毒，孢子采集。（3）单孢子分离：收集到的孢子稀释涂布培养。（五）单细胞或单孢子分离法1、显微挑取法 采取显微分离法从混杂群体中直接分离单个细胞或单个个体进行培养以获得纯培养 。2. 小滴分离纯化培养法（六）特殊菌类环保降解菌的分离多环芳烃、有机染料和颜料、表面活性剂、农药、酚类和卤代烃。分离筛选这类物质的降解微生物时，通常采用

21、以该物质为唯一碳源或氮源的培养基进行富集培养。23. 平皿生化反应分离有哪些主要方法？原理如何？见22。24. 如何用焦性没食子酸法分离厌气菌？焦性没食子酸和NaOH互相反应除去氧气。除去100ml空气中的氧气需要焦性没食子酸固体1g和10%NaOH溶液10ml。无菌培养皿一套，在皿盖内到上分离培养基，凝固后，皿底一侧放焦性没食子酸固体，另一侧放10% NaOH溶液，使二者不相接触。分离操作后，摇动平皿使焦性没食子酸固体和NaOH溶液混合，发生化学反应，除去皿内的氧气。 25.初筛和复筛的要求有什么不同？初筛是指从大量的菌落中随机挑取进行摇瓶试验并通过检测得到一些较优菌株。复筛是指将初筛得到的

22、较优菌株再进行多次摇瓶实验验证其效价和传代稳定性，并从中得到一两个或少数几个最优的菌株。 通过定义可以知道，复筛不仅要将初筛得到的菌种进行再次发酵验证，还需要进行传代验证，就是传很多代，每代或隔代进行发酵验证，看齐稳定性。25. 育种的准备工作有哪些？诱变的结果是产生变异，负变机率高于正变。高产突变型是多基因决定，需要多代诱发突变逐渐积累。诱变育种工作包括：诱发突变、突变株的筛选和高产突变株最佳环境条件的调整。在诱变育种前，应该对大生产的设备和工艺具有相当的知识和全面的了解。诱变的工作量大，周期长,事先要做好充分的准备。1、 诱变前对出发菌株的了解 1. 区分不同菌落类型 2. 出现不同菌落类

23、型原因 遗传因素造成的菌落变化 非遗传因素造成的菌落变化：培养基组成；培养基来源与质量；平板厚度；菌落密度；菌的不同的生长阶段。2、 全面了解菌种特性及其与生产性能的关系 考查生活史：如土霉素菌种原先要培养12d其实是包含了三代的生活周期。各代高产性能不同。研究菌种的某些生物学特性与产量合成的相关性：顶头孢菌素C的产量，随着其产生菌顶头孢霉菌的节孢子体积增大或数量增加而提高。考察菌落大小和颜色，如灰黄霉素产生菌荨麻青霉紫色素越深，灰黄霉素产率越低。 三、了解影响菌种生长发育的主要因素 1、培养基的选择2、培养基斜面制备技术3、接种密度4、培养温度5、培养湿度6、试剂和原材料质量 四、了解产物各

24、组分与培养条件的关系 如刺孢小单孢菌产生的庆大霉素，其中的C1是有效的，C2是无效的，培养基中加入适量的磷和蛋白胨及加大通风都有利于C1的合成，反之，C2的比例就上升。 五、快速准确的检测方法 建立一个适应于大规模筛选的有效检测方法是减少诱变选育工作量的关键。 六、最佳的菌种保藏方法事先要建立一个最佳的培养基、培养条件和适宜的保藏方法，否则将前功尽弃。26. 诱变育种的基本路线是怎样的？诱变育种的优缺点 优点：方法简单、投资少、收获大；缺点：缺乏定向性。诱变育种的步骤和方法：出发菌株的选择单孢子菌悬液的制备诱变剂及诱变剂量的选择诱变的处理方法纯化分离等。27.试设计诱变选育营养缺陷型菌株、产蛋

25、白酶细菌、产有机酸霉菌的整个方案，并做出说明。28.什么是增变菌株？29.诱变剂的最适剂量如何选择？ 合适剂量：应使所希望得到的突变株在存活群体中占有最大的比例。 最适剂量：能扩大变异幅度又能促使变异移向正向突变范围的剂量。经长期诱变的高产菌株：低剂量处理。遗传性状不太稳定的菌株：用较温和的诱变剂和较低的剂量处理。要筛选具有特殊性状或较大幅度提高产量的菌株：可以用强诱变剂和高剂量处理。诱变史较短的野生低产菌株：开始宜采用较高剂量，而后逐步用温和诱变剂低剂量处理。多核细胞菌株：较高剂量处理。30. 诱变剂对产量性状的诱变趋势是怎样的？处理剂量大，杀菌率高，在单位存活细胞中负变菌株多，正变菌株少。

26、经长期诱变的高产菌株，正突变率的高峰多出现在低剂量区，负变率在高剂量时更高。诱变史短的低产菌株，正变株的高峰比负变株高得多，小剂量诱变处理时正突变株多。31. 影响突变率有哪几个因素？（一）菌种遗传特性不同 5-BU对静止或休眠细胞不起作用；紫外线、电离辐射、烷化基、亚硝酸等对分裂细胞和静止孢子都有效。（二）细胞壁结构丝状菌孢子壁较厚，表面蜡质也会阻碍诱变剂渗入。或需用洗衣粉、脂肪酶、表面活性剂等处理去除蜡质。（3） 环境条件的影响1、诱变前预培养和诱变后培养预培养：培养基中加入咖啡因、蛋白胨、酵母膏、吖啶黄、b重氮尿嘧啶、嘌呤等物质能提高突变率。后培养：诱变后的菌悬液不直接分离于平板，而是立

27、即转移到营养丰富的培养基中培养数代。作用是让突变体重新调节代谢平衡，避免突变体表型延迟现象。2、温度、pH、氧气等外界条件对诱变效应的影响 化学诱变因子: T，速度。 最适pH：避免诱变剂分解而失去诱变效应。 辐射因子、紫外线：氧气充足有利于突变发生。3、平皿密度效应 密度要适中，不能过密。32. 一般筛选程序是怎样的？第一轮：一个出发菌株诱变处理选出200个菌株初筛每瓶一株选出50株复筛每株4瓶选出3-5株第二轮：4个出发菌株诱变处理4*100株初筛每瓶一株选出50株 复筛每株4瓶选出3-5株33. 简述琼脂块大通量筛选方法的过程和特点适用对象：抗生素、酶类产物。 优点：效率提高15-20倍

28、。 缺点：产物浓度高时易漏筛，培养条件与发酵条件差距大。 方法：琼脂块扩散圈和溶剂抽提法。 准确性：较直接分离在平皿上判断活性法要准确。10、 什么是正交表？正交表的代号表示什么？正交表的常用分析方法包括哪两种？ 正交表记为 Ln（mk），m是各因素的水平，k （列数）是因素的个数，n 是安排试验的次数（行数）。正交表的记号：L9（34）表示 4 个因素，每个因素取 3 个水平的正交表。 L9（34）4因素3水平正交试验，共做9次试验，而全面试验要做 34=81 次，减少了72次。方差分析和标准差分析。11、什么是营养缺陷型？原养型？野生型？野生型菌株：从自然界分离到的未经诱变的原始菌株。营养

29、缺陷型：野生型菌株经过人工诱变或自然突变失去合成某种营养（氨基酸、维生素、核酸等）的能力，只有在基本培养基中补充所缺乏的营养因子才能生长。原养型：营养缺陷型菌株经回复突变或重组变异后产生的菌株，其营养要求在表型上与野生型相同。12、 什么是完全培养基？基本培养基？补充培养基？基本培养基(MM)- 完全培养基(CM)+ 补充培养基(SM)A、B13、 试述营养缺陷型菌株诱变选育的基本过程。一般包括诱发突变、淘汰野生型菌株、检出缺陷型、鉴别缺陷种类。14、 营养缺陷型检出有哪几种常用方法？原理如何? 1. 点植对照法 2. 影印法 3. 夹层法 4. 限量补充培养法15、 营养缺陷型缺陷类型测定和

30、生长谱测定的基本原理是什么？营养缺陷型的鉴定 确定菌株属于哪一类营养缺陷型或缺哪一种营养因子.1、鉴定方法 （1）一种营养因子，多株菌； （2）一个菌株，多种营养因子（生长谱法）。2、鉴定步骤 测定缺陷型菌株所需生长因子的类别 具体测缺陷该类别物质中的哪种因子 用单一生长因子复证试验（1）缺陷型类别的测定 氨基酸混合物、酪素水解物或蛋白胨：氨基酸； 酵母浸出液：氨基酸、维生素、碱基混合物； 维生素混合物：维生素； 核酸碱基混合液或酵母核酸水解物：碱基。16、 什么是温敏突变株？ 特性 TS突变株：对温度敏感的条件致死突变。 突变类型：错义突变： 生化特性：酶活力受温度控制，17、 噬菌体分离和

31、效价测定有哪四种常用方法？烈性噬菌体及其效价的测定1、重层琼脂法：弥补平皿底面不平，使噬菌斑较大。2、单层平板法：只求验证是否存在噬菌体，不求计数。3、快速测定法：低浓度琼脂，借助放大设备，适合工业发酵中早期检测。4、斑点试验法：将宿主菌涂布平板，不同稀释度待测试样点于平板，培养后，根据噬菌斑形成与否判断噬菌体效价。34.什么是初级代谢和次级代谢？一、初级代谢和初级代谢产物 1. 分解代谢体系：糖、脂、蛋白质 2. 素材性生物合成体系：氨基酸、核苷酸 3. 结构性生物合成体系： 蛋白质、核酸、多糖、类脂二、次级代谢和次级代谢产物次级代谢产物是对产生它们的生物本身不需要的一种产物。如抗生素、生长

32、刺激素、生物碱、色素、毒素以及甾体。35.初级代谢调节最有效的手段是什么？微生物细胞内的所有生化反应都是在酶的催化下进行的，因此对酶的调节控制是主要的、最有效的调控方式。1. 反馈阻遏：调节酶的合成量。2. 反馈抑制：调节现成酶分子的催化活力。 36.酶合成调节与酶活性调节的区别。酶合成的调节：通过调节酶的合成量进而调节代谢速度的调节机制，这是一种在基因水平上的代谢调节。酶活性的调节前体激活：后面的反应被前面的中间产物所促进。反馈抑制：末端代谢产物过量抑制前面的酶活性。37. 反馈阻遏和反馈抑制的区别。反馈抑制是通过调节变构酶的活力得以实现，因为不涉及蛋白质的合成过程，调节的效果比较直接而快速

33、。反馈阻遏是对酶合成的阻遏，是基因转录水平上的代谢调节，效果不及反馈抑制那样迅速。 38. 什么是诱导和阻遏？诱导 组成酶：细胞固有的酶类，其合成是在相应的基因控制下进行，“与生俱来”。 诱导酶：细胞为适应外来底物或其结构类似物而临时合成的一类酶，“后天学习” 。 （1）同时诱导：诱导物加入后，微生物能同时或几乎同时诱导几种酶的合成，主要存在于短的代谢途径中。 （2）顺序诱导：先合成能分解底物的酶，再依次合成分解各中间代谢物的酶，以达到对复杂代谢途径的分段调节。阻遏 通过阻遏作用来阻碍代谢途径中包括关键酶在内的一系列酶的生物合成，从而更彻底地控制代谢和减少末端产物的合成。 末端产物阻遏：由某代

34、谢途径末端产物过量累积而引起的阻遏。 分解代谢物阻遏：有两种碳源（或氮源）分解底物存在时，细胞利用快的那种分解底物会阻遏利用慢的低物的有关分解酶合成的现象。39.什么是末端产物阻遏和分解代谢物阻遏？见上。40.反馈抑制有哪6种基本类型？1、直线式代谢途径中的反馈抑制2、分支代谢途径中的反馈抑制(1) 协同反馈抑制 (2)累积反馈抑制(3)增效反馈抑制 （4）顺序反馈抑制（5）同工酶调节41. 什么是代谢调节控制育种？其常用方法有哪些？通过定向选育某种特定的突变型，改变代谢通路、降低支路代谢终产物的产生或切断支路代谢途径及提高细胞膜的透性，以达到大量积累有益产物的目的。42. 组成型突变株和抗分

35、解调节突变株选育的基本方法有哪些？1、限量诱导物恒化培养将菌种诱变后移接到低浓度诱导物的衡化器中连续培养。2、 循环培养 在含诱导物和不含诱导物的培养基上交替连续循环培养。3、 鉴别性培养基的利用 以甘油为唯一碳源，菌落上喷O-硝基苯酚-D-半乳糖苷（ONPG），通过显示来判断半乳糖苷组成型突变株。 4、筛选 用诱导能力低，但能作为良好碳源的诱导物的培养基上培养，突变体良好生长，野生型不能生长。如利用苯-半乳糖苷酶组成型突变株。 （一）解除碳源调节突变株的选育1、 循环培养法：快速利用和慢速利用的碳源交替培养2、鉴别性培养基：菌落上喷O-硝基苯酚-D-半乳糖苷（ONPG），显色筛选半乳糖苷酶解

36、除碳源调节的突变株。3、特殊氮源：用葡萄糖为碳源，受阻遏酶的底物为惟一氮源配制成培养基。4、葡萄糖结构类似物 如2-脱氧葡萄糖（2-dG）和3-O-甲基葡萄糖（3-mG），不被微生物利用，不被代谢，但可以阻遏诱导酶的合成。 筛选方法：低浓度葡萄糖类似物及一种生长碳源。 抗性突变株的性质：抗分解阻遏突变型。（2） 解除氮源分解调节突变株的选育含氮底物的酶受到快速利用的氮源阻遏，铵盐和其他快速利用的氮源对抗生素的生物合成具有分解调节作用。（三）解除磷酸盐调节突变株的选育1、磷酸盐对次生产物的调节机制 通过初级代谢的变化影响次级代谢；可以加强初级代谢，或者改变糖类的分解代谢途径，或者限制抗生素合成的

37、诱导物。 发酵中，添加浓度要控制在亚适量水平。2、抗磷酸突变株的筛选方法 43.抗反馈调节突变株选育有哪三种常用方法？（1） 回复突变引起的抗反馈调节突变株（2） 耐自身产物突变株选育（3） 抗终产物结构类似物突变株的选育44. 真正的回复突变和基因抑制突变有何不同？回复突变株*野生菌株突变型（抑制基因回复突变株）+野生型（真正的回复突变）45.代谢控制育种的常用手段有哪些？酶合成和酶活性的调节。46.什么是杂交？杂交育种主要包括哪三类方法？微生物杂交的本质是什么？杂交的意义 优点：1、使两亲株的优良性状集中于重组体内，获得新品种。2、重组体不仅可克服因长期诱变造成的生活力下降，代谢缓慢等缺陷

38、，也可以提高对诱变剂的敏感性。3、总结遗传物质的转移和传递规律，丰富并促进遗传学理论的发展。杂交育种方法1、常规杂交育种 利用有性生殖、准性生殖、接合、转化、转导、溶源转换和转染等自然过程完成。2、原生质体融合育种 酶解破除细胞壁后制备原生质体，然后诱导原生质体融合杂交，双亲本不受亲和力限制，甚至可打破种属间遗传障碍，获得远缘杂交重组体。47. 霉菌的杂交主要是通过什么途径来实现？酵母的杂交主要通过什么途径？霉菌杂交育种（一）异核体的形成和获得方法1. 选择直接亲本 选择亲和力强又携带明显营养标记和辅助标记的菌株作为杂交直接亲本。 衔接法或混合法测定亲和力。2. 异核体形成的方法（1）完全培养

39、基的混合培养法 配对菌株孢子混合接种于液体完全培养基中，长出年轻菌丝后撕碎摊布于基本培养基平板上，挑取异核体菌丝丛上的孢子。（2） 基本培养基衔接法 蘸取孢子相向划线，部分衔接。（3） 有限培养基培养法 有限培养基液体培养长出菌丝后撕碎摊布于基本培养基平板上。3. 异核体的检出在基本培养基平板上长出的菌丝丛，异核体菌丝、同核菌丝、互养菌丝混杂在一起，要进行复证。酵母菌的杂交（一）标记菌株的选择：营养缺陷型或抗性突变标记（二）酵母杂交方法 1. 子囊孢子的制备：饥饿培养获得子囊孢子，采用蜗牛酶或匀浆法破除子囊壁。 2. 杂交：哑铃状的接合子48. 微生物杂交的基本程序是怎样的？选择原始亲本诱变筛

40、选直接亲本直接亲本之间亲和力鉴定杂交分离到基本培养基或选择性培养基培养筛选重组体重组体分析鉴定 49.什么是原始亲本和直接亲本？1、原始亲本（1）具有优良性状：高产、代谢快，产孢子能力强等。（2）具有野生型遗传标记：如孢子颜色等。2、直接亲本直接用于杂交配对的菌株，由原始亲本菌株经诱变剂处理后选出。（1）性状优良（2）利于筛选的遗传标记杂交育种最好采用具有明显遗传性状差异大的近亲菌株为直接亲本。50. 什么是有限培养基？完全培养基（CM）：天然有机物基本培养基（MM）：无机化合物有限培养基（LM）：MM或蒸馏水10%20%CM补充培养基（SM）：MM特定物质发酵培养基：适合产物合成的培养基51

41、. 杂交育种常用的遗传标记有哪些？1. 营养缺陷型标记：可选单缺、双缺或多缺型，通常用双缺； 2. 抗性标记：抗逆性（耐高温、高盐和高pH等）和抗药性；3. 温度敏感性标记：许可温度下生长，非许可温度下不生长。4. 其他性状标记：孢子颜色、菌落形态结构、色素等52.细菌杂交育种主要通过哪三种途径？53.什么是致育因子？什么是F+、F-和hfr?细菌接合与F性因子接合是指两个性别不同的微生物细胞之间接触，遗传物质转移、交换、重组，形成一个新个体。细菌结合时的遗传物质为单向转移，并且要具有性别（ F性因子）。a）F-菌株(“雌性”菌株)，不含F因子，没有性菌毛，但可以通过接合作用接收F因子而变成F+菌株；b）F+菌株(“雄性”菌株)， F因子独立存在，细胞表面