莽草酸生物合成途径的调控

1、生物技术通报综述与专论BIOTECHNOLOGYBULLETIN2009年第3期莽草酸生物合成途径的调控汪华摘崔志峰（浙江工业大学生物与环境工程学院，杭州310032）要：莽草酸是合成生物碱等许多其它物质的前体。近年来，莽草酸作为临床上惟一有效的抗禽流感药物达啡的原料而倍受关注。简述了莽草酸生物合成的途径，着重从基因工程角度分析了莽草酸合成过程中的关键酶及其对莽草酸产量的影响，旨在为研究和开发微生物工程菌生产莽草酸提供参考。关键词：莽草酸生物合成途径遗传改造工程菌RegulationofShikimicAcidBiosynthesisPathwayWangHuaCuiZhifeng（Colle

2、geofBiologicalandEnvironmentalEngineering，ZhejiangUniversityofTechnology，Hangzhou310032）Abstract：Shikimicacidasprecursorforbiosynthesisofalkaloidandothercompounds，hasbeenconcernedrecentlyasthekeymaterialforthesynthesisoftamiflusthatistheonlyoneeffectiveclinicdrugagainstavianinfluenza.Inthisfunctions

3、ofkeyenzymesinthebiosynthesispathwayofshikimicacidwereanalyzed，andthebreedingofpaper，engineeringbacteriumbygeneticimprovementsforhighyieldofshikimicacidwasalsodiscussed.Keywords：ShikimicacidBiosynthesispathwayGeneticimprovementGeneticallyengineeringbacterium莽草酸（shikimicacid，SA），化学名为3，4，5-三羟基-1-环己烯-1

4、-羧酸，其结构式，如图1。它是合成许多生物碱、芳香氨基酸、吲哚衍生物与手性药物（如抗病毒药）的前体，其自身具有抗炎、镇痛作用，并可能通过影响花生四烯酸代谢，抑制血小板聚集以及凝血系统而发挥抗血栓形成的作用1。此外，莽草酸是合成目前在临床上惟一一种有效抗禽流感药物-磷酸奥斯米韦（商品名为哒啡）的合成原料2。酸含量为10以上。由于八角茴香属于木兰科东方小型树种结出的果实，分布在全球极少数地区，产量受气候等自然环境影响较大，严重限制了莽草酸的产量。化学合成莽草酸有多种途径，但产率不高，如Diels-Alder和逆Diels-Alder反应合成法的产率都只有15左右，且工艺复杂。生物合成法是利用经过改

5、造的微生物大规模发酵生产莽草酸的方法，即以经过基因修饰得到的大肠杆菌为生产菌株，以葡萄糖为原料大规模发酵合成莽草酸。大肠杆菌体内莽草酸合成途径的关键酶与莽草酸产量的高低关系密切，因此，对莽草酸合成过程中的关键酶及其调控进行深入研究，有助于提高莽草酸的产量。图1莽草酸结构式1莽草酸生物合成途径莽草酸途径是芳香族氨基酸合成过程中的一获得莽草酸的方法有多种，主要包括生物提取、化学合成和生物合成。与动物细胞不同，植物和微生物细胞普遍能合成莽草酸。木兰科植物八角茴香的果实是工业上获得莽草酸的主要来源，其莽草段共同代谢途径（图2）。葡萄糖经糖酵解和磷酸戊糖途径分别生成磷酸烯醇式丙酮酸（PEP）和赤藓糖-4

6、-磷酸（E4P），两者在3-脱氧-阿拉伯庚酮糖酸-7-磷酸（DAHP）合成酶的催化下进入莽草酸途径，收稿日期：2008-09-01作者简介：汪华（1984-），男，硕士研究生，研究方向：生物化工；E-mail：fanye000通讯作者：崔志峰（1956-），男，博士，副教授；TelE-mail：zfcui2009年第3期汪华等：莽草酸生物合成途径的调控51酸化反应，使莽草酸累积。野生型菌株有两个莽草酸激酶同工酶，包括激酶和激酶，分别由基因aroK和aroL编码，激酶是转化过程中的主要催化酶，而激酶的酶活力有限。敲除aroL基因，保留aroK基因，使微生物细胞保留微

7、弱的莽草酸激酶活性以便累积莽草酸的同时还能自身合成芳香族氨基酸和维生素等物质而无需额外添加4。此外，利用P1噬菌体作介质，使Tn10和CmR基因分别插入aroL的478位碱基对和aroK的17位碱基对，通过完全缺失莽草酸激酶活力以切断下游生化反应，使得合成的莽草酸无消耗而大量累积5。解除3-脱氧-阿拉伯庚酮糖酸-7-磷酸（DAHP）合成酶的反馈抑制是增加莽草酸产量的另一关键因素。DAHP的3个同工酶分别由aroF、aroG、aroH3-脱氧-阿拉伯庚酮糖酸-7-磷酸合成酶（3-deoxy-d-arabino-heptulosonate-7-phosphatesynthase）；脱氢奎尼酸合成酶

8、（3-de-hydroquinicacidsynthase）；脱氢奎尼酸脱水酶（3-dehydroquinicaciddehydratase）；莽草酸脱氢酶（shikimatedehydrogenase）；莽草酸激酶(shikimatekinase)；5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸合成酶（5-enolpyruvylshikimate-3-phosphatesynthase）；脱氢圭尼酸脱氢酶（dehydroquinatedehydrogenase）；脱氢莽草酸脱水酶（de-hdroshikimatedehydratase）编码，其酶活力的比值大约为25751。用3种芳香族氨基酸的类似物分别筛选

9、到对特定氨基酸反馈抑制不敏感的突变株。研究表明，当突变株DAHP合成酶aroF基因的第443位碱基由C变成T，酶的148号氨基酸残基由原来的Pro转变为Leu时，此突变株对酪氨酸反馈抑制不敏感6。将该突变基因导入菌株中，能够解除DAHP合成酶受酪氨酸反馈抑制，引导更多的底物进入莽草酸合成途径。图2莽草酸生物合成途径经过一系列酶促反应合成莽草酸，最终生成酪氨酸、色氨酸、苯丙氨酸3种芳香族氨基酸。该途径中有3个酶对莽草酸产量有重要影响：（1）3-脱氧-阿拉伯庚酮糖酸-7-磷酸合成酶，大肠杆菌中存在3种该酶的同工酶，且分别受终端产物3种氨基酸的反馈抑制，限制了底物流入该途径合成莽草酸；（2）脱氢圭尼

10、酸合成酶，该酶催化3-脱氧-阿拉伯庚酮糖酸-7-磷酸转化，当大量3-脱氧-阿拉伯庚酮糖酸-Draths等5将对酪氨酸反馈抑制不敏感的DAHP合成酶基因（aroFFBR）导入莽草酸激酶活性完全缺失的大肠杆菌细胞内，同时为了提高脱氢圭尼酸合成酶（基因aroB编码）活力及补偿莽草酸脱氢酶（基因aroE编码）活力，增加了aroB和aroE基因拷贝数，构建了莽草酸生产菌株。结果表明，以葡萄糖为原料，补料分批发酵培养42h，获得莽草酸27.2g/7-磷酸合成后，该酶不能及时将上游产物转化为3-脱氢圭尼酸而使其发生去磷酸化，降低了莽草酸的产量；（3）莽草酸脱氢酶，该酶将3-脱氢莽草酸还原为莽草酸，同时受到莽

11、草酸的反馈抑制。L；圭尼酸12.6g/L；脱氢莽草酸4.4g/L，莽草酸有明显的累积。3莽草酸合成过程中底物利用率的提高上述工程菌的应用使莽草酸合成途径得到了2莽草酸合成途径的分子生物学改造在野生型菌株中，莽草酸是芳香族氨基酸合成改良，由于底物赤藓糖-4-磷酸和磷酸烯醇式丙酮酸能够有效的转变为产物，莽草酸产量得到了大幅提升。因此，进一步提高底物的流入量有可能促进莽草酸产量达到进一步提高。途径的中间代谢物，不会在细胞内累积，为了获得大量的莽草酸，必须切断或限制下游生化反应。Marco等3敲除5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸合成酶基因，使莽草酸-3-磷酸大量累积，后者去磷酸化后就获得目标产物。敲除莽

12、草酸激酶能阻断莽草酸磷3.1过量表达tktA基因增加赤藓糖-4-磷酸的合成基因tktA编码的转酮酶对赤藓糖-4-磷酸合成量有重要影响。李永辉等7从大肠杆菌K-12株中52生物技术通报BiotechnologyBulletin2009年第3期扩增了基因tktA，该基因在工程菌中的高效表达使转铜酶的活性提高了3.9倍，DAHP的合成量提高明显。David等8通过增加tktA的拷贝数提高了转酮酶的活力，使得赤藓糖-4-磷酸合成量增加，最终进入莽草酸代谢途径的碳量增加为原来的两倍，莽草酸合成途径的总产率由20%上升到29%，副产物圭尼酸和3-脱氢莽草酸的产量分别由8.1g/L提高到19g/L和6.5g

13、/L提高到11g/L，但莽草酸的产量仅由26g/L上升为28g/L。可以看出，tktA基因的过量表达增加了底物合成量，但副产物的过多合成消耗了底物，使得莽草酸的合成量没有明显提升。60g/L，途径产物的总产率为41（mol/mol）；而PTS转运系统下，相应的产量和产率分别为49g/L和33%（mol/mol）。以半乳糖转运蛋白作为葡萄糖转运载体时，在发酵培养60h后，3-脱氢莽草酸产量为60g/L，途径产物总产率为43%（mol/mol）。可以看出，利用非磷酸烯醇式丙酮酸供能的葡萄糖转运系统，节约了大量的PEP用于莽草酸合成，目标产物和途径总产率都有明显提高，副产物合成较少，是比较理想的增产

14、方式10。4降低副产物形成的措施经过对莽草酸合成途径的一系列调控后，莽草酸的产量有了明显的提升，但同时圭尼酸等副产物3.2提高磷酸烯醇式丙酮酸的利用率磷酸烯醇式丙酮酸（PEP）是一种高能化合物，的合成量也随之增加。副产物在发酵液中的累积对后续莽草酸的分离提纯有较大影响，如圭尼酸会影响莽草酸的结晶纯化。关于副产物的形成机制有不同的观点，其一认为：当莽草酸积累到一定浓度时，分泌到细胞外的莽草酸重新转运入胞质内，逆莽草酸合成方向生成圭尼酸5，8。当培养基中的葡萄糖浓度过低时，莽草酸转运系统的效率降低，莽草酸不能及时转运到胞外，使其在胞内累积，促使反应平衡逆方向进行，生成各种副产物4。目前，基于第一种

15、观点的降低副产物措施研究得较多。在葡萄糖转运（PTS系统）过程中提供能量而转变成丙酮酸被消耗。基因ppsA是PEP合成的关键酶基因，利用IPTG诱导表达调控系统，调控表达基因ppsA，可以提高PEP的合成量。通过破坏aroE基因，切断了3-脱氢莽草酸转化为莽草酸的反应，使3-脱氢莽草酸累积，其产量可以作为考察指标。在增加基因tktA拷贝数的同时，当IPTG的浓度为12mg/L、PEP合成酶活力增加为原来的7倍时，3-脱氢莽草酸产量上升到69g/L，途径总产率为51（mol/mol），比未增加拷贝前产量增加17g/L，但副产物3-脱氧-阿拉伯庚酮糖酸，3-脱氢圭尼酸，没食子酸等也有合成；当IPT

16、G浓度为48mg/L、PEP合成酶活力增加为原来的15倍时，3-脱氢莽草酸产量为58g/L，产率为29%（molDHS/molglucose）。出现这种现象的原因可能是PEP合成酶的表达量到达了细胞生化反应产能能力的临界状态所以降低了丙酮酸的可利用率9。4.1利用代谢物抑制效应抑制圭尼酸合成当培养基中葡萄糖被消耗殆尽时，莽草酸被视为碳源而被转运回胞内利用。借助代谢物抑制效应，提高培养基中葡萄糖的浓度可以抑制莽草酸的重新被利用。当提高培养基中葡萄糖浓度、发酵培养42h后，圭尼酸合成量由原先的12.6g/L下降到1.9g/L，莽草酸与圭尼酸的摩尔比由原来的2.41提高到11.815。但是，高浓度葡

17、萄糖培养条件下容易产生副产物乙酸，使得微生物的生长受影响，从而降低产量。葡萄糖类似物甲基-D-葡萄糖苷在培养基中稳定，可以被转运至胞内且磷酸化，却不参与其他代谢，因此可以用于抑制副产物的合成8。PTS系统每转运一分子葡萄糖要消耗一分子磷酸烯醇式丙酮酸，采用葡萄糖协助蛋白和葡萄糖激酶组成的转运系统，以及半乳糖转运蛋白等非磷酸烯醇式丙酮酸供能的葡萄糖转运系统代替PTS转运系统，能够节约磷酸烯醇式丙酮酸用于莽草酸合成10。在增加基因tktA拷贝数同时，运动发酵单胞菌（Zymomonasmobills）葡萄糖协助蛋白基因glf和葡萄糖激酶基因glk被导入PTS系统缺失的大肠杆菌。发酵培养48h后，3-

18、脱氢莽草酸产量达到4.2利用shiA基因的缺失阻止莽草酸进入胞内基因shiA编码的蛋白是莽草酸转运蛋白。Knop等8构建了基因shiA缺失菌株E.coliSP1.1s-hiA/pKD12.138，该工程菌导入了基因aroFFBR，增加了基因aroB、aroE、tktA拷贝数、缺失了aroL、aroK基因。发酵培养48h后，合成莽草酸23g/L，圭尼2009年第3期汪华等：莽草酸生物合成途径的调控53酸22g/L，3-脱氢莽草酸9.6g/L；未缺失基因shiA前，莽草酸的合成量为28g/L，圭尼酸19g/L，3-脱氢莽草酸11g/L。可见，缺失基因shiA对降低圭尼酸的合成效果不明显。为了研究缺

19、失基因shiA后莽草酸是否发生逆向转运，构建了DAHP合成酶活力及基因shiA缺失的菌株E.coliSP1.1shiA/pSC-最近，Ran等13利用2-酮-3脱氧-6-磷酸半乳糖酸（KDPGal）醛缩酶催化丙酮酸和赤藓糖-4-磷酸合成3-脱氧-阿拉伯庚酮糖酸-7-磷酸。通过易错PCR、基因“洗牌”、多位点定向进化等技术对大肠杆菌中编码该酶的基因进行改造，最终使得该酶活大幅度提升。在缺失3种DAHP合成酶酶活的菌株中，只依靠改造后的醛缩酶的催化活力，使得3-脱氢莽草酸的产量从2g/L提高到13g/L14。这一合成3-脱氧-阿拉伯庚酮糖酸-7-磷酸的辅助途径也值得进一步研究。莽草酸以其自身重要的

20、药用价值以及作为合成其他药物的良好前体物质，具有广阔的市场前景，并由此带来可观的经济收益。目前，抗禽流感药物达啡产量不足主要原因之一是合成原料-莽草酸产量不足。以葡萄糖为原料，利用大肠杆菌工程菌生产莽草酸具有周期短、成本低、污染少、对环境友好、受地域环境影响小及产量稳定等优点，必将成为莽草酸生产的主流。通过对大肠杆菌工程菌莽草酸合成过程中关键酶的基因本质及其调控的深入研究，有望进一步提高莽草酸的产量。参考文献12345678910111213141516尤永真，等.中华中医药学刊，2007，25（2）：386387.SomboonT，NozomiY，etal.BiosciBiotechnolB

21、iochem，OsaoA，2003，67（10）：21242131.etal.MetabEng，2003，5：277283.MarcoK，etal.BiotechnolBioeng，2005，92（5）：541552.JohanssonL，DrathsKM，etal.JAmChemSoc，1999，121（7）：16031604.WeaverLM，etal.JBacteriol，1990，172（11）：65816584.李永辉，等.生物工程学报，2003，19（3）：301305.DrathsKM，SunilSC，etal.JAmChemSoc，2001，123KnopDR，（42）：101

22、7310182.YiJ，LiK，DrathsKM.BiotechnolProg，2002，18（6）：11411148.YiJ，etal.BiotechnolProg，2003，19（5）：14501459.ChandranSS，etal.BiotechnolProg，2003，（19）：808814.SinghSA，ChristendatD.Biochemistry，2006，45（25）：77877796.etal.JAmChemSoc，2004，126（22）：68566857.RanNQ，RanNQ，FrostJW.JAmChemSoc，2007，129（19）：61306139.etal.JBiolChem，2003，2