实验操作步骤

1、凡纳滨对虾血蓝蛋白小亚基启动子的研究 实验方案第一部分 血蓝蛋白小亚基启动子序列克隆一、 凡纳滨对虾基因组DNA提取 1、用注射器从健康凡纳滨对虾心脏处抽取20l血细胞装入提前加有20l抗凝剂无菌Ep管中。 2、室温5000rpm离心3min收集血细胞，采用基因组DNA提取试剂盒提取凡纳滨对虾血细胞基因组DNA。 3、使用微量紫外分光光度计（NANoDRoP 2000C）和琼脂糖凝胶电泳检测其浓度和纯度，-20保存备用。二、染色体步移技术扩增血蓝蛋白小亚基5'-UTR 1、根据课题组前期所得的血蓝蛋白小亚基启动子设计PCR引物，具体见表1-1。表1-1 HcS基因步移引物引物 序列 退

2、火温度Primers Sequences Tm（）HcS-SP1 TCTCGGACTCGGCCATATGCTCAAT 70.0HcS-SP2 CATACCTGCACTGGCCACCTGAAAG 68.9 HcS-SP3 ATATATACCCGAAGTGCGTGGAGTT 62.7 2、以所提基因组DNA 为模板，采用Genome Walking Kit 试剂盒扩增5'-UTR。 具体步骤如下： （1）1 st PCR，10 l 反应体系， dNTP Mixture（2.5 mM each） 4 l 10×LA PCR Buffer（Mg2+ plus） 2.5 l TaKaR

3、a LA Taq（5/l） 0.25 l 上下游引物各 0.5 l 基因组DNA 1 l(20ng/l) ddH2O 1.25 l 反应条件：94 1 min；98 1 min；94 30 s，65 1 min，72 2 min，5 个循环；94 30 s，25 3 min，72 2 min；94 30s，65 1 min，72 2min，94 30 s，65 1 min，72 2 min94 30 s，44 1 min，72 2 min，15 个循环；72 10 min；4 保存，取PCR扩增产物3l进行琼脂糖凝胶电泳分析；（2）取上述PCR产物0.5l至1l用去离子水稀释100倍用于第二轮

4、反应。 10 l 的反应体系如下 dNTP Mixture（2.5 mM each） 4 l 10×LA PCR Buffer（Mg2+ plus） 2.5 l TaKaRa LA Taq（5 U/l） 0.25 l 上下游引物各 0.5 l 第一轮 PCR 反应液 0.5 l ddH2O 1.75 l 反应条件：94 30 s，65 1 min，72 2 min，94 30 s，65 1 min，72 2 min，94 30 s，44 1 min，72 2 min，15 个循环；72 10 min；4 保存；4 保存，取扩增产物3l扩增结果进行琼脂糖凝胶电泳分析； （3）根据第二轮

5、反应，取所得产物1l用去离子水稀释100倍用于第三轮反应，10 l 的反应体系如下， dNTP Mixture（2.5 mM each） 4 l 10×LA PCR Buffer（Mg2+ plus） 2.5 l TaKaRa LA Taq（5 U/l） 0.25 l 上下游引物各 0.5 l 第二轮PCR 反应液 0.5 l dH2O 1.75l 反应条件：94 30 s，65 1 min，72 2 min，94 30 s，65 1 min，72 2 min，94 30 s，44 1 min，72 2 min，15 个循环；72 10 min；4 保存；4 保存，取扩增产物8l扩增

6、结果进行琼脂糖凝胶电泳分析。三、 选择特异性较强的片段进行克隆、测序1、PCR 产物纯化与酶连 （1）根据上述三轮PCR电泳所得电泳结果综合分析，切胶回收目的条带； （2）将目的基因连接至pMD 19-T Vector，构建重组子，-20保存备用。2、 菌液PCR验证 （1）加入酶连产物5 l，轻轻摇匀，冰浴30 min； （2）42热激90 s，冰浴2-5 min，加入700 l LB 液体培养基，37，150 rpm摇培1 h； （3）常温4500 rpm 离心5 min，留约100 l 上清，重悬沉淀； （4）加入IPTG 至终浓度为0.1 mM，X-gal至0.04 mg/ml，混匀，

7、取约100l混合液，涂布LB 平板（Amp+），37倒置培养12-16 h； （5）挑取白斑单菌落于1.5ml 的装有LB 液体培养基（Amp+）的EP管中，37 震荡培养2h至4h。3、目的片段的鉴定 （1）取所得菌液50l于新EP管中，在100沸水中煮10min后离心取上清作为模板进行菌液PCR扩增，10 l 的反应体系如下， PCR Mix 10 l； 模板 1l 引物SP3、M13各 1l 加ddH2O 至 20 l 反应条件：94 3 min；94 30s，55（退火温度根据引物而定），72 30s，25 个循环；7210 min；4 保存，取扩增产物8l扩增结果进行琼脂糖凝胶电泳分

8、析。 （2）送阳性菌落送去深圳华大基因科技有限公司测序。四、 血蓝蛋白小亚基5'-UTR鉴定 1、特异性扩增血蓝蛋白小亚基5'-UTR为进一步确定上述测序片段是否为凡纳滨对虾血蓝蛋白5'-UTR，根据测序结果设计特异性引物对凡纳滨对虾的基因组DNA进行PCR扩增，采用20 l 体系特异性扩增5'-UTR。20 l 反应体系如下： PCR Mix 10 l； 模板 1l； 引物 各1 l； 加ddH2O 至总体积为 20 l；反应条件：94 3 min；94 30s，55（退火温度根据引物而定），72 30s，25 个循环；7210 min；并用琼脂糖凝胶电泳验证结果。2、 随后对目的片段进行胶回收，并连接至pMD 19-T Vector，构建重组子，对该片段进行克隆、测序。3、根据两次的测序结果进行BLAST比对分析以确定其正确性。 4、血蓝蛋白小亚基5'-UTR所得片段生物信息学分析 将测序所得序列，运用BLAST（http:/blast