聚合酶链式反应(PCR)扩增DNA片段

1、实验六实验六聚合酶链式反应聚合酶链式反应(PCR)(PCR)扩增扩增DNADNA片段片段一、实验目的和要求一、实验目的和要求 通过本实验学习和掌握通过本实验学习和掌握PCRPCR基因基因扩增的原理和操作方法，并深刻理解扩增的原理和操作方法，并深刻理解PCRPCR基因扩增技术在基因扩增技术在DNADNA操作中的重要操作中的重要性。性。 PCRPCR用于扩增位于两段已知序列之间的用于扩增位于两段已知序列之间的DNADNA区段。每个循环包个三个步骤，即，首区段。每个循环包个三个步骤，即，首先加热到先加热到9494 -95-95使模板使模板DNADNA变性变性, ,接着将反接着将反应液冷却到某一温度应

2、液冷却到某一温度, ,使引物与它的靶序列使引物与它的靶序列发生退火发生退火, ,此后此后, ,退火引物在退火引物在DNADNA聚合酶作用聚合酶作用下得以延伸。如此反复进行变性、退火和下得以延伸。如此反复进行变性、退火和延伸这一循环。由于一轮扩增产物又充当延伸这一循环。由于一轮扩增产物又充当下一轮扩增的模板，所以每完成一个循环下一轮扩增的模板，所以每完成一个循环，就使目的，就使目的DNADNA产物增加一倍。产物增加一倍。二、实验原理二、实验原理2 2）PCR PCR 反应系统的组成反应系统的组成PCRPCR反应系统的组成主要包括：反应系统的组成主要包括：模板模板DNADNA、引物、引物、dNTP

3、dNTP、TaqTaq DNA DNA聚聚合酶、缓冲液。合酶、缓冲液。引物：引物：要扩增模板要扩增模板DNADNA，首先要设计两条引物，首先要设计两条引物, ,实际上就是两段与待扩增靶实际上就是两段与待扩增靶DNADNA序列互序列互补的寡核苷酸片段，两引物间距离决定补的寡核苷酸片段，两引物间距离决定扩增片段的长度，两引物的扩增片段的长度，两引物的55端决定端决定扩增产物的两个扩增产物的两个55末端位置。由于引末端位置。由于引物是决定物是决定PCRPCR扩增片段长度、位置和结扩增片段长度、位置和结果的关键，果的关键， 因此，引物设计也就更为因此，引物设计也就更为重要重要。引物的设计：引物的设计：

4、1.1. 长度一般最低不少于长度一般最低不少于1616个核苷酸，而最高不超过个核苷酸，而最高不超过3030个核苷酸，最佳长度为个核苷酸，最佳长度为18182121个核苷酸。有时个核苷酸。有时可在可在55端添加不与模板互补的序列，如限制性端添加不与模板互补的序列，如限制性酶切位点等，以完成基因克隆和其它特殊需要。酶切位点等，以完成基因克隆和其它特殊需要。2.2. 两个引物之间不应发生互补，特别是在引物两个引物之间不应发生互补，特别是在引物33端，即使无法避免，其端，即使无法避免，其33端互补碱基也不应大端互补碱基也不应大于于2 2个碱基，否则易生成个碱基，否则易生成“引物二聚体引物二聚体”或或“

5、引引物二倍体物二倍体”（Primer dimerPrimer dimer）。）。3.3. (G+C(G+C）% %含量含量: :引物的组成应均匀，尽量避免含有引物的组成应均匀，尽量避免含有相同的碱基多聚体。两个引物中（相同的碱基多聚体。两个引物中（G+CG+C）% %含量应含量应尽量相似。尽量相似。4.4. 引物内部应避免内部形成明显的次级结构，尤其引物内部应避免内部形成明显的次级结构，尤其是发夹结构（是发夹结构（hairpin structureshairpin structures）。）。引物在引物在PCRPCR反应中的浓度反应中的浓度一般在一般在0.10.11M1M之间。浓度过高易形成引

6、物二聚体之间。浓度过高易形成引物二聚体且产生非特异性产物。一般来说用低浓且产生非特异性产物。一般来说用低浓度引物经济、特异，但浓度过低，不足度引物经济、特异，但浓度过低，不足以完成以完成3030个循环的扩增反应，则会降低个循环的扩增反应，则会降低PCRPCR的产率。的产率。引物退火温度引物退火温度决定决定PCRPCR特异性与产量；温度高特特异性与产量；温度高特异性强，但过高则引物不能与模板牢固结合，异性强，但过高则引物不能与模板牢固结合，DNADNA扩增效率下降；温度低产量高，但过低可造扩增效率下降；温度低产量高，但过低可造成引物与模板错配，非特异性产物增加。一般成引物与模板错配，非特异性产物

7、增加。一般可根据引物的（可根据引物的（G+CG+C）% %含量进行推测，一般试含量进行推测，一般试验中退火温度验中退火温度Ta(annealing temperature)Ta(annealing temperature)比扩比扩增引物的融解温度增引物的融解温度Tm(melting temperature)Tm(melting temperature)低低55，可按公式进行计算：，可按公式进行计算：Ta = Tm - 5= 4(G+C) + 2(A+T) -5Ta = Tm - 5= 4(G+C) + 2(A+T) -5 其中其中A A，T T，G G，C C分别表示相应碱基的个数。分别表示相

8、应碱基的个数。引物延伸温度引物延伸温度的选择取决于的选择取决于DNADNA聚合酶的最适聚合酶的最适温度。一般取温度。一般取70707575，在，在7272时酶催化核时酶催化核苷酸的标准速率可达苷酸的标准速率可达3535100100个核苷酸个核苷酸/ /秒。秒。每分钟可延伸每分钟可延伸1kb1kb的长度，其速度取决于缓冲的长度，其速度取决于缓冲溶液的组成、溶液的组成、pHpH值、盐浓度与值、盐浓度与DNADNA模板的性质。模板的性质。所以根据扩增片段长度的不同来设计引物延所以根据扩增片段长度的不同来设计引物延伸的温度。对于伸的温度。对于1kb1kb以上的以上的DNADNA片段，可根据片段，可根据

9、片段长度将延伸时间控制在片段长度将延伸时间控制在1 17min7min。dNTPdNTP（dATP,dTTP,dCTP,dGTPdATP,dTTP,dCTP,dGTP）在在PCRPCR反体系中反体系中dNTPdNTP终浓度高于终浓度高于50mM50mM会抑会抑制制TaqTaq酶的活性，使用低浓度酶的活性，使用低浓度dNTPdNTP可以减可以减少在非靶位置启动和延伸时核苷酸错误掺少在非靶位置启动和延伸时核苷酸错误掺入，高浓度入，高浓度dNTPsdNTPs易产生错误掺入，而浓易产生错误掺入，而浓度太低，势必降低反应物的产量。度太低，势必降低反应物的产量。PCRPCR常常用的浓度为用的浓度为5050

10、200M200M，不能低于，不能低于101015M15M。四种。四种dNTPdNTP的浓度应相同，其中任的浓度应相同，其中任何一种浓度偏高或偏低，都会诱导聚合酶何一种浓度偏高或偏低，都会诱导聚合酶的错误掺入，降低合成速度，过早终止反的错误掺入，降低合成速度，过早终止反应。应。TaqTaq DNA DNA聚合酶聚合酶: :TaqTaq DNA DNA聚合酶最早是从嗜热水生菌中提聚合酶最早是从嗜热水生菌中提纯出来的。典型纯出来的。典型PCRPCR反应混合物中，常用反应混合物中，常用范围为范围为1 14U/100l4U/100l。由于。由于DNADNA模板的不模板的不同和引物不同，以及其它条件的差异

11、，同和引物不同，以及其它条件的差异， Taq DNA聚合酶聚合酶的用量亦有差异，酶量过多的用量亦有差异，酶量过多会导致非特异产物的增加。会导致非特异产物的增加。模板模板模板的种类模板的种类：单、双链：单、双链DNADNA或或RNARNA都可以作为都可以作为PCRPCR的样品。若起始材料是的样品。若起始材料是RNARNA，须先通过逆转录得，须先通过逆转录得到第一条到第一条cDNAcDNA对于模板的用量对于模板的用量: :基因组基因组DNADNA：50-100 ng50-100 ng 质粒质粒DNA: 5-10 ngDNA: 5-10 ng模板变性温度模板变性温度是决定是决定PCRPCR反应中双链

12、反应中双链DNADNA解链解链的温度，达不到变性温度就不会产生单链的温度，达不到变性温度就不会产生单链DNADNA模板，模板，PCRPCR也就不会启动。变性温度低则也就不会启动。变性温度低则变性不完全，变性不完全，DNADNA双链会很快复性，因而减双链会很快复性，因而减少产量。一般取少产量。一般取90909595。样品一旦到达此。样品一旦到达此温度宜迅速冷却到退火温度。温度宜迅速冷却到退火温度。DNADNA变性只需变性只需要几秒种，不需要时间过久；反之，在高温要几秒种，不需要时间过久；反之，在高温时间应尽量缩短，以保持时间应尽量缩短，以保持DNADNA聚合酶的活力，聚合酶的活力，加入加入Taq

13、Taq DNA DNA聚合酶后最高变性温度不宜超聚合酶后最高变性温度不宜超过过9595。PCRPCR缓冲液缓冲液: :用于用于PCRPCR的标准缓冲液为的标准缓冲液为101050mM50mM的的Tris Tris HClHCl缓冲液（缓冲液（pH8.3pH8.3）和）和1.5mM MgCl1.5mM MgCl2 2。在。在7272时，反应体系的时，反应体系的pHpH值将下降值将下降1 1个单位，个单位，接近于接近于7.27.2。二价阳离子的存在至关重要，。二价阳离子的存在至关重要，影响影响PCRPCR的特异性和产量。实验表明，的特异性和产量。实验表明，MgMg2+2+优于优于MnMn2+2+，

14、而，而CaCa2+2+无任何作用。无任何作用。MgMg2+2+过量易过量易生成非特异性扩增产物，生成非特异性扩增产物，MgMg2+2+不足易使产量不足易使产量降低。首次使用靶序列和引物结合时，都降低。首次使用靶序列和引物结合时，都要把要把MgMg2+2+浓度调到最佳，其浓度变化范围为浓度调到最佳，其浓度变化范围为1 110mmol/L10mmol/L。PCRPCR循环次数循环次数常规常规PCRPCR循环次数一般为循环次数一般为25254040个周期。一个周期。一般是循环次数过多，非特异性背景严重，般是循环次数过多，非特异性背景严重，复杂度增加。当然循环反应的次数太少，复杂度增加。当然循环反应的

15、次数太少，则产率偏低。所以，在保证产物得率前提则产率偏低。所以，在保证产物得率前提下，应尽量减少循环次数。下，应尽量减少循环次数。3 3）PCRPCR扩增过程扩增过程 在微量离心管中加入适量缓冲液、微量在微量离心管中加入适量缓冲液、微量模板模板DNADNA、四种脱氧单核苷酸（、四种脱氧单核苷酸（dNTPdNTP）和耐热和耐热TaqTaq聚合酶及两个合成聚合酶及两个合成DNADNA引物，引物，并有并有MgMg2+ 2+ 存在。其循环的温度取决于引存在。其循环的温度取决于引物的物的TmTm值、模板的种类以及聚合酶的耐值、模板的种类以及聚合酶的耐热性。热性。(1)(1)变性阶段变性阶段 加热使模板加

16、热使模板DNADNA在高温下在高温下（90-9590-95）变性，双链解链；）变性，双链解链；(2)(2)退火阶段退火阶段 降低溶液温度，使合成引降低溶液温度，使合成引物在低温（物在低温（353570,70,一般低于模板一般低于模板TmTm值的值的55左右），与模板左右），与模板DNADNA互补退火互补退火形成部分双链；形成部分双链；(3)(3)延伸阶段延伸阶段 溶液反应温度升至中温溶液反应温度升至中温(72)(72)，在，在 TaqTaq酶作用下，以酶作用下，以dNTPdNTP为为原料，引物为复制起点，模板原料，引物为复制起点，模板DNADNA的一的一条双链在解链和退火之后延伸为两条条双链在

17、解链和退火之后延伸为两条双链。双链。三三. 实验仪器及材料实验仪器及材料 PCR仪、台式离心机、灭菌的微量离仪、台式离心机、灭菌的微量离心管、凝胶电泳系统等心管、凝胶电泳系统等TaKaRa Taq (5U/ l)10PCR Buffer (Mg2+ Plus)dNTP Mixture (each 2.5 mM)模板模板DNA引物（引物（Forward primer and Reverse primer, 10 M)四、实验步骤四、实验步骤1、设计、设计PCR反应程序反应程序 9494预变性预变性2 min2 min后开始以下循环后开始以下循环 94 30 sec94 30 sec 49 30 sec 49 30 sec 35 cycles35 cycles 72 72 30 sec30 sec 72 5 min72 5 min； 4 4 冷却恒定。冷却恒定。2 2、在、在0.5ml0.5ml薄壁管中，依次加入以薄壁管中，依次加入以下各成分下各成分: :ddH2O: 19.875 l 10buffer: 2. 5 ldNTPs(2.5 mM) 0.5 l Forward primer (10 M) : 0.5 l Reverse primer (10 M) : 0.5 lTaq DNA polym