硝基呋喃类药物检测（高效液相色谱法）

1、兽药残留检测兽药残留检测原理原理 试样中残留的硝基呋喃类代谢物用三氯乙酸试样中残留的硝基呋喃类代谢物用三氯乙酸- -甲醇溶液提取，经衍甲醇溶液提取，经衍生、乙酸乙酯萃取、固相萃取柱净化后，用紫外检测器进行检测，外标生、乙酸乙酯萃取、固相萃取柱净化后，用紫外检测器进行检测，外标法定量。法定量。试剂和材料试剂和材料 本实验所用试剂应无干扰峰。除另有特别说明外，所用试剂均为分析纯。本实验所用试剂应无干扰峰。除另有特别说明外，所用试剂均为分析纯。试验用水应符合试验用水应符合GB/T6682GB/T6682一级水的要求。一级水的要求。1 1乙腈：色谱纯。乙腈：色谱纯。2 2乙腈：色谱纯。乙腈：色谱纯。3

2、 3乙腈溶液：乙腈溶液：30mL30mL甲醇与甲醇与70mL70mL水混合溶解。水混合溶解。4 4甲醇：色谱纯。甲醇：色谱纯。5 55%5%甲醇溶液：甲醇溶液：5mL5mL甲醇与甲醇与95mL95mL水混合溶解。水混合溶解。试剂和材料试剂和材料 6 6乙酸乙酯：色谱纯。乙酸乙酯：色谱纯。7 7异丙醇：色谱纯。异丙醇：色谱纯。8 8庚烷磺酸钠：色谱级。庚烷磺酸钠：色谱级。9 9异辛烷：色谱纯。异辛烷：色谱纯。1010冰乙酸：色谱纯。冰乙酸：色谱纯。1111酸性氧化铝：酸性氧化铝：100100目目-200-200目。目。1212硅胶硅胶C C1818键合材料：键合材料：100100目目-200-2

3、00目。目。试剂和材料试剂和材料 13吸附性离子交换树脂：吸附性离子交换树脂：100目目-200目。目。14提取剂提取剂1：酸性氧化铝、硅胶：酸性氧化铝、硅胶C18键合材料和吸附性离子树脂按键合材料和吸附性离子树脂按30:40:30比例混合。比例混合。15三氯乙酸：优级纯。三氯乙酸：优级纯。16提取剂提取剂2：三氯乙酸：三氯乙酸-甲醇溶液，称取甲醇溶液，称取55.4g三氯乙酸溶于三氯乙酸溶于500mL水中，加入水中，加入500mL甲醇混合。甲醇混合。17邻氯苯甲醛：色谱纯。邻氯苯甲醛：色谱纯。试剂和材料试剂和材料 1818 衍生化试剂：吸取衍生化试剂：吸取100L100L邻氯苯甲醛，溶解于邻氯

4、苯甲醛，溶解于5mL5mL冰乙酸和冰乙酸和20mL20mL甲醇混合甲醇混合液中。液中。1919氢氧化钠。氢氧化钠。202010 mol/L10 mol/L氢氧化钠：称取固体氢氧化钠氢氧化钠：称取固体氢氧化钠40g40g，加水溶解冷却后，定容到，加水溶解冷却后，定容到100mL100mL。21211mol/L1mol/L氢氧化钠：称取固体氢氧化钠氢氧化钠：称取固体氢氧化钠4g4g，加水溶解冷却后，定容到，加水溶解冷却后，定容到100mL100mL。2222净化柱：净化柱：C18-CNC18-CN混合柱，混合柱，200mg200mg，3mL3mL；或性能相当者。；或性能相当者。23230.05%0

5、.05%庚烷磺酸钠溶液：称取庚烷磺酸钠溶液：称取0.500g0.500g庚烷磺酸钠，加庚烷磺酸钠，加1000mL1000mL水溶解。水溶解。试剂和材料试剂和材料 23230.05%0.05%庚烷磺酸钠溶液：称取庚烷磺酸钠溶液：称取0.500g0.500g庚烷磺酸钠，加庚烷磺酸钠，加1000mL1000mL水溶解。水溶解。2424标准品：氨基脲（标准品：氨基脲（SEMSEM）、）、3-3-氨基氨基-2-2唑烷基酮（唑烷基酮（AOZAOZ）、）、5-5-甲基吗啉甲基吗啉-3-3-氨基氨基-2-2-唑烷基酮（唑烷基酮（AMOZAMOZ）、）、1-1-氨基氨基-2-2-内酰脲（内酰脲（AHDAHD），

6、纯度），纯度99%99%。2525标准贮备溶液：准确称量标准贮备溶液：准确称量AMOZAMOZ、AHDAHD、AOZAOZ、SEMSEM各各10mg10mg，用甲醇分别定容于，用甲醇分别定容于100mL100mL容量瓶中，配制成容量瓶中，配制成100g/mL100g/mL的标准贮备液。的标准贮备液。-18-18冰箱中保存，有效期冰箱中保存，有效期6 6个月。个月。2626混合标准工作溶液：使用前取混合标准工作溶液：使用前取2.252.25标准贮备溶液，用甲醇稀释成所需浓度。标准贮备溶液，用甲醇稀释成所需浓度。仪器和设备仪器和设备 1高效液相色谱仪：配紫外检测器。高效液相色谱仪：配紫外检测器。2

7、天平：感量天平：感量0.01g。3分析天平：感量分析天平：感量0.00001g。4离心机：离心机：6000r/min。5旋转蒸发仪。旋转蒸发仪。6可水浴加热超声波清洗机或恒温水浴摇床。可水浴加热超声波清洗机或恒温水浴摇床。仪器和设备仪器和设备 7 7氮吹仪。氮吹仪。8 8漩涡混合器。漩涡混合器。9 9固相萃取仪。固相萃取仪。1010匀浆机。匀浆机。色谱条件色谱条件 1 1色谱柱：色谱柱：SB-CNSB-CN柱，柱，250mm250mm4.6mm4.6mm（i.di.d. .）粒度）粒度5m5m；或性能相；或性能相当者。当者。2. 2. 流动相：乙腈流动相：乙腈+ +异丙醇异丙醇+ +乙酸乙酯乙

8、酸乙酯+ +冰乙酸冰乙酸+0.05%+0.05%庚烷磺酸钠溶液庚烷磺酸钠溶液（5+10+5+0.1+805+10+5+0.1+80）。）。3. 3. 流速：流速：1.0mL/min1.0mL/min。4. 4. 柱温：柱温：3030。5. 5. 检测波长：检测波长：280nm280nm。6. 6. 进样量：进样量：50mL50mL。测定步骤测定步骤 1 1样品处理样品处理（1 1）试样制备）试样制备 按照按照SC/T 3016SC/T 3016规定执行。规定执行。（2 2）提取）提取 准确称取已捣碎的样品准确称取已捣碎的样品10g10g（0.05g0.05g），置于），置于50mL50mL离心

9、管中，加入离心管中，加入7g7g提取剂提取剂1 1及及10mL10mL提取剂提取剂2 2，漩涡混合后于，漩涡混合后于4040摇床振摇或超声摇床振摇或超声30min30min，于于6000r/min6000r/min离心离心10min10min，取出上清液于另一，取出上清液于另一50mL50mL离心管中；再加入离心管中；再加入10mL10mL提取剂提取剂2 2，重复提取一遍，合并提取液。，重复提取一遍，合并提取液。测定步骤测定步骤 （3）衍生化）衍生化 于上述提取液中，加入衍生化试剂于上述提取液中，加入衍生化试剂0.5mL混匀后，于混匀后，于40摇床振摇或摇床振摇或超声超声60min，取出冷至室

10、温。，取出冷至室温。（4）萃取）萃取将冷却后的上清液用将冷却后的上清液用10mol/L的氢氧化钠调的氢氧化钠调pH到到7.0（0.1），加入），加入15mL乙酸乙酯萃取，乙酸乙酯萃取，4000r/min离心离心10min后，取出乙酸乙酯层于梨形后，取出乙酸乙酯层于梨形瓶中，再加入瓶中，再加入10mL乙酸乙酯，重复上述操作两次，合并乙酸乙酯层，乙酸乙酯，重复上述操作两次，合并乙酸乙酯层，于于35水浴中减压旋转蒸发至干，加入水浴中减压旋转蒸发至干，加入5%的甲醇溶液的甲醇溶液5mL溶解残渣。溶解残渣。测定步骤测定步骤 （5）净化）净化将净化柱依次用将净化柱依次用5mL甲醇、甲醇、5mL水活化后，加

11、入（水活化后，加入（4）最终溶液以）最终溶液以1mL/min-2mL/min速度过柱，待样液全部过完后加速度过柱，待样液全部过完后加5mL水淋洗，抽干，水淋洗，抽干，弃去流出液，用弃去流出液，用2mL甲醇以甲醇以1mL/min-2ml/min速度洗脱，接收全部洗脱速度洗脱，接收全部洗脱液，液，40氮气吹干。残留物用氮气吹干。残留物用1.0mL乙腈溶液及乙腈溶液及2mL异辛烷溶解，振荡异辛烷溶解，振荡混匀，混匀，6000r/min离心离心10min，取下层乙腈水层过，取下层乙腈水层过0.22m有机相微孔滤膜，有机相微孔滤膜，供高效液相仪器测定。供高效液相仪器测定。测定步骤测定步骤 （6）工作曲线

12、）工作曲线移取适量移取适量AMOZ、AHD、AOZ、SEM混合标准溶液，添加到混合标准溶液，添加到10mL提取剂提取剂2中，使其浓度分别为中，使其浓度分别为0.5ng/mL、1.0 ng/mL、5.0 ng/mL、10.0 ng/mL和和50.0 ng/mL，按（，按（3）-（5）测定步骤处理，用高效液）测定步骤处理，用高效液相色谱仪测定，绘制标准工作曲线。或采用与待测物相近浓度的标相色谱仪测定，绘制标准工作曲线。或采用与待测物相近浓度的标样进行单点测定。样进行单点测定。测定步骤测定步骤 2. 2. 色谱测定色谱测定 标准工作溶液和样液中的标准工作溶液和样液中的AMOZAMOZ、AHDAHD、AOZAOZ、SEMSEM响应值均应在线性响应值均应在线性范围之内。范围之内。（六）计算（六）计算 样品中样品中AMOZAMOZ、AHDAHD、AOZAOZ、SEMSEM的含量按下式计算，计算结果需扣的含量按下式计算，计算结果需扣除空白值，结果保除空白值，结果保留三位有效数字。留三位有效数字。 测定步骤测定步骤 式中：式中：CC样品中被测物含量，单位为微克每千克（样品中被测物含量，