实验二 微生物基因组DNA提取和鉴定

1、1实验二实验二 微生物基因组微生物基因组DNA的提取和鉴定的提取和鉴定2 学习并掌握从微生物中提取基因组学习并掌握从微生物中提取基因组DNA方方法及其原理。法及其原理。一、实验目的一、实验目的二、实验原理二、实验原理（1）微生物破碎细胞方法：溶菌酶、）微生物破碎细胞方法：溶菌酶、SDS裂解裂解。（2）破碎抽提核酸除去杂质：）破碎抽提核酸除去杂质： 首先使脱氧核糖核蛋白、核糖体、病毒的核蛋白与首先使脱氧核糖核蛋白、核糖体、病毒的核蛋白与 其它成分分离；其它成分分离； 使核酸与蛋白质分离；使核酸与蛋白质分离； 除去脂类；除去脂类； 多糖的除去。多糖的除去。 在在EDTA和和SDS等去污剂存在下，用

2、蛋白酶等去污剂存在下，用蛋白酶K消化细胞，消化细胞，随后用氯仿随后用氯仿/异戊醇抽提，可以得到微生物基因组异戊醇抽提，可以得到微生物基因组DNA。4三、仪器和试剂三、仪器和试剂1、仪器、仪器： 低速离心机、高速冷冻离心机、恒温摇床、稳压电低速离心机、高速冷冻离心机、恒温摇床、稳压电源、水平电泳槽、凝胶成像系统。源、水平电泳槽、凝胶成像系统。2、材料与试剂、材料与试剂： 过夜培养的大肠杆菌过夜培养的大肠杆菌DH5、TE缓冲液、缓冲液、100g/LSDS、2mg/mL蛋白酶蛋白酶K、5mol/L NaCl、50g/LCTAB-0.5 mol/L NaCl、氯仿、氯仿/异戊醇异戊醇=24:1（V/V

3、）、异丙醇、）、异丙醇、1TAE、琼脂糖、上样缓冲液。琼脂糖、上样缓冲液。5四、实验步骤四、实验步骤1、DNA的提取的提取（1）将）将10mL过夜培养的过夜培养的大肠杆菌大肠杆菌DH5装入装入15mL离心管中，离心管中，4000r/min离心离心15min，弃上清。，弃上清。（2）加入）加入560L TE缓冲液缓冲液，将菌体重悬后转移至，将菌体重悬后转移至1.5mL离离心管中。心管中。（3）加入）加入30L 100g/LSDS溶液溶液和和30L 2mg/mL蛋白酶蛋白酶K溶溶液液，混匀后，混匀后，37水浴放置水浴放置30min。（4）加入）加入100L 5mol/LNaCl溶液溶液，充分混匀。

4、，充分混匀。（5）加入）加入80L 50g/LCTAB-0.5mol/LNaCl溶液溶液，混匀后，混匀后，65水浴放置水浴放置10min。6四、实验步骤四、实验步骤1、DNA的提取的提取（6）加入）加入600L 氯仿氯仿/异戊醇异戊醇，上下颠倒混匀后，上下颠倒混匀后，12000r/min离心离心5min，将上清吸入新离心管中。，将上清吸入新离心管中。（7）加入预冷的）加入预冷的异丙醇异丙醇，上下颠倒混匀后，上下颠倒混匀后，-20沉淀沉淀30min。（8）12000r/min离心离心10min，弃上清，弃上清。（9）加入）加入1mL 75%乙醇溶液乙醇溶液，充分混匀。，充分混匀。（10）1200

5、0r/min离心离心10min，弃上清。，弃上清。（11）加入）加入20L TE缓冲液缓冲液，混匀后，即为，混匀后，即为DNA溶液。溶液。7四、实验步骤四、实验步骤2、DNA电泳检测电泳检测（1）1%琼脂糖凝胶：称取琼脂糖凝胶：称取0.2g琼脂糖，加入琼脂糖，加入20mL 1TAE缓冲液，在微波炉中加热，反复加热、振荡缓冲液，在微波炉中加热，反复加热、振荡2-3次，使琼次，使琼脂糖充分融化。待凝胶冷却至脂糖充分融化。待凝胶冷却至60左右，倒入插入梳子的左右，倒入插入梳子的凝胶板中（避免产生气泡），让凝胶自然凝固。凝胶板中（避免产生气泡），让凝胶自然凝固。（2）待凝胶凝固后，小心拔出梳子，避免前

6、后左右摇晃，）待凝胶凝固后，小心拔出梳子，避免前后左右摇晃，以免破坏胶面及加样孔，小心将凝胶和胶床放入电泳槽中，以免破坏胶面及加样孔，小心将凝胶和胶床放入电泳槽中，加样孔靠近阴极的一端。加样孔靠近阴极的一端。8四、实验步骤四、实验步骤2、DNA电泳检测电泳检测（3）上样电泳：将）上样电泳：将20LDNA样品溶液和样品溶液和5L上样缓冲液混上样缓冲液混匀后，上样，匀后，上样，100V稳压电泳检查，根据指示剂迁移的位置，稳压电泳检查，根据指示剂迁移的位置，判断是否中止电泳。切断电源后，再取出凝胶。判断是否中止电泳。切断电源后，再取出凝胶。（4）照胶、拍照：将凝胶泡在）照胶、拍照：将凝胶泡在EB溶液（溶液（注意：注意：EB溶液为剧溶液为剧毒物，需带上一次性手套拿取凝胶毒物，需带上一次性手套拿取凝胶）中）中10min左右，进入暗左右，进