树突细胞联合IL2对肝癌治疗作用的研究

1、编号 赣州市指导性科技计划任务（合同）书计划类属：指导性科技计划 项目名称：社会发展类 课题名称：树突细胞联合IL-2对肝癌治疗作用的研究管理部门：赣州市科技局 承担单位：赣南医学院第一附属医院 （盖章）邮政编码： 341000 电话号码： 通讯地址：赣州市章贡区青年路23号 赣州市科学技术局二O一一年七月简 表科技项目（课题）名 称树突细胞联合IL-2对肝癌治疗作用的研究研究领域生物与医药国民经济行业卫生课题代码关 键 词树突状细胞；IL-2；肝癌起止年月申请金额负责人姓 名钟秋明性别男出生年月76年09月技术职务主管药师单位赣南医学院第一附属医院专 业药学特长临床药学课情题组况总 人 数高

2、 级中 级初 级研 究 生辅助人员623110承担单位数1协作单位数0协作人员数0主要研究内容和意义摘要许多肿瘤细胞为弱免疫原性，呈现MHC分子与共刺激分子的表达低下或缺如，使肿瘤抗原不能得到有效提呈，不能激活体内特异性的杀伤机制，诱导机体有效的抗肿瘤免疫应答。肿瘤细胞经福尔马林固定后其抗原性和免疫原性得以保留，致癌性大为减弱，与树突细胞（dendritic cell，DC）共孵育后可有效提呈抗原。IL-2是体内功能最强的淋巴细胞增殖因子，它被认为是最有效的具有抗肿瘤作用的细胞因子。两者联合可激发体内抗肿瘤免疫反应，抑制肿瘤生长。本研究通过建立小鼠H22细胞皮下移植瘤模型, 应用IL-2和DC

3、对其进行免疫治疗，以观察其联合作用时的抗肿瘤效应。此项研究对肿瘤治疗，有极大的经济效益和社会效益。预期成果水平和表达形式预期成果水平：预期结果：B组试验动物肿瘤生长速度最慢，生存期最长，抑瘤率明显。体外试验表明致敏DC联合IL-2组与其他组相比，具有更强的激发T细胞增殖能力，且B组的CTL表现出很强的杀伤自体肝癌细胞的细胞毒活性。在动物整体水平阐明DC细胞联合IL-2对肝癌的治疗作用。表达形式： 发表核心期刊论文1-2篇，培养1名科技骨干。 你单位申请的 项目（课题）已列入赣州市科技局 年指导性科技计划，项目（课题）应在二O 年 月前完成。请你们按计划要求组织实施。项目（课题）完成后按计划任务

4、（合同）书的指标进行鉴定，验收。赣州市科学技术局 年 月 日 一、项目（课题）的科学价值及成果水平，表达形式： 许多肿瘤细胞为弱免疫原性，呈现MHC分子与共刺激分子的表达低下或缺如，使肿瘤抗原不能得到有效提呈，不能激活体内特异性的杀伤机制，诱导机体有效的抗肿瘤免疫应答。肿瘤细胞经福尔马林固定后其抗原性和免疫原性得以保留，致癌性大为减弱，与树突细胞（dendritic cell，DC）共孵育后可有效提呈抗原。IL-2是体内功能最强的淋巴细胞增殖因子，它被认为是最有效的具有抗肿瘤作用的细胞因子。两者联合可激发体内抗肿瘤免疫反应，抑制肿瘤生长。本研究通过建立小鼠H22细胞皮下移植瘤模型, 应用IL-

5、2和DC对其进行免疫治疗，以观察其联合作用时的抗肿瘤效应。此项研究对肿瘤治疗，有极大的经济效益和社会效益。通过本试验研究，预计B组试验动物肿瘤生长速度最慢，生存期最长，抑瘤率明显。体外试验表明致敏DC联合IL-2组与其他组相比，具有更强的激发T细胞增殖能力，且B组的CTL表现出很强的杀伤自体肝癌细胞的细胞毒活性。在2年的研究周期中，在动物整体水平阐明DC细胞联合IL-2对肝癌的治疗作用。在国内发表核心期刊论文1-2篇，培养1名科技骨干。二、项目（课题）计划进度：起 止 年 月计 划 要 求2012年1月-2012年6月：1）订购试验用的细胞株、药品、试剂和小鼠。2）分离DC并制备肿瘤抗原冲击致

6、敏的DC。2012年7月-2012年12月：1)建立小鼠肝癌皮下移植瘤模型。2)对实验动物进行治疗，绘制肿瘤生长曲线及抑瘤率。2013年1月-2013年6月：进行体外试验，验证相关试验数据。2013年7月-2013年12月：全部试验数据的统计分析，撰写论文。三、项目（课题）主要经济技术指标、社会效益：（一）经济指标：（二）技术指标：(1) DC的体外培养：将环磷酰胺按200mg/kg体质量由小鼠尾静脉注射，8d后颈椎脱位处死小鼠，750ml/L乙醇浸泡10min，无菌条件下用镊子取出脾脏移入放在平皿的100目钼钢网上，剔除脾周围的结缔组织，剪碎研磨后收集滤过的细胞悬液，离心800r/min，7

7、min，加Tris-NH4Cl3ml，溶除红细胞，获取细胞悬液，以完全培养基悬浮为1×109/L细胞，37，50mL/LCO2孵箱培养。3d后，吸弃全部培养基及悬浮细胞，加GM-CSF和IFN-条件培养基，3d后半量换液并补加等量的条件培养基，第7天吹打下疏松贴壁的增殖性细胞聚集体，次日收集悬浮细胞即为富集的DC。(2) 肿瘤抗原的制备：取对数生长期的H22细胞以福尔马林固定2小时，并分别用70%酒精和磷酸盐缓冲液(phosphate buffered saline，PBS)洗涤离心两次，转速为1000转/分弃上清，沉淀用RPMI1640重悬后，放置于细胞培养箱内以除去残余的福尔马林

8、，以免干扰试验结果。48h后离心，弃上清，沉淀用PBS重悬并调整细胞浓度至106/mL，储存于无菌EP管内备用。(3) 制备肿瘤抗原冲击致敏的DC：在DC培养的第7天加入按上述方法制备的肿瘤抗原，两者共孵育24小时后收集DC，即为肝癌抗原冲击致敏的DC。(4) 荷瘤小鼠治疗方案：H22荷瘤小鼠模型构建成功后，对瘤体进行注射试验，观察肿瘤生长的影响。试验分4组每组10只小鼠。A：生理盐水组；B：致敏DCIL-2联合治疗组；C：DC组；D：IL-2组，各组试验动物一周注射2两次，共注射四次，隔日用游标卡尺测量肿瘤直径，至试验结束。(5) 体内体外抗肿瘤作用的检测：绘制荷瘤小鼠皮下瘤生长曲线。两周后

9、处死动物，称瘤重，绘制肿瘤生长曲线，按公式：抑瘤率1（治疗组开始平均瘤体积治疗组结束平均瘤体积）对照组开始平均瘤体积×100计算结果。体外检测抗原致敏DC刺激自体T细胞增殖的能力，DC刺激自体T细胞增殖分化为CTL的能力。技术线路表（三）社会效益：目前肿瘤疫苗种类多样，基本点还是建立在增强疫苗原性，最大限度地提高机体主动免疫功能，从而达到杀伤肿瘤细胞目的。以DC为基础的肿瘤疫苗能激活免疫系统产生主动免疫，可以预见肝癌疫苗在不远的将来能成为肝癌治疗的重要手段之一。四、项目（课题）的承担单位、协作单位及主要研究人员：承担单位：赣南医学院第一附属医院协作单位： 无项目（课题）负责人：姓 名

10、性别年龄技术职务业务专业为本课题工作时间（%）在课题中分担的任务所在单位钟秋明男35岁主管药师药学40课题负责人赣南医学院第一附属医院主要研究人员：刘瑶女30主治医师临床医学30动物试验赣南医学院第一附属医院曾小斌女35主管护士护理8数据记录整理赣南医学院第一附属医院钟星明男45副主任药师药学8试验药品准备赣南医学院第一附属医院王祥才男43副主任医师临床医学8试验仪器、动物准备赣南医学院第一附属医院吴先群男29助教高教6资料收集整理赣南医学院第一附属医院各单位分工：五、共同条款：1、在计划项目（课题）实施期间。承担单位（乙方）须每半年向赣州市科技局（甲方）提交项目（课题）进展情况报告，填报科技计划统计报表。2、在计划项目（课题）实施过程中，如需修改本计划任务（合同）书中某项内容，乙方须先提出书面报告，由甲乙双方共同商定，并由甲乙方通知课题承担单位主管部门（丙方）。3、项目（课题）完成后，乙方须按本计划任务（合同）书规定的内容将项目（课题）实施的总报告、完整的技术资料于鉴定前一个月报送甲方有关业务科审查。4、课题鉴定按科技部科技成果鉴定办