基因工程技术生产重组蛋白ppt课件

1、从基因到蛋白的复制、转录和翻译过程从基因到蛋白的复制、转录和翻译过程功能蛋白功能蛋白组装组装什么是基因工程什么是基因工程 基因工程基因工程(Genetic Engineering)原称遗传工原称遗传工程。是指在分子程度上将一种或多种生物体程。是指在分子程度上将一种或多种生物体(供体供体)的的DNA片断目的基因与载体片断目的基因与载体DNA分子如质分子如质粒、病毒等在体外进展拼接重组粒、病毒等在体外进展拼接重组,产生新的自然界产生新的自然界从未有过的重组从未有过的重组DNA分子，然后转入另一种生物体分子，然后转入另一种生物体(受体受体)内，使之按照人们的志愿遗传并表达出新的内，使之按照人们的志愿

2、遗传并表达出新的性状的技术。基因工程有时也称为重组性状的技术。基因工程有时也称为重组DNA技术技术(DNA Recombination)或分子克隆技术或分子克隆技术(Molecular Cloning)。什么是重组蛋白什么是重组蛋白 重组蛋白是指将一种或多种生物体供体的重组蛋白是指将一种或多种生物体供体的基因导入另一种生物体受体内，使之按照人们基因导入另一种生物体受体内，使之按照人们的志愿遗传并表达出的蛋白质产物。的志愿遗传并表达出的蛋白质产物。n运用基因工程技术构建重组细胞并经过重组细胞培运用基因工程技术构建重组细胞并经过重组细胞培育，令其超量合成其它生物体内含量极微但却具有育，令其超量合成

3、其它生物体内含量极微但却具有极高经济价值重组蛋白是现代生物技术中最活泼的极高经济价值重组蛋白是现代生物技术中最活泼的研讨方向之一，广泛运用于消费药用蛋白质及代谢研讨方向之一，广泛运用于消费药用蛋白质及代谢工程等领域。工程等领域。n曾经投放市场并正在研制开发的重组蛋白药物几乎曾经投放市场并正在研制开发的重组蛋白药物几乎触及到医药的各个领域，包括各种抗病毒剂、抗癌触及到医药的各个领域，包括各种抗病毒剂、抗癌因子、抗因子、抗AIDS药物、新型抗生素、重组疫苗、重组药物、新型抗生素、重组疫苗、重组生长激素、重组干扰素、重组抗体、免疫辅助剂、生长激素、重组干扰素、重组抗体、免疫辅助剂、抗衰老保健品、心脑

4、血管防护急救药、生长因子以抗衰老保健品、心脑血管防护急救药、生长因子以及诊断试剂等。及诊断试剂等。 重组蛋白的消费包括重组蛋白的消费包括 上游技术和下游技上游技术和下游技术两大组成部分。上游技术指的是外源基因术两大组成部分。上游技术指的是外源基因重组、克隆和表达载体以及基因工程菌细重组、克隆和表达载体以及基因工程菌细胞的设计与构建；而下游技术那么涉及到胞的设计与构建；而下游技术那么涉及到含有重组外源基因的生物细胞基因工程菌含有重组外源基因的生物细胞基因工程菌或细胞的大规模培育以及外源基因表达的或细胞的大规模培育以及外源基因表达的重组蛋白的分别纯化过程。重组蛋白的分别纯化过程。 重组蛋白的整个过

5、程由工程菌重组蛋白的整个过程由工程菌(细胞细胞)的设计构建上游技的设计构建上游技术和基因产物重组蛋白的消费下游技术两大部分术和基因产物重组蛋白的消费下游技术两大部分组成，前者的单元操作过程如下组成，前者的单元操作过程如下: (1) 从供体细胞中分别出基因组从供体细胞中分别出基因组DNA，用限制性核酸内切酶分，用限制性核酸内切酶分别将外源别将外源DNA(包括外源基因或目的基因包括外源基因或目的基因)和载体分子切开和载体分子切开(简简称切称切); (2) 用用DNA衔接酶将含有外源基因的衔接酶将含有外源基因的DNA片段接到载体分子片段接到载体分子上，构成上，构成DNA重组分子重组分子(简称接简称接

6、); (3) 借助于细胞转化手段将借助于细胞转化手段将DNA重组分子导入受体细胞中重组分子导入受体细胞中(简简称转称转); (4) 短时间培育转化细胞，以扩增短时间培育转化细胞，以扩增DNA重组分子或使其整合到重组分子或使其整合到受体细胞的基因组中受体细胞的基因组中(简称增简称增); (5) 挑选和鉴定转化细胞，获得使外源基因高效稳定表达的挑选和鉴定转化细胞，获得使外源基因高效稳定表达的基因工程菌或细胞基因工程菌或细胞(简称检简称检)。 由此可见，基因工程的上游操作过程可简化为由此可见，基因工程的上游操作过程可简化为:切、接、转切、接、转、增、检。、增、检。nThe DNA containin

7、g the gene must be isolated away from its genomic contextnThat should be simple but there are big problemsGene of interestCloning can supply large quantities of recombinant DNASingle bacterium transformed with single copy of plasmid which is subsequently replicatedGrowth to a colonyProvides several

8、mg of recombinant DNAProvides several mg of recombinant DNAInoculate into liquid broth重组蛋白表达的典型穿越载体。重组蛋白表达的典型穿越载体。MCS = 多克隆位点；多克隆位点；Op = 细菌复制起始位点；细菌复制起始位点； Mp = 细菌中的选择性基因；细菌中的选择性基因；ME = 真核生物中的选择性基因；真核生物中的选择性基因； OE = 真核复制起始位点；真核复制起始位点；PE = 真核启动子；真核启动子；TE = 真核中止子；真核中止子；hG = 表达的外源基因。表达的外源基因。重组蛋白的表达系统重组

9、蛋白的表达系统 所谓重组蛋白的表达系统，是指消费重组蛋白所谓重组蛋白的表达系统，是指消费重组蛋白的基因工程宿主菌或宿主细胞。的基因工程宿主菌或宿主细胞。 目前常用的表达系统宿主要有原核的细菌主目前常用的表达系统宿主要有原核的细菌主要是大肠杆菌，要是大肠杆菌，E. Coli.和真核的酵母菌、昆虫细和真核的酵母菌、昆虫细胞、动物细胞系以及近年开展起来的盘基网柄菌系胞、动物细胞系以及近年开展起来的盘基网柄菌系统。统。1、原核生物表达系统细菌 (E. coli.)2、真核生物表达系统酵母菌(Yeast)3、动物细胞4、昆虫细胞4、新型真核表达系统盘基网柄菌 盘基网柄菌盘基网柄菌(Dictyosteli

10、um discoideum)属于真属于真菌界的粘菌亚界的聚粘霉纲菌界的粘菌亚界的聚粘霉纲(Acrasiomzcetes)。1869年真菌学家年真菌学家Oskar Brefeld初次描画了盘基网柄初次描画了盘基网柄菌。盘基网柄菌属菌。盘基网柄菌属D. discoideum由由Raper 1935年年发现。在自然界中发现。在自然界中D. discoideum 经过吞噬土壤外经过吞噬土壤外表的细菌摄取营养和繁衍。表的细菌摄取营养和繁衍。生长阶段生长阶段 (growth phase)重组基因工程菌的高密度培育重组基因工程菌的高密度培育n培育基组成的优化培育基组成的优化n 流加流加n固定化固定化n罐流床

11、罐流床n微过滤微过滤 下下 游游培育基组成的优化培育基组成的优化碳源种类的选择碳源种类的选择下游：培育基组成的优化下游：培育基组成的优化2L发酵罐中流加培育盘基网柄菌消费发酵罐中流加培育盘基网柄菌消费hFasL基因工程菌的固定化培育基因工程菌的固定化培育n将基因工程菌固定在多孔载体上，可提高菌体将基因工程菌固定在多孔载体上，可提高菌体密度，实现延续发酵，为利用其消费异源蛋白密度，实现延续发酵，为利用其消费异源蛋白提供了有效途径。提供了有效途径。n多孔载体：多孔陶瓷、浮石、片状硅胶泡沫和多孔载体：多孔陶瓷、浮石、片状硅胶泡沫和柱状硅胶泡沫等。柱状硅胶泡沫等。固定化培育基因工程菌细胞固定化培育基因

12、工程菌细胞载体外表和内部的细胞固定化电镜扫描照片载体外表和内部的细胞固定化电镜扫描照片多孔陶瓷多孔陶瓷浮石浮石生物微胶囊固定化生物微胶囊固定化经过一层半透膜围成的微囊将细胞包埋，使目的蛋白细胞留在微囊经过一层半透膜围成的微囊将细胞包埋，使目的蛋白细胞留在微囊中，而培育基营养成分和细胞分泌的小分子物质可以自在出入。中，而培育基营养成分和细胞分泌的小分子物质可以自在出入。羧甲基纤维素钠海藻酸钙羧甲基纤维素钠海藻酸钙 CMCALG体系体系罐流床反响器延续培育固定化细胞罐流床反响器延续培育固定化细胞NoImageair inair humidifierair outproductreservoirtr

13、icklebedrecirculationpumpfeedreservoir利用微过滤实现工程菌高密度培育利用微过滤实现工程菌高密度培育airreactormediumfiltrateCross-flow-Filter 采用新型陶瓷等微过滤模块采用新型陶瓷等微过滤模块, ,使之使之既能截流细胞既能截流细胞, ,又能分别限制细胞又能分别限制细胞密度的自分泌因子等抑制物密度的自分泌因子等抑制物, ,从而从而提高细胞密度及目的蛋白的产量提高细胞密度及目的蛋白的产量重组蛋白的分别纯化下游技术n预处置及固液分别技术n 细胞破碎n 重组蛋白的包涵体处置技术n 离心n 膜分别技术n 双水相萃取n 反胶束提取纯化技术n 超临界萃取技术n吸附色谱分别技术吸附色谱分别技术n 活性炭活性炭n 氧化铝氧化铝n 硅胶硅胶n 滑石粉滑石粉n 硅藻土硅藻土n 大网格聚合物吸附大网格聚合物吸附n固相析出分别法固相析出分别法n 盐析法盐析法n 有机溶剂沉淀法有机溶剂沉淀法n 等电点沉淀等电点沉淀n 其它沉淀法其它沉淀法n 水溶性非离子型聚合物沉淀剂水溶性非离子型聚合物沉淀剂n 金属离子和络合物沉淀金属离子和络合物沉淀n 离子型多聚物沉淀剂离子型多聚物沉淀剂n