HPLC_ICP_MS在食品中硒_和砷形态分析及其生物有效性研究中的应用

1、收稿:2006年7月,收修改稿:2006年9月*浙江省留学回国基金项目(浙留基字20052号资助*通讯联系人 e -mail:yingzhouHPLC -ICP -MS 在食品中硒和砷形态分析及其生物有效性研究中的应用*周 瑛*叶 丽 竹鑫平(浙江工业大学化学工程与材料学院 杭州310014摘 要 食品中含有与人体健康密切相关的多种微量元素,微量元素的毒性和生物有效性取决于它们的化学形态。食品中的微量元素形态分析及其生物有效性研究对食品安全控制与营养评价具有至关重要的意义。本文扼要介绍了高效液相色谱与电感耦合等离子质谱(HPLC -ICP -MS联用情况。该技术以不同的色谱分离柱完成各种分析物

2、的分离,具有高灵敏度、高选择性、线性范围宽、检测限低、多元素同时检测等特点,在微量元素形态分析中占有重要的地位。综述了HPLC -ICP -MS 在食品微量元素形态分析及其生物有效性研究中的应用,重点介绍了富硒酵母、蒜类植物、富硒营养保健品等食品中硒形态和海产品、农产品等食品中砷形态的研究,以及其它多种微量元素的形态分析和这些微量元素在生物体内的代谢。关键词 形态分析 生物有效性 联用技术 高效液相色谱 电感耦合等离子质谱 硒 砷中图分类号:O657;O613.52;O613.63 文献标识码:A 文章编号:1005-281X(200706-0982-14Speciation and Bioa

3、vailability of Selenium and Arsenicin Foods by HPLC -IC P -MSZhou Y ing*Ye Li Zhu Xinping(Colle ge of Che mical Engineering and Materials Science,Zhejiang University of Technology,Hangzhou 310014,ChinaAbstract There are many kinds of micronutrient elements contained in foods that are vital to human

4、health.The strong dependence of the toxicity and bioavailability of microelement upon their chemical forms has made the speciationand bioavailability vital to the food quality control and nutrition evaluation.A brief introduction to the high performance liquid chromatography hyphenated with inductiv

5、e coupled plasma mass spectrometry (HPLC -ICP -MSis given.The hyphenated technique which based on several chromatographic separation mechanisms plays an important role in speciation analysis for its advantage of high sensitivity,high selectivity,wide linearity,lo w detection and mult-i microelement

6、deter mination simultaneously.The application of HPLC -ICP -MS in microelements speciation analysis and bioavailability research in foods concerning the selenium speciation analysis in selenized yeast,selenium -enriched garlic,selenium nutritional supplement and other foods,the arsenic specia tion a

7、nalysis in sea -products and far m products,the other microelements speciation analysis and the investigation of metabolic and bioactivity of microelement in organism is reviewed in this paper.Key words speciation;bioavailability;hyphena ted technique;high performance liquid chromatography(HPLC;indu

8、ctive coupled plasma mass spectrometry;selenium;arsenic第19卷第6期2007年6月化 学 进 展PROGRESS I N C HE MISTRYVol.19No.6 June,2007近年来,食品安全和功能食品已成为全球关注的议题。食品安全不仅仅指通常意义上的农药残留等食品污染问题,还存在着微量元素的有害浓度阈值和有害元素形态对人体健康的危害。食品中微量元素安全问题存在的重要现象是:一方面一旦有毒微量元素通过各种途径进入食物链中,食品中的有害元素总量及其不同形态就有可能导致严重的食品安全问题;另一方面人体不能摄取或吸收足够量的必需或有益的

9、微量元素而导致微营养失调,出现一些新陈代谢和病理、生理紊乱。可以通过在日常食品中添加一定量微量元素和提高微营养的生物有效性来达到增强体质或预防某些疾病的目的,发展含有某种微量元素的功能食品近年来得到越来越多的关注和研究。因此食品中的微量元素形态分析及其生物有效性研究对食品安全控制与营养评价和维持人体的健康有至关重要的意义,已是目前国际上分析化学领域的一个重要研究热点之一。依据国际纯粹化学和应用化学联合会(I UPAC定义:元素的形态是某种无机元素各种形态(原子或分子形态变化过程的证据1;形态分析是样品中元素的一个或多个化学形态的定性和定量分析活动2。元素的形态主要有两类:非金属有机化合物和金属

10、配位络合物3。Szpunar等4,5在有关生物无机元素形态分析的综述文章中将生物物质中的金属(非金属形态分为6类:(1具有/真0金属(非金属碳键的生物合成分子;(2与生物合成大环螯合剂的络合物;(3核碱、寡及多核苷酸和核苷的络合物;(4与氨基酸、寡肽及多肽(蛋白的络合物;(5与其它生物大分子(多糖、糖蛋白的络合物;(6金属药物。1食品中微量元素形态分析的必要性微量元素与人体的健康密切相关。存在于生物体中的元素可以分为4类6:(1必需元素,按其在体内的含量不同,又分为常量元素和微量元素;(2可能有益或辅助元素;(3沾染元素;(4有毒元素。目前,比较明确的人体必需的微量元素有14种,它们是:铁、锌

11、、铜、锰、铬、钼、钴、硒、钒、镍、锡、氟、碘和锶6。食品中含有多种必需微量元素,例如硒可以通过日常食物如蔬菜、谷物和海产品中摄取得到,蘑菇、咖喱和坚果等也是富含硒元素的食品7。这些金属离子和微量元素等生物无机化学成分通过食物链进入人体,不仅是生物体的重要组分,参与酶和蛋白质的合成、构象、分泌、转运、磷酸化和细胞调节,而且在基因的转录、表达、调控和分子识别中亦具有重要意义,在生命科学中占有十分重要的地位8。它们的过量或不足,都会影响人体的发育、衰老、疾病甚至死亡2,9。随着工业的快速发展,工业废水、固体废弃物的排放量和化肥等化学合成品的使用量不断增加,食品中的砷、汞、铅、铬、镉、钛、镍(镍具有两

12、重性,既是必需微量元素,也是有害微量元素等污染元素含量越来越高。这些有害金属具有致畸和致癌等毒害作用,例如三价砷和五价砷在遗传上有致基因突变的作用,砷和皮肤癌、肺癌和癌前期的表皮角化症等疾病相关6。因此食品中的污染元素对人类健康的影响受到了广泛的关注。与人体健康相关的这些必需或有害微量元素的生物活性及毒性不仅与该元素的总量、特定的浓度范围有关,更主要依赖于该元素的赋存形态:同种元素的不同化学形态,其生物活性和毒性相差甚远,从而导致不同的环境毒害、生物效应并对人体健康有不同的影响2。例如,Cr(Ö的毒性比Cr(Ó高100倍,且前者有明显的致癌作用;砷甜菜碱的毒性小于甲基胂和无

13、机砷;烷基锡的毒性随烷基链增长而减小10。元素的化学形态决定其在胃肠道的吸收和体内运动的方式,形态分析可用于预测和解释元素的代谢过程11。所以食品中微量元素的形态分析显得尤其重要,仅仅靠检测微量元素的总含量已无法满足不断发展的生物化学、毒理学和营养学等领域的科学研究需要,需进一步提供微量元素形态鉴定和定量资料12。2HPLC-ICP-MS用于微量元素形态分析研究进展用于形态分析的方法有很多种,如电分析法、光谱法、质谱法、中子P分子活化分析和色谱法等。这些分析方法简单经济,但选择性差,干扰因素多11。自Hirschfeld13首次提出联用技术以来,各种仪器联用方法迅速发展和应用,常常是将高选择性

14、的分离技术与高灵敏的检测技术结合在一起,与单一的检测技术相比,在灵敏度、准确度和分析速度等方面都有很大的改善,在形态分析中发挥了重要的作用14。食品或其他生物基体中微量元素的形态分析采用的联用技术主要利用色谱技术和特殊的检测器联用,如原子吸收光谱(AAS、原子发射光谱(AES、原子荧光光谱(AFS、等离子体发射光谱(ICP-AE S、电#983#第6期周瑛等HPLC-ICP-MS在食品中硒和砷形态分析及其生物有效性研究中的应用感耦合等离子体质谱(ICP -MS和电喷雾质谱(ESI -MS等2,4,5,1517。这些联用方法将色谱技术用于形态分析的样品前处理,使分析灵敏度、准确度和速度都有了实质

15、性的改变。Szpunar 4总结了各种联用方法在生物无机形态分析中的应用。其中在各种原子光谱检测法中,常用的有IC P -AES 和IC P -MS,具有元素特效性、动态范围宽、多元素检测、溶液连续进样和易于实现不同元素不同形态的检测等优点3。而IC P -MS 的检出限要比ICP -AES 低3个数量级左右,是元素形态分析中最常用和最有效的检测技术。各种色谱技术中,气相色谱(GC只适用于易挥发或中等挥发的有机金属化合物的分离,而且分离之前的衍生化步骤不仅使分离P 分析过程复杂化,而且增加了待测形态丢失或玷污的可能性。毛细管电泳(CE分离效率高,操作条件温和,但是在分离过程中,样品中分析物的原

16、始形态可能由于电解质或pH 的调节而发生变化,样品的组成也是影响CE 分离的一个重要因素,并且CE 与ICP -MS 的接口问题远没有HPLC 成熟。相比之下,液相色谱(HPLC在形态分析的应用更为广泛。用于元素形态分析的HPLC 分离技术有:离子色谱(IC、排阻色谱(SEC、离子交换色谱(IEC、手性色谱(CLC和反相色谱等(RPLC。手性色谱(C LC往往用于手性药物中对映体的拆分,在生命科学和药物化学的研究中具有十分重要的意义。许多食品或其他生物样品中微量元素存在的各种化学形态是具有手性对映体的化合物,如硒化合物硒代蛋氨酸(Se Met和硒代乙硫氨基酪酸(SeEt等。对这些具有手性结构的

17、化学形态,生物有机体具有很强的对映体选择性。例如Se Met 在人体内的摄入与代谢,不同的对映体在人体内的生物活性和毒性都不一样,只有L -形式的SeMet 可以被人体利用,而D -型或外消旋型的Se Met 却对人体有害19。因此采用手性液相色谱拆分这类微量元素形态的对映体,是微量元素形态和生物有效性研究中一个不可缺少的组成部分。目前已有诸多采用手性色谱和其他检测器联用测定硒氨基酸和其他食品样品中D,L -Se Met,D,L -SeEt 以及D,L -(SeCys2的研究报道,特别是Caruso 等1921及其研究组在该领域做出了较大的贡献。排阻色谱(SEC是按照分子量的大小不同分离被分析

18、物的一种分离技术,通常与特殊的原子检测器联用(如ICP -MS 、ESI -MS 等用于复杂基体中微量元素形态分析的方法。SEC 与其他的色谱分离技术相比,虽然分离的效率较低,但是SEC -ICP -MS 的主要优点在于它操作简单,流动相可以调节到最适应元素形态的酸度和离子强度,分离物与凝胶之间的干扰小。SEC 通常作为测定金属蛋白或与生物分子结合金属形态分离的第一步,在复杂基体中微量元素的形态分析中发挥了重要的作用,例如Kannamkumarath 等2225成功地将其应用于坚果中微量元素形态的研究中。超高压液相色谱(UPLC可以在很宽的线速度、流速和高反压下进行分离工作,与传统的HPLC

19、技术相比提供了更高的分离效率,具有更强的分离能力,目前较多地与飞行时间质谱(TOF -MS应用于成分鉴定的研究中2628。Bendahl 等29首次报道了采用UPLC 和ICP -MS 联用用于硒混合标准溶液中形态的测定,结果显示:在内径为117L m 的柱子、108Pa 的压力下、流速为200L l P min 、在112min 内成功分离了4种硒标准化合物,与常规的液相分离技术相比,大大节约了分析的时间,而精密度和检测限没有变差。作者还在110mm id 100mm 的柱子上,流速为100L l P min 、5min 内分离了尿液样品中的硒形态。UPLC 用于生物样品中元素形态的分离可以

20、提高分离的效率,然而该分离方法还是一项比较新的技术,许多方面还没有得到较成熟的发展,如目前可得到的柱子类型比较少,限制了该技术在形态分析领域的应用,目前还没有用于食品样品中微量元素形态分离的相关报道。生物基体中微量元素形态的复杂性和多样性使得二维或多维液相色谱分离技术得到了较大的关注。多维色谱能提供更大的峰容量,更适合于复杂样品的分析,目前得到广泛的应用。此外还有快速蛋白液相色谱30等。HPLC -ICP -MS 的应用促进了金属P 非金属形态测定的快速发展。该联用分析技术是以各种不同的色谱分离柱完成不同种类样品分析物的分离,以高灵敏度的ICP -MS 担任信号检出,具有元素专一性,线性范围宽

21、和检测限低等特点4,是具有高灵敏度和高选择性的形态分析系统;而且形态分析时不需要复杂的样品前处理和复杂的接口,只需HPLC 的流速和ICP -MS 的进样速度相匹配,近年来在元素形态分析中已得到广泛的应用。HPLC -ICP -MS 的联用及其在元素化学形态分析中的应用已有许多文献总结4,12,3135。然而大多数痕量元素形态分析缺乏标准物质,而HPLC -ICP -MS 不能提供化合物的分子结构信息,#984#化 学 进 展第19卷红外光谱(I R一般提供的结构信息有限,只是化合物的种类和一些基团的信息。因此用核磁(NMR或ESI-MS提供分子和结构信息,来鉴定HPLC-ICP-MS 分离检

22、测过的成分是必要的。与NMR相比,ESI-MS 对分析物的纯度、用量要求低,软离子化源与质量检测器连接,可以获得分析物的质荷比(m P z,提供化学形态精确的摩尔质量,得到分析物的结构信息。ESI-MS P MS是对HPLC-ICP-MS的一个补充技术,是鉴定、表征用HPLC-IC P-MS分析的实际样品中的未知形态不可缺少的形态分析工具36,37。近年来,利用色谱(HPLC、CE、GC与质谱检测器(ICP-MS、ESI-MS联机技术对食品中微量元素进行形态分析及其微量元素形态在生物体内的生物有效性研究,国外已有较多的报道,如美国的Joseph Caruso16,1925,3840、波兰的Ry

23、szard´obi ski和Joanna Szpunar1,4,5,34,35,41,以及西班牙的Alfredo Sanz-Medel30,4247等人。但国内在使用色谱(HPLC、C E、GC与质谱检测器(IC P MS、ESI MS联机技术上显得相对较为薄弱,在利用该技术进行微量元素形态分析方面还有待深入研究。3HPLC-IC P-MS在食品中微量元素形态分析中的应用3.1硒的形态分析硒的形态分析已成为一个热门的研究方向。许多日常食品都含有硒化合物,如富硒酵母、蒜类植物、蔬菜和含硒营养品等。这些食品中硒的可利用价值由硒的化学形态决定,硒的不同化学形态对人体的吸收、生物效应、毒性及

24、防癌作用不同,例如硒酸盐(selenate和亚硒酸盐(selenite会导致生物体病变,而硒蛋氨酸(Se Met是人类摄取硒元素的主要来源。目前已经证明的食品中含有的硒化合物有20多种(表1。研究证明在日常膳食中添加适量的硒可以减少乳腺癌、肠癌、肺癌和前列腺癌的发病率48,49。硒缺乏会导致免疫功能和甲状腺机能失调、心血管病、骨骼和心肌功能紊乱等疾病;但是吸收过量,却反而有毒50。含硒的功能食品不仅要满足加强细胞抗氧化能力,也要满足能够预防某些癌症的发生。提供富硒植物、硒营养物、日常富硒食品中的硒形态的生物有效性和毒性等相关信息对发展含硒的功能食品和维持人体健康是非常重要的。目前用于定性和定量

25、酵母或其他食品中硒的分析方法有很多种,如GC-AED(原子发射检测器、表1已经证实的食品中的硒形态Table1Selenium species in foodna me(abbrevi ation:c hemical formulaselenic acid(s elenate:SeO42-(Na2SeO4selenous aci d(seleni te:SeO32-(Na2SeO3seleno methionine(SeMet:CH3Se(CH22CH(COOHNH2 selenocystine(SeCys2:(N H2CH(CO OHCH2Se2selenocysteine(SeCys:N

26、H2CH(CO OHCH2Se Hselenoethioni ne(SeEt:CH3CH2Se(CH22CH(COOHNH2Se-methylselenomethioni ne(MeSeMet:(CH32Se(CH22CH(COO HNH2 Se-methylselenocysteine(M eSeCys:CH3SeCH2CH(COO HN H2tri methyls eleni um(TMSe:(CH33Se+selenoadenos yl methioni ne(AdoSeMet:N H2CH(COOHCH2CH2SeCH2C4H5O3C5N4N H2C-glutamy-l Se-meth

27、ylselenocysteine:CH3SeCH2CH(COO HN HC(O(CH22CH(COO HN H2C-glutamy-l selenomethionine:COO HN H2CH(CH22CON HCHOOHCH2CH2SeCH3 methaneseleninic acid:MeSeO2Hdi methylselenonium propionate(D MSeP:(CH32SeCH2CH2COO Hseleno methionine-Se-oxi de SeO MetSe-allylselenocystei ne:CH2CHCH2SeCH2CH(COOHNH2 selenohom

28、ocystine(Sehcys:(N H2CH(COOHCH2CH2Se2HPLC-ICP-MS、GC-ICP-MS和CZE-ICP-MS等51,而HPLC-ICP-MS以其高分离度和高灵敏度,是目前最有效的分析方法。3.1.1富硒酵母Se Met是人和动物摄取硒的主要营养来源,而富硒酵母是富含Se Met的主要日常食品之一。酵母中的硒形态分析从营养和防癌角度,引起了许多研究者的关注。Clark等48研究显示富硒酵母具有较好的癌症预防作用。富硒酵母中的硒形态大多数采用联用技术分析测定,由于酵母中的硒形态一般不具有挥发性,因此HPLC-ICP-MS是测定酵母中硒形态的最理想的分析方法。Bird等

29、52用热水和酶水解法分别提取了富硒酵母中的SeMet和其他有机硒化合物,提取液在离子对色谱柱上分离,以三氟醋酸(TFA为离子对试剂,甲醇-水(2B98为流动相,C8柱为固定相,并用一根PEEK管与ICP-MS接口相连。结果发现了20多种含硒化合物,并证实了在两种提取液中均有无机硒、硒半胱氨酸(SeCys和硒蛋氨酸(SeMet。酶提取物的分析证明了酵母中的主要硒形态为Se Met。Casiot等53研究了从富硒酵母中提取硒化合物的多种方法。得到的提取物经不同的液相色谱柱分离(排阻、阴离子交换、反相色谱,用ICP-MS测定硒的化学形态,结果发现用水和甲醇浸取的回收率仅为10%20%,得到8种化合物

30、,包括Se(Ô和Se Met。用果糖酶提取可以释放20%的硒蛋氨酸,用#985#第6期周瑛等HPLC-ICP-MS在食品中硒和砷形态分析及其生物有效性研究中的应用 图1 酵母中硒形态提取及分离检测方法56Fig.1 Extraction and speciation analysis of Se in yeast 56SDS 提取,占30%总量硒的硒蛋白溶解。用蛋白水解酶,硒的回收率可以达到85%,主要成分是硒蛋氨酸。如用四甲基氢氧化铵水解,则样品全部溶解,但是硒化合物全部降解为Se Met 和无机硒。Wr bel 等38采用离子对反相色谱与紫外检测器(UV、ICP -MS 联用测定

31、了富硒酵母中低分子量区的硒化合物:硒胱氨酸(SeCys2、硒腺苷甲硫氨酸(AdoSeMet和硒腺苷半胱氨酸(AdoSeHcy,采用ESI -MS 进一步证实了它们的结构,并研究了AdoSe Met 和AdoSeHcy 之间的甲基化过程,说明了它们在酶的作用下在生物体内的转化。McSheehy 等54利用二维液相色谱(排阻色谱和反相色谱分离富硒酵母水提取液中的6种硒化合物,并以ICP -MS 和ESI -MS 为检测器。分析物经过多维色谱纯化、分离以除去基体组分,实验得到6种分子量分别为:197、603、562、584、372和432的硒化合物,其中两种化合物(197、432经碰撞诱导解离质谱(

32、CID -MS鉴定为Se Met 和AdoSe Hcy,还发现了一种未曾报道过的硫谷胱苷肽与硒结合的化合物。Mounicou 等55采用基于排阻色谱-毛细管区域电泳(CZE的二维分离方法和排阻-反相-毛细管区域电泳的三维分离方法,以IC P -MS 为检测器分析硒酵母水提取物中的硒形态。硒酸(selenate、亚硒酸(selenite、硒胱氨酸(SeCys2、硒蛋氨酸(Se Met和硒代乙硫氨基酪酸(SeEt可以达到基线分离。该方法的检测限是718L g P ml 。CZE -ICP -MS 分析酵母提取物证明了许多硒形态的存在。蛋白酶水解高分子量和低分子量片断的化合物后可以很明显地提高硒形态

33、的回收率。M dez 等42用手性液相色谱与ICP -MS 联用测定含硒酵母中的Se Met 的对映结构体,以糖肽替考拉宁为键合手性固定相(chirobiotic T,2%的甲醇-水为流动相,流速为1ml P min,在8min 之内成功地分离了DL -Se Met 、DL -SeEt 。该方法不需要柱前衍生化,具有较好的选择性和灵敏度,检测限达到2L g P L 。Polatajko 等56提出了一个系统的测定酵母中的硒形态的方法(图1。采用多种提取方法和分离检测方法分步提取和检测酵母中的硒形态。结果发现Se Met 是酵母中硒化合物中的主要形态,然而并不像其他文献所报道的那样与蛋白结合,而

34、是与细胞壁大分子结合。3.1.2 蒜类植物蒜类植物如大蒜,洋葱等也是富含硒的日常食品。Bird 等57利用离子交换色谱(流动相5mmol P LNH 4Ac+2%甲醇、离子对色谱(流动相甲醇-水(2B 98,011%TFA和衍生化反相色谱(流动相甲醇-水(62B 38与ICP -MS 联用研究了大蒜和酵母的两种提取物(水提取和甲醇-盐酸提取中的硒形态,并比较了3种分离方法的优缺点。阴离子交换色谱对selenate 和selenite 具有较好地分离,但不能很好地分离其他硒化合物。柱前衍生反相色谱对末端带有氨基官能团的化合物具有较好的分离,且相对于阴离子交换色谱来说,分离的效果更好。离子对色谱分

35、离方法得到最佳的分离结果,而且其色谱条件与ICP -MS 的条件兼容。用以上3种分离方法证实了富硒大蒜的提取液中存在硒蛋氨酸、硒-甲基-DL -硒胱氨酸和无机硒,以及几种未知形态的硒化合物。富硒酵母中含有SeMet 和一种未知形态的主要化合物。Shah 等58用反相离子对色谱,体积排阻色谱在线与ICP -MS 联用分析了富硒洋葱中的硒形态。氢氧化钠提取物经SEC -ICP -MS 分析显示硒在高分子量和低分子量区都存在相应的化合物。蛋白酶将与蛋白结合的硒氨基酸提取出来,经RP -IP -HPLC 分离,以pH=215,011%(v P v 七氟丁酸、5%甲醇为流动相。与标准样品对照,结果发现存

36、在的硒形态有:#986#化 学 进 展第19卷(SeCys2、Se Met、甲基硒胱氨酸以及无机硒化合物。在无标准样品的情况下用ESI-I TMS测定未知形态的硒化合物,证明了洋葱中C-谷氨酰-硒-甲基硒胱氨酸的存在。Wr bel等39用液相色谱分离与IC P-MS联用研究了富硒洋葱叶子中的硒形态。所研究的洋葱在含有无机硒的溶液中培养1个星期,叶子和茎块经干燥、均化,氢氧化钠提取物经SEC-IC P-MS分析显示处于高分子量区的硒形态在叶子中比茎中的要明显。甲醇-氯仿-水(12B5B3或014mol#L-1的高氯酸-乙醇(8B2溶液提取低分子量硒化合物,经离子对色谱形态分析,发现叶子提取物中的

37、主要形态是硒-甲基硒半胱氨酸(MeSeCys(约占总量的4%。研究发现可以将洋葱叶子作为摄取MeSeCys的日常食品。Kotrebai等59用离子对高效液相色谱与ICP-MS 以及ESI-MS在线联用分析了富硒大蒜和酵母酶提取物和热水提取物中的硒形态。以甲醇-水(1B99为流动相,TFA为离子对试剂,实验结果显示这些酵母样品中的硒的主要形态为硒蛋氨酸和硒-腺苷-硒半胱氨酸,大蒜中硒的最主要形态为C-谷氨酰-硒-甲基硒半胱氨酸和C-谷氨酰-硒蛋氨酸。HPLC-ICP-MS的检测限为1050L g P ml,而HPLC-ESI-MS的最低检测浓度是HPLC-ICP-MS的100多倍。他们60还采用

38、了用离子对反相色谱与IC P-MS联用研究了多种富硒样品的热水提取物和酶提取物,如火麻仁、洋葱、大蒜、酵母以及其他植物中的硒形态。采用以1B99的甲醇-水为流动相,011%的七氟丁酸或011%的TFA作为离子对试剂,分离得到20多种硒化合物,一些具有较高浓度的化合物采用HPLC-ESI-MS 鉴定。酵母中主要硒形态为硒蛋氨酸,而火麻仁、大蒜、洋葱中的主要硒形态为硒-甲基-硒半胱氨酸和其他相关化合物。此外还有大约25%未知形态的化合物,该方法的检测限富硒样品是250L g P ml,对天然硒含量的样品是210L g P ml,HPLC-ESI-MS的检测限是HPLC-ICP-MS的100多倍。U

39、den等12还采用反相HPLC-ICP-MS和HPLC-ESI-MS测定以上富硒样品中的硒形态,并比较了3种不同的离子对试剂对实验测定的影响,结果发现以甲醇-水(1B99为流动相,以011%的HFB A为离子对试剂在70min内分离得到20多种硒化合物。该实验同样采取酶水解和热水提取法提取样品中的硒。此外还用反相HPLC-ICP-MS和HPLC-ESI-MS分析了C-谷氨酰-硒-甲基硒半胱氨酸和硒-甲基-硒半胱氨酸(MeSeCys的氧化产物(以30%H2O2为氧化剂,主要产物为甲基硒酸。3.1.3其他含硒的植物和动物San-z Medel等43比较了3种不同的提取液(011mol P L HC

40、l,25mmol P L醋酸铵缓冲液和蛋白酶水溶液,分别从两种含硒植物中(葱属植物、芸苔提取硒的效率,并且比较了有无超声辅助对萃取的影响。实验结果显示用盐酸或缓冲溶液加上超声辅助从植物中定量提取非蛋白硒氨基酸是理想的方法,提取效率高、时间短,而造成的形态降解可以忽略不计。萃取液和植物组织分别通过68%硝酸和30%双氧水微波消解然后用ICP-MS测定总硒的浓度。通过离子对反相色谱和排阻P离子色谱与ICP-MS联用分析硒化合物的形态,这两种分离机理都适合分离萃取得到的硒的形态测定,主要硒化合物经测定为MeSeCys和Se Met,两种植物的提取液中同样得到了一些未知的硒的形态。Kannamkuma

41、rath等22采用HPLC-ICP-MS测定多种坚果(巴西坚果、胡桃、腰果、美洲山核桃中脂肪提取物、低分子量区、蛋白质区的硒形态。脂肪用氯仿-甲醇(2B1提取;低分子量区的硒化合物用014mol P L的高氯酸提取,其中的硒含量占坚果中硒总量的3%15%;坚果中蛋白用011mol P L的NaOH 和丙酮提取。巴西坚果经SEC-ICP-MS测定显示12%的硒与蛋白弱结合在一起,为了得到与蛋白强结合的形态,坚果的蛋白部分用蛋白酶K水解提取其中的硒化合物,并用I PLC-ICP-MS测定。结果显示硒化合物存在于低分子量和蛋白区,在脂肪中没有硒存在,所有坚果中的主要硒形态是SeMet(占总量的19%

42、25%。Kanna mkumarath等23还采用排阻色谱分别与UV、ICP-MS检测器联用研究巴西坚果中硒的形态,比较了5种不同提取液的提取效果。结果发现蛋白质在0105mol P L的氢氧化钠和含1% SDS的Tris-HCl缓冲溶液(0105mol P L,pH=8中的溶解作用比0105mol P L盐酸、0105mol P L Tris-HCl缓冲溶液和热水(60e都要好。他们还采用了3种不同的排阻色谱分离条件,对硒化合物进行完全的分离。为了进一步得到硒的形态,坚果中的油脂用氯仿-甲醇(2B1提取,最后得到的脱脂粉末经蛋白酶水解后用CE-ICP-MS测定,证明了坚果中与蛋白质结合的最主

43、要的形态为Se Met。Huerta等44采用阴离子交换柱分离酵母和小麦面粉中的硒化合物,微波消化法后测定总硒浓度,蛋白酶和脂肪酶水解后测定硒的形态。阴离子交换柱的洗脱物通过在线同位素稀释ICP-MS测定。结果发现两种基体中主要的硒形态为SeMet,在小麦面粉中占总硒浓度的59%,在酵母中占总硒浓度的68%。酵母中检测到Se(Ô和Se(Ö,而在面粉中没有这两种无机硒。他们45还采用HPLC-IDA-ICP-MS(IDA:同位素稀释分析法测定了3种可食用蘑菇中的硒形态,从而研究野生蘑菇中硒的自然形态。蘑菇热水提取物通过排阻色谱、反相色谱和阴离子交换色谱分离,分别与ICP-MS

44、在线联用分析硒的形态。实验结果发现在3种蘑菇的水提取物中,硒的主要形态为SeMet。同时还发现多种未知形态的低分子量的硒化合物。San-z Medel等46比较了4种不同的提取方式(微波消化、甲醇P水、SDS、酶水解提取鳕肉中的硒,用反相色谱和排阻色谱分离固-液提取物中的硒化合物,并用柱后同位素稀释ICP-MS鉴定硒的形态。结果发现酶提取具有最高的回收率,而甲醇P水的回收率仅只有5%。酶提取物的形态分析显示硒的最主要形态为SeMet,而在甲醇P水提取物的形态分析中没有该化合物的峰,说明硒主要与蛋白结合。同时还发现许多未知形态的硒化合物。Larsen等61用离子交换色谱(阳离子、阴离子交换与IC

45、P-MS联用分离12种标准硒样品,在阳离子交换分离中,以吡啶甲酸盐(pH=3为流动相,阳离子被分离出来。阴离子交换以水杨酸-tris(pH= 815为流动相。他们将该方法应用于实际样品酵母和海藻中。酵母的B-葡萄糖苷酶提取物经混合蛋白酶提取后发现酵母中的主要硒形态是Se Met,此外还有SeOMet和MeSeCys。海藻中的硒形态采用三氯乙酸提取,HPLC-E SI-MS鉴定了丙酸二甲基硒的存在,色谱图与标准物质比较还发现SeEt和硒-烯丙基硒代半胱氨酸以较低的浓度存在。Bergmann等62采用RP-HPLC-ICP-MS测定了南极磷虾中硒代蛋氨酸的绝对构型,硒代蛋氨酸对映体通过与邻苯二甲醛

46、(OPA和N-异丁酰-L-半胱氨酸反应生成异吲哚非对映体。研究得到检测限为4L g P L,磷虾中的硒代蛋氨酸主要为L-构型。3.1.4营养保健品B.Hymer和Caruso40用HPLC-IC P-MS分析了6批市售富硒营养酵母中的硒形态与总量。采用甲醇-水-三氟乙酸(10B89B1为流动相,样品通过微波硝酸消化分析硒总量并与标签显示相比较。该实验中还比较了多种提取和水解方法,其中用2mol P L的盐酸溶液在95e下微波加热2h和蛋白酶在37e下水解20h两种提取方法,可以最有效地提取富硒酵母食品中的硒化合物,如硒蛋氨酸、硒缩氨酸和硒蛋白。其他水溶性无机硒化合物可以在任何条件下比较轻易地提

47、取出来。江凤等63编译报道了10种市售硒营养物中硒的存在形式,总硒浓度通过GFAAS 和ICP-MS测定。硒营养物中硒化合物通过阳离子和阴离子交换HPLC-ICP-MS来测定。在调查的硒营养物中,发现总硒浓度大体与供应商的说明一致。然而这些硒营养物中硒的化学形式却差异较大。硒酸盐是其中4种硒营养物中唯一存在的形式,一种营养物中硒以硒蛋氨酸的形式存在,在其他5种硒营养物中则检测到selenate、selenite、(SeCys2、Se Met 及几种未知化合物。用水提取法提取营养物中的硒化合物,提取率大于93%。Gomez-Ariza等64研究了HPLC(糖肽替考拉宁手性固定相:chirobio

48、tic T和微波辅助消化氢化物发生原子荧光光谱和电感耦合等离子体质谱联用在母乳和配方奶中硒代蛋氨酸的手性形态。HPLC与微波辅助消化氢化物发生原子荧光光谱联用分析物需要柱前在线处理,样品需要经过严格离心和超滤,脱脂和除去蛋白质。未经衍生化的DL-硒代蛋氨酸可以在10min内达到完全的分离,并得到较好的选择性和灵敏度(L-,D-硒代蛋氨酸的检测限分别为311和315ng P ml。该方法操作简单、成本低,适用于婴儿奶粉的日常检测。HPLC-ICP-MS显示了很低的检测限(019ng P ml,但是该方法受其体效应的影响,稳定性不好。这两种方法分别用于母乳和配方奶中硒代蛋氨酸的测定,发现L-硒代蛋

49、氨酸是母乳中仅存在的形式,而配方奶中还含有30%的D-硒代蛋氨酸。Sutton等19用手性液相色谱分别与UV、ICP-MS 联用在60min内分离了3种未经衍生化的硒氨基酸:D,L-Se Met、D,L-SeEt和D,L-(SeC ys2的对映体。采用冠醚为固定相,流动相为0110mol P L的HClO4溶液,温度为22e,研究发现温度的变化对实验的分离效果有较大的影响(波动1e就会降低分离率。UV的绝对检测限是1172521356ng P L l,然而ICP-MS 的绝对检测限比它好40400倍。将该方法应用于10种日常含硒食品中,发现ICP-MS可以很容易检测出样品中的硒形态,而UV由于

50、样品基体影响以及灵敏度不高而不能理想地用于实际样品的检测。作者还采用了阴离子交换色谱分离手性色谱柱未能分离的化合物,硒总量的测定同样采用传统的消化和酶消化,并用ICP-MS检测。他们20还采用冠醚HPLC手性色谱柱与ICP-MS联用分析了9中硒氨基酸,研究了3种不同的温度对单个氨基酸对映体拆分以及8种氨基酸混合物分离的影响。研究结果显示,在22e下,除了硒代羊毛硫氨酸其他8种对映体均能得到分离,但是混合物的峰没有达到分离。该研究方法应用于富硒洋葱、大蒜和酵母中硒化合物的测定,比较了水提取和胃蛋白酶提取两种提取方法,在两种提取物中得到了硒氨基酸对映体。Montes-bayon等21采用RPLC-

51、ICP-MS分离了硒氨基酸的对映体,以(1-氟-2,4-二硝基苯基-5-L-缬氨酰胺(Marfey.s试剂为衍生化试剂。HPLC条件在UV检测器340nm下优化,得到最终检测条件(50%甲醇、pH=513,在26min内使SeMet非对映体达到完全分离,ICP-MS的检测限是11ppb。该方法应用于实际样品如富硒酵母、营养片和药物制剂中D-,L-对映体的检测,结果发现在酵母和营养片中仅存在L-构型的Se Met,而在药物制剂中含有两种构型。3.2砷的形态分析砷是普遍存在的元素,在地壳中含量排20位,通常以无机化合物的组成成分存在于环境中。环境和生物体中含有多种砷的化学形态,砷的毒性、环境活性以

52、及在生物体中的积累与其化学形态有关65,66。研究证明,无机砷:砷酸盐(AsÕ和亚砷酸盐(AsÓ的毒性大于单甲基胂酸(MMA和双甲基胂酸(D MMA,而砷甜菜碱(AsB和砷胆碱(AsC通常被认为是无毒的。表2已经证实的食品中的砷形态Table2Arsenic species in foodname(abbreviati on:chemical formulaarsenous acid:ars enite(AsÓ:As(O H3arsenic acid:arsenate(AsÕ:AsO(O H3methylarsonate(MA:CH3As O(O2-2d

53、ime thyl arsine(DMA:(CH32As Htrimethylarsine(TMA:(CH33Asmonomethylars onic acid(MMAAÕ:CH3As O(Omonomethylars onous acid(MMA AÓ:CH3As(OH2dime thyl arsonic acid(D MAAÕ:(CH32As O(O Hdime thyl arsonous aci d(D MAAÓ:(CH32AsO Hdime thyl arsinoyl ethanol(D MAE:(CH32AsOCH2CH2O H trimethy

54、larsine oxide(TMAO:(CH33As Otetramethylarsonium i on(TMA+:(CH34As+arsenobatine(As B:(CH33As+CH2COO-arsenocholine(As C:(CH33As+CH2CH2O Htrimethylarsine(TMAÓ:(CH33Asarsines(As H3,M e AsH2,Me2As H:(CH3x As H3-x(x=03ethyl methylars ines(Et x AsMe3-x:(CH3CH2x As(CH33-x(x=03 phenylarsonic(PAA:C6H5AsO

55、(O H2p-ars anilic acid(p-ASA:N H2C6H4As O(OH2trimethylarsoni opropi onate(TMAP:(CH33As+COO-dime thyl arsinoylacetic acid:M e2As OHCHCOOH仅仅测定砷的总浓度已经不能满足临床化学和环境的需要。不断发展的分析技术使我们更进一步了解砷的形态、毒性、代谢和生物活性67。3.2.1海产品中的砷虽然海水中的砷含量很低,但是海洋性生物(包括植物和动物能富集吸收砷,海洋性生物通常是含有较高水平砷的基体。特别是贝壳类、海藻类、鲸类等生物65,67。研究67证明,海中鱼类、甲壳类和

56、软体动物中的砷形态主要是四烷基胂(Me4As+,而海中海藻和双壳类中的主要砷形态是氧化三甲基胂(TMAO。可食用海藻和其他海产品是人类日常食品之一,海藻从海水中吸收砷,并转化为有机胂化合物。AsB是海生动物中砷形态的主要形式。研究显示,AsB对人体是无害的,然而人体可以将砷糖转化为DMAA,而DMAA对人体具有致癌作用65。McSheehy和Szpunar68用二维色谱(排阻-阴离子交换与ICP-MS和ES-MS联用检测10种可食用海藻中的砷形态。首先将海藻中甲醇-水提取液在SE Superdax Peptide HR10P30柱上用1%v P v醋酸作淋洗液分离基体,将砷糖分成不同的组分,然

57、后将提纯的含砷组分用AE Supilcosil SA1(2500mm 416mm5L m柱再一次分离,并用4种砷糖标准品验证结果。二维色谱分离法的优点在于两种方法的机理不同,可减少出现重叠峰的可能,他们还为此做了补充69。利用反相、阴离子交换、阳离子交换色谱和排阻色谱与ICP-MS联用分析了海藻甲醇-水(1B1提取物中的14种砷形态。还用三维色谱(排阻-阴离子交换-反相色谱分离生物样品中的砷化合物,并用ES MS-MS鉴定它们的形态。Ackley等70用离子交换色谱P离子对色谱-ICP-MS检测了3种鱼肉组织中的砷形态。分别用水、两种不同比例的甲醇-水溶液、5%四甲基氢氧化铵溶液提取,发现甲醇

58、-水(80:20时,65e下微波辅助萃取4min,萃取率可达100%,砷的主要形态是AsB,一种无毒的形态。Wahlen71采用了HPLC-ICP-MC联用测定鱼肉(巨头鲸肉、金枪鱼肉、牡蛎肉样品中的AsB,样品前处理采用快速溶剂萃取。采用阴离子交换柱等度洗脱,以212mmol P L NH4HCO3和215mmol P L酒石酸混合溶液为流动相,流速为1ml P min,10min内可分离6种不同形态的砷。仪器检测限为0104L g P g,工作曲线范围为0700L g P g,相关系数可达01999 11000。刘桂华等72通过HPLC-ICP-MS联用技术探讨了紫菜中砷的形态。样品经纯水萃取,再经甲醇稀释,得到的待测物经HPLC-ICP-MS分析。该研究比较了两种不同的HPLC条件(阴离子交换柱和阳离子交换柱,结果发现阴离子交换色谱柱分离出砷的形态最多,而阳离子交换柱并没有检测出AsB、AsC;研究还发现两个未知形态的色谱峰。Chatterjee73采用硝酸(210ml和30%的过氧化氢(0120ml微波辅助消解,并用阴离子交换柱和阳离子交换