复方丹参片微生物限度检查方法验证_张亚宇

1、收稿日期:20120917作者简介:张亚宇(1971,女,工程师,主要从事药物检验工作。复方丹参片微生物限度检查方法验证张亚宇,孔剑锋,周国玺(甘肃陇神戎发药业股份有限公司,甘肃兰州730101摘要:目的建立复方丹参片的微生物限度检查方法。方法按照中国药典2010版一部附录微生物限度检查法验证的要求对复方丹参片微生物限度检查进行了方法建立和验证研究。供试液制备采用离心沉淀法,制成110供试液。采用培养基稀释法(1100供试液,每皿01mL 进行细菌计数检验,稀释法(1100供试液,每皿1mL 进行霉菌及酵母菌计数检验,采用常规法进行控制菌检查。结果5种验证菌株的回收率均高于70%;控制菌检查经

2、方法验证,可按常规法进行大肠埃希菌和大肠菌群检查。结论建立的方法准确、可靠、重现性好,适用于复方丹参片的微生物限度检查。关键词:复方丹参片(薄膜衣片;抑菌作用;微生物限度检查;方法验证中图分类号:R2860文献标识码:B 文章编号:10038450(201301005504复方丹参片具有活血化瘀、理气止痛之功效,临床应用广泛。复方丹参片含丹参、三七、冰片3种成分,因丹参对体外的葡萄球菌、变形杆菌有较强的抑制作用1,冰片对金黄色葡萄球菌、黑曲霉等真菌有较强的抑制作用23,所以复方丹参片可抑制微生物的生长,不能采用常规法进行该药品的微生物限度检查,且不同厂家生产的复方丹参片抑菌作用不同4。为了更有

3、效地控制其药物质量,本试验采用了多种方法以消除该药物的抗菌活性,对其微生物污染进行有效地检测,按要求5将5株代表试验菌(金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌和黑曲霉加入复方丹参片中,对各试验菌的回收率进行逐一验证,并对控制菌检查方法进行验证,建立复方丹参片的微生物限度检查方法。1仪器与材料11仪器YY002790培养箱,上海跃进医疗器械厂;082离心机,常州国华电器有限公司;LDZX 50FB 立式蒸汽灭菌器,上海申安医疗器械厂;SW CJ IFD 超净工作台,苏净集团安泰公司;HG3034生化培养箱,上海南京电器三厂。12供试品复方丹参片,甘肃陇神戎发药业股份有限公司,批号为

4、20101001,20101006,20101007,规格:薄膜衣小片,032g /片。13验证用菌种枯草芽孢杆菌CMCC (B 63501、大肠埃希菌CMCC (B 44102、金黄色葡萄球菌CMCC (B 26003、白色念珠菌CMCC (F 98001、黑曲霉CMCC (F 98003,均由甘肃省食品药品检验所提供,以上菌种均为第3代。14培养基营养肉汤培养基、营养琼脂培养基、玫瑰红钠琼脂培养基、改良马丁琼脂培养基、胆盐乳糖培养基、乳糖胆盐发酵培养基,中国药品生物制品检定所生产,均按中国药典2010版附录配制。15稀释剂pH 70无菌氯化钠蛋白胨缓冲液,按中国药典2010版附录配制。2方

5、法与结果21菌液的制备1取经30 35培养18 24h 的金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、大肠埃希菌的营养肉汤培养物1mL ,取经23 28培养24 48h 的白色念珠菌真菌肉汤液体培养物1mL ,分别加09%无菌氯化钠溶液9mL ,10倍逐级地稀释至107 105,制成每毫升含菌数为50 100cfu 的菌悬液,作活菌计数备用。2取经25培养7d 的黑曲霉改良马丁斜面培养物,加09%无菌氯化钠溶液5mL 洗下霉菌孢子,吸取霉菌孢子液1mL 加09%无菌氯化钠溶液9mL ,10倍逐级地稀释为104,制成每毫升含孢子数约为50 100cfu 的孢子悬液,作活菌计数备用。22供试液的制备称取本品10

6、g,加pH70无菌氯化钠蛋白胨缓冲液至100mL,45水浴振摇,使样品完全分散均匀,分装于10支离心管,以500r/min离心3min,取上清液合并,作为110供试液。23各试验菌的回收率试验组的加菌回收率(%=(试验组平均菌落数供试品对照组平均菌落数/菌液组平均菌落数100%稀释剂对照组的加菌回收率(%=稀释剂对照组平均菌落数/菌液组平均菌落数100%24细菌、霉菌及酵母菌计数方法验证241验证试验一试验组(培养基稀释法:分别取上述110供试液01mL及21项下5种试验菌液各1mL(菌数约为50 100cfu/mL注入平皿,每种试验菌株分别制备平行样。菌液组:取上述5种试验菌液各1mL,分别

7、注入平皿,每株试验菌制备平行样,测定所加的试验菌数。供试品对照组:将上述110供试液01mL分别注入平皿中,测定供试品本底菌数。稀释剂对照组:用稀释液替代供试品,加入试验菌,使最终菌浓度为每毫升含菌数为50 100cfu,按试验组的供试液制备方法和菌落计数方法测定其菌数。上述各组细菌计数检查项注入营养琼脂培养基,霉菌及酵母菌计数检查项注入玫瑰红钠琼脂培养基,按规定条件培养后,观察结果,计算各试验菌的回收率。结果见表1。表1回收率试验一结果试验菌试验次数菌落计数/(cfu/mL菌液组试验组供试品对照组稀释剂对照组回收率/%金黄色葡萄球菌275220712995 371200682896因供试液制

8、备需要离心处理,故增加稀释剂对照组,以考察供试液制备过程中微生物受影响的程度。表1结果表明,在3次独立的平行试验中,5种试验菌液的稀释剂对照组回收率均高于70%,表明供试液制备方法可行;采用培养基稀释法(110供试液,每皿01mL进行细菌计数检验,供试品对金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌有抑制作用,回收率未达到70%,方法不可行;按此方法进行霉菌及酵母菌数测定,白色念珠菌、黑曲霉菌回收率均高于70%。242验证试验二将22项下110供试液稀释10倍,制成1100供试液。按以下方法进行验证。试验组:细菌计数检验,分别将上述1100供试液01mL及50 100cfu/mL金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、

9、大肠埃希菌的菌悬液各1mL同时加入平皿中,每种试验菌株分别制备平行样;霉菌及酵母菌计数检验,分别将上述1100供试液1mL及50 100cfu/mL白色念珠菌、黑曲霉菌的菌悬液各1mL同时加入平皿中,每种试验菌株分别制备平行样。菌液组:取上述5种试验菌液各1mL,分别注入平皿,每株试验菌制备平行样,测定所加的试验菌数。供试品对照组:将上述1100供试液(细菌计数检验每皿01mL,霉菌及酵母菌计数检验每皿1mL分别注入平皿中,测定供试品本底菌数。上述各组细菌计数检查项注入营养琼脂培养基,霉菌及酵母菌计数检查项注入玫瑰红钠琼脂培养基,按规定条件培养后,观察结果,计算各试验菌的回收率。结果见表2。表

10、2结果表明,培养基稀释法(1100供试液,表2回收率试验二结果菌种试验次数菌落计数/(cfu/mL菌液组试验组供试品对照组回收率/% 17568091金黄色葡萄球菌26659089 3605308816456088枯草芽孢杆菌26861090 3746809219796099大肠埃希菌29583087 3757009317668089白色念珠菌27969087 3837509017065093黑曲霉菌27762081 36151084每皿01mL进行细菌计数检验、稀释法(1100供试液,每皿1mL进行霉菌及酵母菌计数检验,5种试验菌的回收率均高于70%,方法可行。25控制菌检查方法的验证复方丹

11、参片系含药材原粉的口服制剂,根据微生物限度要求,控制菌应进行大肠埃希菌、大肠菌群的检查。供试液的制备:称取本品10g,加pH70无菌氯化钠蛋白胨缓冲液至100mL,45水浴振摇,使样品完全分散均匀,作为110供试液。大肠埃希菌:试验组取上述110供试液10mL及10 100cfu/mL大肠埃希菌的菌悬液1mL加至100mL胆盐乳糖增菌液中,30 35培养18 24h后,按中国药典2010版控制菌(大肠埃希菌检查法检查,同时做阳性对照试验、阴性对照试验。大肠菌群:试验组取上述110供试液1mL及10 100cfu/mL大肠埃希菌的菌悬液1mL加至10mL乳糖胆盐发酵培养基中,30 35培养18

12、24h后,按中国药典2010版控制菌(大肠菌群检查法检查,同时做阳性对照试验、阴性对照试验。结果见表3。结果表明,3批复方丹参片控制菌试验组结果均为阳性,检出大肠埃希菌、大肠菌群,阴性对照组均未检出,表明复方丹参片可按常规法进行大肠埃希菌、大肠菌群检查,经方法验证成立。表3控制菌的验证试验结果样品批号大肠埃希菌供试品试验组阳性对照阴性对照大肠菌群供试品试验组阳性对照阴性对照20101001+20101006+20101007+注:“+”代表结果呈阳性,“”代表结果呈阴性。3讨论笔者实际工作中对复方丹参片进行微生物限度检查时,发现该药品对金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌具有较强的抑菌活性,对白色念珠

13、菌和黑曲霉等真菌有一定的抑制作用,对大肠埃希菌抑菌作用相对较弱,这与文献报道的丹参、冰片的抑菌作用相吻合。处方中的丹参、冰片等抑菌药物是复方丹参片具有抑菌作用的直接原因,不同厂家生产的复方丹参片抑菌作用不同,可能与药材品质和生产工艺有关,实验结果提示复方丹参片不同程度的抑菌作用与其药品质量有一定的相关性。中国药典2010版一部附录XIII C微生物限度检查法规定,具抑菌活性的供试品,其供试液的制备可采用培养基稀释法、离心沉淀法、薄膜过滤法或中和法以消除供试液的抑菌活性,再依法检查。复方丹参片抑菌作用较强,本方法采用一定量供试液经离心沉淀法处理,取全部上清液混合,作为110供试液。采用培养基稀释

14、法(1100供试液,每皿01mL进行细菌计数检验,稀释法(1100供试液,每皿1mL进行霉菌及酵母菌计数检验,常规法进行控制菌检查,经方法验证,能有效地消除药品中抑菌物质的干扰,控制该产品质量,该方法准确可靠、重现性好,适用于复方丹参片的微生物限度检查。3批样品按照上述方法进行微生物限度检查,结果均符合规定。参考文献:1周静,李惠芬,王洪志,等丹参水溶性成分与脂溶性成分抑菌作用的考察J时珍国医国药,2008,19(9: 213021312吴寿荣,程刚,冯岩冰片药理作用的研究进展J中草药,2001,32(12:114311453赵晓洋,葛荣明冰片抗真菌作用的超微结构观察J哈尔滨医科大学学报,19

15、92,26(4:2952974王海华不同厂家复方丹参片抑菌作用强弱的比较J中成药,2011,33(3:4644675国家药典委员会中国药典(一部M北京:中国医药科技出版社,2010:附录XIIIC7984Validation of microbial limit test method of Compound Danshen tabletsZhang Yayu,Kong Jianfeng,Zhou Guoxi(Gansu Longshen Rongfa Pharmaceutical Co,LTD,Lanzhou730101,ChinaAbstract:Objective To establis

16、h a method for the microbial limit test of Compound Danshen tabletsMe-thods Established the method and validation test for the microbial limit test of Compound Danshen tablets accord-ing to China pharmacopoeia(2010edition,VolAppendixCThe method of centrifugal sedimentation was adopted to prepare the

17、 probational liquid(110of Compound Danshen tabletsCulture medium dilution method (1100probational liquid,01mL/dishwas used for bacterial count,dilution method(1100probational liquid,1mL/dishwas used for mold and yeast count,in validation test of bacterial,mold and yeast countResults The recovery rate of five validation strains were higher than70%The routine method were used for the control bacteria test,methodology validation of controlling bact