发酵法生产L-天冬酰胺酶

1、发酵法生产发酵法生产L L天冬酰胺酶天冬酰胺酶 学生模拟组建运营一个学生模拟组建运营一个L天冬酰胺酶生产企天冬酰胺酶生产企业，撰写计划书业，撰写计划书(在理论教学期间完成在理论教学期间完成)。 市场部：市场部：L天冬酰胺酶的结构、功能、天冬酰胺酶的结构、功能、用途，用途，L天冬酰胺酶市场状况与销售预测，天冬酰胺酶市场状况与销售预测，竞争对手状况与分析。竞争对手状况与分析。 技术部：确定技术部：确定L天冬酰胺酶生产的工天冬酰胺酶生产的工艺流程及工艺参数，编制生产操作规程，艺流程及工艺参数，编制生产操作规程，确定生产车间的布局。确定生产车间的布局。 品控部：制定品控部：制定L天冬酰胺酶的质量标天冬

2、酰胺酶的质量标准，生产取样分析操作规程，质量检测标准，生产取样分析操作规程，质量检测标准和操作规程。准和操作规程。 总经理：协调监督各部工作，最后拿总经理：协调监督各部工作，最后拿出完整的计划书。出完整的计划书。L-天冬酰酶生产工艺天冬酰酶生产工艺l一、结构与性质一、结构与性质l 由四个相同亚基组成，有由四个相同亚基组成，有222个对称轴，个对称轴，每个亚基含每个亚基含326个氨基酸残基。个氨基酸残基。l 用于儿童急性淋巴细胞白血病用于儿童急性淋巴细胞白血病 、单细胞、单细胞白血病、淋巴肉瘤、胰腺癌等。白血病、淋巴肉瘤、胰腺癌等。l 机理：机理：l 降低人体内天冬酰胺和谷氨酰胺浓度，降低人体内

3、天冬酰胺和谷氨酰胺浓度，正常细胞可自我合成，癌细胞不具备这种正常细胞可自我合成，癌细胞不具备这种能力，从而受到抑制。能力，从而受到抑制。l 性状：性状：l 白色粉末，微吸湿，溶于水，不溶于有白色粉末，微吸湿，溶于水，不溶于有机溶剂。机溶剂。l二、生产工艺二、生产工艺l1 工艺路线工艺路线l2 工艺过程及控制要点工艺过程及控制要点l(1)菌种培养菌种培养l 采取大肠杆菌采取大肠杆菌AS1-375，普通牛肉培养，普通牛肉培养基，接种后于基，接种后于37培养培养24h。 l(2) 种子培养种子培养l 16玉米浆，接种量玉米浆，接种量11.5，37通气搅拌培养通气搅拌培养48h。l(3)发酵罐培养发酵

4、罐培养l 玉米浆培养基，接种量玉米浆培养基，接种量8，37通气通气搅拌培养搅拌培养68h，离心分离发酵液，得菌体，离心分离发酵液，得菌体，加加2倍量丙酮搅拌，压滤，滤饼过筛，自然倍量丙酮搅拌，压滤，滤饼过筛，自然风干成菌体干粉。风干成菌体干粉。 l(4) 提取、沉淀、热处理提取、沉淀、热处理l 每千克菌体干粉加入每千克菌体干粉加入0.OlmolL pH8.0的硼酸缓冲液的硼酸缓冲液lOL 37保温搅拌保温搅拌1.5h，降，降温到温到30以后，用以后，用5molL醋酸调节醋酸调节pH4.24.4进行压滤，滤液中加入进行压滤，滤液中加入0.2倍体倍体积的丙酮，放置积的丙酮，放置34h，过滤，收集沉

5、淀，过滤，收集沉淀，自然风干，即得干粗酶。自然风干，即得干粗酶。 l 取粗制酶，加入取粗制酶，加入0.3甘氨酸溶液，调节甘氨酸溶液，调节pH8.8，搅拌，搅拌1.5h，离心，收集上清液，加，离心，收集上清液，加热到热到6030min进行热处理。离心弃去沉进行热处理。离心弃去沉淀，上清液加淀，上清液加2倍体积的丙酮，析出沉淀，倍体积的丙酮，析出沉淀，离心，收集酶沉淀，用离心，收集酶沉淀，用0.01molL，pH8.0磷酸缓冲液溶解，再离心弃去不溶物，磷酸缓冲液溶解，再离心弃去不溶物，得上清酶溶液。得上清酶溶液。 l(5)精制、冻干精制、冻干l 上述酶溶液调节上述酶溶液调节pH8.8，离心弃去沉淀

6、，清液，离心弃去沉淀，清液再调再调pH7.7加入加入50聚乙二醇，使浓度达到聚乙二醇，使浓度达到16。在在25放置放置45天，离心得沉淀。用蒸馏水溶天，离心得沉淀。用蒸馏水溶解，加解，加4倍量的丙酮，沉淀，同法反复倍量的丙酮，沉淀，同法反复1次，沉淀次，沉淀用用pH6.4，0.05molL磷酸缓冲液溶解，磷酸缓冲液溶解，50聚聚乙二醇反复处理乙二醇反复处理1次，即得无热原的次，即得无热原的L天门冬酰天门冬酰胺酶。溶于胺酶。溶于0.5molL磷酸缓冲液，在无菌条件磷酸缓冲液，在无菌条件下用下用6号垂熔漏斗过滤，分装，冷冻干燥制得注号垂熔漏斗过滤，分装，冷冻干燥制得注射用射用L天门冬酰胺酶成品，每支天门冬酰胺酶成品，每支1万或万或2万单位。万单位。l3 检测方法检测方法l 取取lml0.04molL的的L天门冬酰胺，天门冬酰胺，0.5molLpH8.4的硼酸缓冲液，的硼酸缓冲液，0.5ml细细胞悬浮液或酶液，于胞悬浮液或酶液，于37水浴中保温水浴中保温15min后加后加0.5ml15三氯醋酸，以终止反三氯醋酸，以终止