USP29-2s 61-非无菌产品的微生物检查微生物的计数检查 中文译稿doc(校)

1、61微生物试验（61）非无菌产品的微生物检查：微生物计数试验序言后面描述的试验对可在好氧条件下生长的嗜温细菌和真菌进行定量计数。设计此试验主要是为了确定一种原料药和制剂的微生物质量是否符合已建立的质量标准。作此用途时，遵循下面给出的说明，包括采样编号，并按照下面的说明判定结果。此方法不适用于以活的微生物作为活性成份的产品。也可以使用其它的微生物规程，包括自动化方法，只要它们和已经证明的药典方法等效。通用规程在设计好的条件下进行检定，避免供试品受到外部微生物的污染。避免污染所采取的预防措施必须不影响试验中出现的任何微生物。如果供试品中含有抑菌活性，那么应当尽可能的将其去除或中和。如果用灭活剂来达

2、到此目的，那么必须证明其有效性以及对微生物不具有毒性。如果表面活性剂用于样品制备，那么必须证明其对微生物的无毒性及与所用灭活剂的相容性。计数方法如下所示，使用膜过滤法或平板计数法其中一种。通常微生物计数用最大几率计数（MPN）法是最不精确的；但是，对生物负荷极低的特定产品组，它可能是最为适宜的方法。选择方法取决于这些因素，如产品性质及要求的微生物限度。选择的方法必须允许对足量的样品量进行试验，从而判断是否符合质量标准。必须建立所选方法的适用性。促生长试验和计数方法的适用性一般考虑必须建立实验检出供试品中所含微生物的能力。如果试验操作或产品方面引入了可能影响试验结果的变更，则必须确认适用性。试验

3、菌株的制备使用标准化的稳定试验菌悬液，或者按下述说明制备。使用种子批培养保存技术（生产菌种系统）以便从原始主种子批中取出用于接种的活菌传代不超过5次。每种细菌和真菌试验菌株的生长情况在表1中分别详细说明。使用pH的氯化钠-蛋白胨缓冲液或pH 7.2的磷酸盐缓冲液制备试验悬液；为了悬浮黑曲霉孢子，可加入0.05%的聚山梨醇酯80（吐温80）。在2小时内使用悬液，如果在2°到8°保存，可在24小时内使用。制备并稀释黑曲霉或枯草芽孢杆菌的营养细胞新鲜悬液的替代选择，是制造一个稳定的孢子悬液，然后将适量的孢子悬液用于试验接种。稳定的孢子悬液可在2°到8°保存，保

4、存时间是一个经过验证的时间。微的制备和使用Microorganism微生物Preparation ofTest Strain试验菌株的制备Growth Promotion促生长Suitability of Counting Method in thePresence of Product在使用产品的情况下，计数方法的适用性Total Aerobic Microbial Count好氧菌总数Total Yeasts andMolds Count酵母和霉菌总数Total Aerobic Microbial Count好氧菌总数Total Yeasts andMolds Count酵母和霉菌总数St

5、aphylococcus aureussuch as ATCC 6538,NCIMB 9518, CIP4.83,orNBRC 13276金黄色葡萄球菌，如ATCC 6538,NCIMB 9518, CIP，或NBRC 13276Soybean-Casein Digest Agar or Soybean-Casein Digest Broth30°-35°18-24 hours大豆酪蛋白胨消化琼脂或大豆酪蛋白胨消化肉汤30°-35°18-24小时Soybean-CaseinDigest Agar andSoybean-CaseinDigest Broth

6、 100 cfu30°-35° 3 days大豆酪蛋白胨消化琼脂和大豆酪蛋白胨消化肉汤 100 cfu30°-35° 3 天Soybean-CaseinDigest Agar/MPNSoybean-CaseinDigest Broth 100 cfu30°-35° 3 days大豆酪蛋白胨消化琼脂/MPN大豆酪蛋白胨消化肉汤 100 cfu30°-35° 3 天PseudomonasAeruginosasuch as ATCC 9027,NCIMB 8626, CIP82.118, or NBRC13275铜绿假单

7、孢菌，如ATCC 9027,NCIMB 8626, CIP82.118, 或NBRC13275Soybean-Casein Digest Agar or Soybean-Casein Digest Broth30°-35°18-24 hours大豆酪蛋白胨消化琼脂或大豆酪蛋白胨消化肉汤30°-35°18-24小时Soybean-CaseinDigest Agar andSoybean-CaseinDigest Broth100 cfu30°-35°3 days大豆酪蛋白胨消化琼脂和大豆酪蛋白胨消化肉汤 100 cfu30°-

8、35° 3 天Soybean-CaseinDigest Agar/MPNSoybean-CaseinDigest Broth100 cfu30°-35°3 days大豆酪蛋白胨消化琼脂/MPN大豆酪蛋白胨消化肉汤 100 cfu30°-35° 3 天Bacillus subtilissuch as ATCC 6633,NCIMB 8054, CIP52.62, or NBRC 3134枯草芽孢杆菌，如ATCC 6633,NCIMB 8054, CIP52.62,或NBRC 3134Soybean-Casein DigestAgar or Soy

9、bean-Casein Digest Broth30°-35°18-24 hours大豆酪蛋白胨消化琼脂或大豆酪蛋白胨消化肉汤30°-35°18-24小时Soybean-CaseinDigest Agar andSoybean-CaseinDigest Broth 100 cfu30°-35° 3 days大豆酪蛋白胨消化琼脂和大豆酪蛋白胨消化肉汤 100 cfu30°-35° 3 天Soybean-CaseinDigest Agar/MPNSoybean-CaseinDigest Broth 100 cfu30&

10、#176;-35°< 3 days大豆酪蛋白胨消化琼脂/MPN大豆酪蛋白胨消化肉汤 100 cfu30°-35° 3 天Candida albicanssuch as ATCC 10231,NCPF3179,IP48.72,or NBRC 1594白色念珠菌，如ATCC 10231,NCPF3179,IP48.72,或 NBRC 1594Sabouraud DextroseAgar or SabouraudDextrose Broth20°-25°2-3 days沙氏葡萄糖琼脂或沙氏葡萄糖肉汤20°-25°2-3 天S

11、oybean-CaseinDigest Agar100 cfu30°-35° 5 days大豆酪蛋白胨消化琼脂100 cfu30°-35° 5 天SabouraudDextrose Agar100 cfu20°-25° 5 days沙氏葡萄糖琼脂20°-25° 5 天Soybean-CaseinDigest Agar100 cfu30°-35° 5 daysMPN: not applicable大豆酪蛋白胨消化琼脂 100 cfu30°-35° 5 天MPN：不可用Sabou

12、raud Dextrose Agar100 cfu20°-25°5 days沙氏葡萄糖琼脂20°-25° 5 天Aspergillus nigersuch as ATCC 16404,IMI 149007, IP1431.83, or NBRC9455黑曲霉，如ATCC 16404,IMI 149007, IP1431.83, 或 NBRC9455Sabouraud DextroseAgar or Potato-Dextrose Agar 20°-25°5-7 days, or until goodsporulation is ach

13、ieved沙氏葡萄糖琼脂或马铃薯-葡萄糖琼脂20°-25°5-7 天，或直至形成良好的孢子Soybean-CaseinDigest Agar100 cfu30°-35°5 days大豆酪蛋白胨消化琼脂 100 cfu30°-35° 5 天SabouraudDextrose Agar 100 cfu20°-25° 5 days沙氏葡萄糖琼脂20°-25° 5 天Soybean-CaseinDigest Agar 100cfu30°-35°< 5 daysMPN: not

14、applicable大豆酪蛋白胨消化琼脂 100 cfu30°-35° 5 天MPN：不可用Sabouraud Dextrose Agar100 cfu 20°-25°5 days沙氏葡萄糖琼脂20°-25° 5 天阴性对照为了验证试验条件，用所选稀释液代替试验样品作为阴性对照。其中不得有微生物生长。培养基的促生长对每批现成的培养基及每批由脱水培养基或描述成分制备的培养基进行试验。将表1中所列出的少量（不超过100cfu）微生物接种到大豆-酪蛋白消化肉汤和大豆-酪蛋白琼脂份/平板上，每次使用单独的培养基份/平板。将表1中说明的少量（不

15、超过100cfu）微生物接种到沙氏葡萄糖琼脂平板上，每次用一个单独的培养基平板。按照表1中描述的条件进行培养。对于固体培养基，获得的生长值与标准化的接种物所计算的值的差值不得超过2。对于新配制的接种物，其微生物生长情况与过去使用原来经过试验并获批准的培养基得到的结果相当。如果可见明显微生物生长与早先用过去试验过并获批准的培养基得到的结果相当，则液体培养基适合。产品存在情况下计数方法的适用性样品制备制备样品的方法依据于供试品的物理特性。如果证实下述规程无一令人满意，那么必须建立一个适当的可供选择的规程。水溶性产品将供试品溶解或稀释（通常1比10倍制备稀释液）于pH的氯化钠-蛋白胨缓冲液或pH 7

16、.2的磷酸盐缓冲液或大豆-酪蛋白消化肉汤中。如果有必要，将pH值调整到6到8。必要时，用同样的稀释液进一步稀释。不溶于水的非脂肪产品将供试品（通常1比10倍制备稀释液）悬浮于pH的氯化钠-蛋白胨缓冲液或pH 7.2的磷酸盐缓冲液或大豆-酪蛋白消化肉汤中。可加入表面活性剂，如1 g/L的聚山梨醇酯80来促进溶湿差的物质悬浮。如有必要，将pH值调整到6到8。必要时，用同样的稀释液进一步稀释。脂肪产品将其溶解于已过滤灭菌的十四酸异丙酯中，或将供试品和最小必需量的无菌聚山梨醇酯80或其它非抑制性无菌表面活性剂混合，如需加热，不要超过40°，特殊情况下不超过45°。小心混合，必要时可

17、在水浴中保持温度。将足量已加热的精选稀释剂加入其中，制成原始产品1比10倍的稀释液。小心混合，维持温度以缩短形成乳浊液的必要时间。可以用所选择的稀释剂（含有适当浓度的无菌聚山梨醇酯80或其它非抑制性无菌表面活性剂）来制备另外的10倍系列稀释的稀释液。烟雾剂中的液体或固体将产品无菌转移到一个膜过滤器或无菌容器中以备进一步取样。使用每个试验容器中的总内含物或规定的剂量。透皮贴剂取下透皮贴剂的保护盖片（“释放背衬”），将它们粘面向上放到无菌玻璃或塑料托盘上。用适当的无菌多孔材料（如无菌纱布）盖在粘面上，防止多片粘在一起，将其移入所选的含有如聚山梨醇酯80和/或卵磷脂之类灭活剂的适量稀释剂中。剧烈摇晃

18、制备品至少30分钟。接种与稀释将足够体积的微生物悬液加入到如上述制备的样品和对照（不含试验材料）中制成不大于100cfu的接种物。接种悬浮液的体积应当不超过稀释后产品体积的1%。为了证明从产品中回收微生物的可接受性，必须用制备样品中可能低的稀释因子进行试验。由于抑菌活性或可溶性差而不可能时，必须开发更加适当的方案。如果样品中的生长抑制性无法避免，那么可在中和、过滤或稀释后加入部分微生物悬浮液。抑菌活性的中和/去除将按接种和稀释中所述规程稀释并按在产品存在情况下的微生物回收中所述规程接种制备的样品中回收的微生物数量，和从对照制备品中回收的微生物数量做比较。如果生长受到抑制（由一个因子大于2引起减

19、少），那么修正特定的计数试验规程以确保结果的可靠性。比如，修正规程可能包括：(1) An increase in the volume of the diluent or culture medium; 增加稀释剂或培养基的体积；(2) Incorporation of a specific or general neutralizing agents into the diluent; 在稀释剂中加入特定或通用中和剂；(3) Membrane filtration; or 薄膜过滤；或(4) A combination of the above measures. 联合上述措施中和剂中和剂可

20、以用来中和抗菌剂的活性（见表2）。最好能在灭菌前将其加到所选的稀释剂或培养基中。如果使用它们，必须进行一个有中和剂无产品的空白试验来证明其对微生物的有效性和无毒性。表2. 干扰物的常用中和剂/中和方法Interfering Substance干扰物Potential Neutralizing Agents/Method可能的中和剂/方法Glutaraldehyde, mercurials戊二醛，汞Sodium hydrogen sulfite (Sodium bisulfite)亚硫酸氢钠（亚硫酸氢钠）Phenolics, alcohol, aldehydes, sorbate酚、醇、醛、山梨

21、酸酯Dilution稀释Aldehydes醛Glycine甘氨酸Quaternary ammonium compounds (QACs), parahydroxybenzoates (parabens), bis-biguanides季铵化合物（OACs），对羟苯甲酸（对羟苯甲酸脂），二双胍Lecithin卵磷脂QACs, iodine, parabensOACs，碘，对羟苯甲酸脂Polysorbate聚山梨醇酯Mercurials汞Thioglycollate硫酸乙醇酸盐Mercurials, halogens, aldehydes汞，卤素，醛Thiosulfate硫带硫酸盐EDTA (ed

22、etate)EDTA（乙二胺四乙酸盐）Mg or Ca ions镁或钙离子如果没找到适当的中和方法，那么可假定分离微生物失败的原因是由于产品的抗菌活性。此信息可以说明本品或许没有被给出类型的微生物污染。但是，也有可能是产品仅抑制此处说明的某些微生物，但是并不抑制其它菌株，而这些菌株并不包括在试验菌株。那么，则用与微生物生长和规定的验收标准相容的最高稀释因子进行试验。药品中微生物的回收对列出的每种微生物进行分离试验。只对所加的试验菌株进行计数。薄膜过滤使用标称孔径不超过0.45 um的薄膜过滤器。选择过滤材质的类型，其截留细菌能力应不被供试品的组份所影响。对于列出的每种微生物，使用一个薄膜过滤器

23、。将按样品的制备、接种与稀释和抑菌活性的中和/去除所述制备的适量样品移入薄膜过滤器中，立即过滤，并用适当体积的稀释剂冲洗薄膜过滤器。为了确定好氧微生物的总数（TAMC），将薄膜过滤器的移到大豆-酪蛋白消化琼脂表面上。为了确定酵母菌和霉菌总数（TYMC），将薄膜转移到沙氏葡萄糖琼脂表面上。按表1所述培养平板，进行计数。平板计数法对每种培养基执行平板计数法时至少重复一次，使用平均计数结果。 平板计数法在直径9cm的培养皿中，加入按照样品的制备、接种与稀释和抑菌活性的中和/去除所述制备的样品1mL，以及15到20mL的大豆-酪蛋白消化琼脂或沙氏葡萄糖琼脂，保持两种培养基温度均不超过45°。

24、如果使用更大的培养皿，则相应增加培养基的量。对于表1中列出的各种微生物，至少使用两个培养皿。按表1所述培养平板。采用每种培养基计数的算数平均值，并计算原始接种物的cfu数。表面铺展法对于直径9cm的培养皿，在每个培养皿加入约45°的15到20mL的大豆-酪蛋白消化琼脂或沙氏葡萄糖琼脂，使其凝固。如果使用更大的培养皿，相应增加琼脂的量。在层流柜或培养箱中使平板干燥。表1中列出的每种微生物，至少用两个培养皿。将已测体积，不少于0.1mL的样品铺展到培养基表面上，样品是按照样品的制备、接种与稀释和抑菌活性的中和/去除所述制备的。按倾注培养法所述培养并计数。最大机率（MPN）法MPN法的精密

25、度和准确性要比薄膜过滤法或平板计数法低。计霉菌数得到的结果尤其不可信。因此，保留MPN法仅在无其它可用方法时对TAMC计数。如果所用方法判定，按如下进行。制备一系列，至少三个10倍系列稀释的按照样品的制备、接种与稀释和抑菌活性的中和/去除所述制备的样品。从每个级别的稀释液中，取1g或1mL接种到三个含有9到10mL的大豆-酪蛋白消化肉汤的试管中。如有必要，可以在培养基中加入类似聚山梨醇酯80的表面活性剂或抑菌因子灭活剂。因此，如果制备了三个稀释度，就要接种9个试管。所有试管在30° 到35°培养不超过3天。如果由于供试品特性而导致读出结果困难或不确定，则在同种肉汤或大豆-酪

26、蛋白消化琼脂上以相同的温度再次培养1到2天，并使用此次结果。从表3中，确定每克或每毫升供试品中微生物的最可能数。表3 . 微生物的最可能数值Observed Combinations of Numbers of Tubes Showing Growth in Each Set 观察到的各组合中显示生长的试管数MPN per g or per mL of Product 每g或每mL产品的MPN95% Confidence Limits 95%的置信度Number of g or mL of Product per Tube每管产品的g或mL数 0.1 0.01 0.001 0 0 0 <

27、3 0-9.4 0 0 1 3 0.1-9.5 0 1 0 3 0.1-10 0 1 1 6.1 1.2-17 0 2 0 6.2 1.2-17 0 3 0 9.4 3.5-35 1 0 0 3.6 0.2-17 1 0 1 7.2 1.2-17 1 0 2 11 4-35 1 1 0 7.4 1.3-20 1 1 1 11 4-35 1 2 0 11 4-35 1 2 1 15 5-38 1 3 0 16 5-38 2 0 0 9.2 1.5-35 2 0 1 14 4-35 2 0 2 20 5-38 2 1 0 15 4-38 2 1 1 20 5-38 2 1 2 27 9-94 2

28、2 0 21 5-40 2 2 1 28 9-94 2 2 2 35 9-94 2 3 0 29 9-94 2 3 1 36 9-94 3 0 0 23 5-94 3 0 1 38 9-104 3 0 2 64 16-181 3 1 0 43 9-181 3 1 1 75 17-199 3 1 2 120 30-360 3 1 3 160 30-380 3 2 0 93 18-360 3 2 1 150 30-380 3 2 2 210 30-400 3 2 3 290 90-990 3 3 0 240 40-990 3 3 1 460 90-1980 3 3 2 1100 200-4000

29、3 3 3 > 1100 结果和判定验证薄膜过滤法或平板计数法的适用性时，任何试验菌计数的平均值与接种与稀释中定义的不含产品的对照值不得有大于2的差值。验证MPN法的适用性时，接种物的计算值必须在用对照得到结果的置信限度的95%内。如果用所述任一方法检测的多个微生物中有一个达不到以上标准，那么使用更接近于标准的方法和试验条件来测试产品。产品检测用于试验的数量除非特别指定，否则取10或10mL供试品按上面所述小心进行检测。对于烟雾剂中的液体或固体，抽取10个包装的样品。对于透皮贴剂，取10贴样品。对于将在下述条件下按配方制造的活性成分，试验量可以减少：每个剂量单位（如片剂、胶囊、注射剂）中

30、（活性成分）的数量小于或等于1mg的，或者每g或每ml（对于不用剂量单位表示的制剂）的量小于1mg。在这些情况下，检测样品的量不能小于10个剂量单位，或10g或10mL的产品。在样品量有限或批量非常小（例如小于1000mL或1000g）时，用作活性成分的物质的试验量应当是批量的1%，除非规定或者经过证明和批准用更少的量。对于一批总数小于200的产品（如，用于临床试验的样品），取样量可以减少到2个单位，数量少于100的可为1个单位。从散装物料或制剂的可用容器中随机抽取样品。为了获得必需的量，可以将足够数容器的内含物混合以提供样品。产品检查薄膜过滤使用一硝化装置，其设计允许过滤器转移到培养基上。用

31、适当的方法来制备样品，此方法在促生长实验和计数方法的适用性中已被证明其适用性，转移适量到每个膜过滤器上，并立即过滤。遵循适当规程清洗每个过滤器。测定TAMC时，将一个薄膜过滤器转移到大豆-酪蛋白消化琼脂上面。测定TYMC时，将另一个薄膜转移到沙氏葡萄糖琼脂上面。在30° 到 35°培养大豆-酪蛋白消化琼脂平板3到5天，在20° 到 25°培养沙氏葡萄糖琼脂平板5到7天。计算每g或每mL产品的cfu数。检查透皮贴剂时，分别用两个无菌过滤膜过滤10%的样品制备所述的制备品。将一片薄膜转移到大豆-酪蛋白消化琼脂上计算TAMC，另一片转移到沙氏葡萄糖琼脂上计算TYMC。平板计数法倾注平板法用适当的方法来制备样品，此方法在促生长实验和计数方法的适用性中已被证明其适用性。每种培养基每个稀释度至少制备2个培养皿。在30° 到 35°