动物细胞生物反应器关键技术研究及其结构优化

1、国内图书分类号:TP271.3 学校代码: 10213 国际图书分类号:621.22 密级:公开工学博士学位论文动物细胞生物反应器关键技术研究及其结构优化博士研究生:周志玮导师:王扬教授副导师宋博岩副教授申请学位:工学博士学科:机械制造及其自动化所在单位:机电工程学院答辩日期:2012年7月授予学位单位:哈尔滨工业大学Classified Index: TP271.3Dissertation for the Doctoral Degree in EngineeringANIMAL CELL BIOREACTOR KEY TECHNOLOGY RESEARCH AND STRUCTUREOPTI

2、MIZATIONCandidate: Zhou ZhiweiSupervisor:Prof. Wang YangAssistant Supervisor: A.Prof. Song BoyanAcademic Degree Applied for:Doctor of EngineeringSpeciality:Mechanical Manufacturing and AutomationAffiliation: School of Mechatronics Engineering Date of Defence: July, 2012Degree-Conferring-Institution:

3、Harbin Institute of Technology摘要摘要牛顿力学统治了世界几百年,未来生物技术将成为主导21世纪科学技术发展的关键力量。生物反应器是人类进行生物目标产品开发及生产的关键设备。我国在生物反应器的开发研究中存在基础理论研究投入少、细胞的剪切敏感性认知不足、半经验方式设计、反应器效能低下、仿制国外低端产品等问题。针对这些问题,本文从CHO细胞入手,CHO细胞即中国仓鼠卵巢细胞,是动物细胞工程产业应用最为广泛的细胞之一,首先对CHO细胞力学特性进行了研究;以其力学特性为基础分别对生物反应器的搅拌器、罐体结构、温度维持、供料位置进行仿真优化;气泡分布器作为生物反应器中的供氧装

4、置十分关键,但生成的气泡直径不好度量以及破裂过程中高速剪切损伤细胞,通过仿真及实验方法使得这些问题得到很好的解决;本文提出一种新的方法剪切率参量法,在未制造样机的前提下,利用现有设备可以对新研制反应器剪切环境进行验证评价,剪切率参量法验证方法简单可靠,缩短研发周期,节约成本。为了给生物反应器设计提供基础性的依据,借助原子力显微镜,对CHO 细胞进行成像及力学测量,测量得到生理状态CHO细胞的弹性模量为 5.278±0.395kPa,借助数值计算及细胞培养实验分析CHO细胞在生物反应器中的受力环境,得到CHO细胞培养时能够承受的合理的剪切力约为0.392Pa,此时流场剪切率为391.4

5、1(1/s,在此剪切应力作用下对于20µm的细胞来说U方向的最大位移量大约为12.9µm。为反应器的设计中解决流体剪切的问题提供依据。规模化细胞培养生物反应器研发主要需要解决两个关键要素,首先是保证流场混合的均匀性,同时要解决好流场剪切力对细胞的影响,以CHO细胞承受的合理剪切力为参考,在降低流场剪切作用以及满足流场混合效果的前提下,优化后的反应器结构采用45º叶片夹角的Elephant Ear搅拌器,下吸式安装,罐体高径比为1、罐底半径为罐体直径的一半为、搅拌器安装高度与罐体高度比为、挡板数量为3对,此优化结构流场效果最好。细胞培养过程中温度需要严格控制,建立该

6、反应器的温度场仿真模型,对三种供热保温结构进行对比仿真分析,表明当采用整体壁面加热时,反应器内的流体能较快的达到温度均衡。反应器供料位置对物料混合效果影响明显,利用示踪剂法,找到反应器较优的供料位置,缩短混合时间。- I -哈尔滨工业大学工学博士学位论文气泡分布器作为反应器的供氧装置用于生成气泡,在细胞培养过程中气泡在分布器孔口形成上升破裂主要与三个参量有关,通过研究得到了一定范围内气泡平均直径大小与孔口通气速度、表面张力系数和孔口直径之间的关系式。定量角度分析了直径在4mm-10mm范围内变化的气泡破裂过程中产生的在0.97-1.91Pa之间变化,根据CHO细胞的承受的最大剪切力为0.392

7、Pa左右,可知在此范围的气泡破裂过程中均会造成细胞的损伤。而气泡越小,气液表面积比越大,这样反应器内溶氧越好,为了满足细胞培养过程中的溶氧需求,因此气泡直径控制在4mm左右为宜。气泡分布器安装时通气孔离生物反应器底部的距离对气含率的影响不大,大分布环的使得气含率更加均匀,而且大分布环通气结构能有效防止气体直接由搅拌器区直接上升至液面溢出,降低气含率,所以实际应用中可以根据需要应尽量选用大分布环气泡分布器。生物反应器设计制造中的需要解决的关键问题之一就是流场混合过程中产生的剪切力对细胞的损伤,反应器研发初期很难对这一问题进行度量验证,一般通过制造样机进行实验验证,一种新的验证方法剪切率参量法应运

8、而生,它可以在现有实验室设备的基础上通过实验和仿真方法,使得这一问题得到解决。针对本论文提出的多项技术,设计了反应器实验系统,利用该实验系统验证了本文提出的剪切率参量法,当采用上通气的情况下,转速为180r/min时,细胞密度增量最大,其主流场区域平均剪切率为14.5,符合本文提出的剪切率参量法的适宜细胞生长的平均剪切率范围11.617.4(1/s;实验系统包括搅拌器、罐体结构、加热保温装置、气泡分布器均采用本文的优化结果,在此结构参数下采用上通气转速在180r/min时可以获得较好的培养效果,当采用下通气转速为80r/min时气泡直径为在48mm范围获得较好的培养效果,其性能与美国NBS商品

9、化生物反应器相近。本文对CHO细胞生物反应器的关键技术进行了研究,得到了CHO细胞的力学特性、反应器结构及其流场效果、气泡分布器结构及气泡生成破裂过程,反应器剪切率参量验证方法等研究成果,为CHO细胞规模培养生物反应器的实用化奠定了基础。关键词:生物反应器;CHO细胞;剪切力;气泡分布器;剪切率参量法- II -AbstractNewtonian mechanics has ruled the world for hundreds of years; biotechnology will become a pivotal force in leading the development of

10、science and technology in the 21st century. And bioreactor is the key device for human to produce and develop the biologic target products. China has many problems in the development of bioreactor, such as less investment in basic theoretical research, cognitive deficiency on cells shear sensitivity

11、, semi-empirical method design, low efficiency reactor, foreign low-end products imitation, etc. CHO cells, also known as Chinese hamster ovary cells, are one of the most widely used cells in the animal cell engineering. For these problems, the dissertation studied the mechanical characters of CHO c

12、ells from the basis; simulation optimized bioreactors stirrer, tank structure, temperature maintenance and feeding mode. The bubble distributor is critical as the supply of oxygen in the bioreactor device, however, the generated bubble diameter is hard to measure and the high-speed shear can damage

13、cells in the process of rupture. Thus, these problems can be solved well through simulation and experiments. The dissertation put forward a new method- Shear Rate Parameter Method (SRPM. It uses existing equipment to verify and evaluate the reactors newly developed shear environment in the precondit

14、ion of non-manufacturing mockup. The SRPM is simple and reliable; it not only shortens the development cycle, but saves cost.In order to provide the fundamental basis for bioreactor design, it applies atomic force microscope to have imaging and mechanical measurement on CHO cells. The measured modul

15、us of elasticity of physiological state CHO cells is 5.278±0.395kPa. With the numerical calculation and cell culture experiments, to analyze the force environment of CHO cells in the bioreactor. It shows that the CHO cells can endure the reasonable shear force is approximately 0.392Pa, meanwhil

16、e, the shearing rate of flow field is 391.41(1/s, the maximum displacement of U-direction for 20µm cell under such shear force is 12.9µm. Thus, it offers the basis for the problems solving of fluid shear in the bioreactor design.The homogenization of mixed flow fields and the stirring shea

17、r force in bioreactor are the two key factors in process of the cell scale culture. Based on the- III -CHO cells enduring reasonable shear force, in the condition of reducing flow filed shear force and satisfying mixed effect, the flow field effect of optimizing structure is the best, when bioreacto

18、r adopts the Elephant Ear stirrer with 45º blade included angle by downdraft installation, the tank high-diameter ratio H/T=1, the radium of the tank bottom, the installation height of stirrer C/H=1/3 and the number of baffle is 3 pairs. Temperature in the cell culture process requires strict c

19、ontrol. It builds the bioreactors simulation model of temperature field aiming to have comparative simulation analyzing for the three heating structure. It indicates that when the overall wall heating, the fluid within the reactor can be faster to reach temperature equilibrium. The bioreactor feedin

20、g position has an obvious influence on material mixed effect. It can use tracer method to find better feeding position of the reactor as well as to shorten the mixing time.The bubble distributor as the oxygen supply device of the reactor used to generate bubble. In process of the cell culture, bubbl

21、e at reactor orifices from rising to bursting is concerned with three parameters. Study supports, within a certain range, the relation between bubbles average d iameter and orifice ventilation speed, surface coefficient of tension and orifice diameter. It analyzes from the quantitative angle, the pr

22、oduced in the process of bursting with bubble diameters from 4mm-10mm varies from 0.97-1.91Pa. It is clear that cell damage happens in the process in terms of the maximum shear force the CHO cell enduring is about 0.392Pa. However, the smaller the bubble, the higher the gas-liquid surface area ratio

23、 and the better the dissolved oxygen in the reactor, in order to meet the dissolved oxygen requirements in the process of cell culture, the bubble diameter should be controlled at about 4mm. During the bubble distributor installation, the distance from orifice to bottom of the bioreactor has little

24、effect on gas holdup. And bubble distributor with larger distribution ring can balance gas holdup better. Moreover, large distribution ring ventilation structure can effectively prevent the gas overflowing from the area of stirrer raise directly up to the fluid level. It decreases gas holdup; thus,

25、try to choose the large bubble distributor as required in practical application.One of the key problems needs to be solved in bioreactor design and manufacture is the damage caused by shear force to cell in the process of flow fields mixed. It is hard to measure and verify the problem at the early s

26、tage of the bioreactors research and development It normally uses mockup to experiment A new verification method is developed, namely, shear rate parameter method. It can- IV -solve the problem through experiments and simulation based on the existing equipments. The dissertation presented a number o

27、f techniques, designed reactor experiment system and verified the SRPM by it. When adopt upper ventilation and rotate speed is 180r/min, the increment of cell density is the maximum, meanwhile, the average shear rate in main flow field is 14.5. It fits the appropriate cell growth shear rate range fr

28、om 11.6-17.4(1/s presented in the SRPM. The stirrer, tank structure, heating insulation device in the experiment system all use the optimization results. It can get better culture effect with such structural parameters when adopts upper ventilation and rotate speed is 180r/min. It also can get bette

29、r culture effect when the bubble diameter is 4-8mm, the rotate speed is 80r/min and ventilate down. The experiment system and commercialization bioreactor have similar performance.The dissertation studied the key technology of CHO cell bioreactor; the major findings including the mechanical characte

30、rs of CHO cell, bioreactor structure and the effect of flow field in bioreactor, bubble distributor structure and the process of its generation to rupture, verification methods for SRPM in bioreactor, etc, which laid a foundation for the practicality of CHO cell scale culture bioreactor.Keywords: Bi

31、oreactor, CHO cell, Shear Force, Bubble Distributor,Shear Rate Parameter Method- V -目录摘要 . I Abstract . I II 第1章绪论 . (11.1 引言 (11.2 搅拌式生物反应器研究概述 (21.3 反应器流场环境的研究概述 (71.4 计算流体力学在反应器研究中的应用 (151.5 AFM在细胞力学特性研究中的应用 (171.6 课题来源及研究的目的和意义 (191.7 课题研究的主要内容 (19第2章CHO细胞力学特性的研究 (212.1 引言 (212.2 实验设备及样品制备 (212.

32、3 CHO细胞成像及力曲线测定 (242.4 运动流场CHO细胞剪应力分析 (30- VI -2.5 本章小结 (34第3章生物反应器结构及其流场的研究 (363.1 引言 (363.2 搅拌器及罐体优化 (363.3 供热保温方式 (473.4 供料位置优化 (523.5 本章小结 (54第4章气泡生成破裂及分布器结构的研究 (554.1 引言 (554.2 气泡生成 (554.3 气泡破裂与剪切 (634.4 气泡分布器结构 (684.5 本章小结 (70第5章生物反应器实验验证 (725.1 引言 (725.2 生物反应器验证方法 (72- VII -5.3 反应器关键技术验证 (785

33、.4 本章小结 (86结论 (88参考文献 (90附录 (105攻读博士学位期间发表的论文及其它成果 (106哈尔滨工业大学博士学位论文原创性声明 (107哈尔滨工业大学博士学位论文使用授权书 (107致谢 (108个人简历 (110- VIII -哈尔滨工业大学工学博士学位论文ContentsAbstract (In Chinese . I Abstract (In English . I II Chapter 1 Introduction (11.1 Introduction (11.2 Overview of Stirred Tank Bioreactor (21.3 Overview

34、of Bioreactor Flow Field Environment (71.4 Application of Computational Fluid Dynamics in the Reactor (151.5 Application of AFM in the Study of Cell Mechanical Properties (171.6 Source, significance and objective of the dissertation (191.7 Main contents of the dissertation (19Chapter 2 Research on t

35、he CHO Cell Mechanical Properties (212.1 Introduction (212.2 Laboratory Equipment and Sample Preparation (212.3 CHO Cell Imaging and Force Curve Determination (242.4 Analysis of Movement Flow Field CHO Cell Shear Force (30- IX -2.5 Summary (34Chapter 3 Study of Reactor Structure and Flow Field (363.

36、1 Introduction (363.2 Stirrer and Tank Optimization (363.3 Heating and Insulation Method (473.4 Feeding Optimization (523.5 Summary (54Chapter 4 Research on Bubble Formation Rupture and Distributor Structure (554.1 Introduction (554.2 Bubbles Formation (554.3 Bubble Rupture and Shear (634.4 Bubble D

37、istributor Structure (684.5 Summary (70Chapter 5 Bioreactor Experiment Research (725.1 Introduction (725.2 Bioreactor Validation Method (72- X -哈尔滨工业大学工学博士学位论文5.3 Bioreactor Key Technology Verification (785.4 Summary (86Conclusions (88References (90Appendix (105Papers published and other achievement

38、s in the period of Ph. D. education (106Statement of copyright (107Letter of authorization (107Acknowledgements (108Resume (110- XI -第1章绪论第1章绪论1.1引言随着科学技术的发展,人们越来越多地采用多学科交叉的方法来研究解决各种实际中遇到的问题,这样随着研究的深入出现了综合性学科,并最终形成具有独特概念和方法的新的学科领域1, 2。生物科技就是在这种背景下产生的一门综合性的新兴学科,生物科技的相关产业也将会成为二十一世纪的支柱产业3-6。生物科技作为一种新兴的

39、技术,发展到当前主要包括基因工程技术、发酵工程、细胞工程、酶工程以及蛋白质工程等。这些工程技术无论从技术研究到最后的规模生产都将涉及到细胞代谢与细胞培养7-10。其中涉及到细胞培养的关键设备生物反应器的研究已成为生物科技中重要的核心技术之一11, 12。生物反应器结构形式多样,主要有搅拌式、气升式、中空纤维管、激流式等形式的生物反应器13。其中气升式生物反应器主要是通过大量向培养环境中鼓泡来达到物质混合的目的,这种类型的反应器大多应用于需氧量比较大剪切不敏感的培养环境,不是特别适合动物细胞的培养14-16;中空纤维管生物反应器主要应用于实验研究,它是通过模拟生物本体环境,其中空纤维是一种细微的

40、管状结构,管壁为极薄的半透膜,培养时纤维管内通入培养基,细胞生长在纤维管的外壁,营养物质通过纤维管半透膜从管内渗透出来供细胞生长,它的优点是培养细胞密度极高,但是中空纤维管制备困难,难以重复利用,不是于大规模生产17, 18;激流式生物反应器是通过将培养罐体固定在摇床上,通过摇床的偏心旋转来达到物质混合的目的,这种反应器流场剪切力环境温和,但是由于摇床混合时的能耗较大,规模化培养放大困难19, 20;搅拌式生物反应器是当前动物细胞规模培养普遍采用的的结构形式,国外许多研究机构及公司均以搅拌式结构为基础,展开适合规模化生产需求的动物细胞培养生物反应器研究21-23。细胞规模化培养技术在我国还处于

41、起步阶段是我国生物科技方面最薄弱的技术环节,与西方发达国家差距很大24。生物反应器是模拟生物的体内环境,利用酶或生物体的生物方面的功能,在体外进行生物培养的系统。它是一个集机械、流体、控制、生物等多学科的高新技术产品,具有很强的专业性,科技- 1 -含量高25。我国生物反应器相关研究严重滞后,相关制造企业与西方发达国家相比起步较晚,缺乏对反应器内的细胞剪切、流场混合等基础性理论必要的研究,多数企业主要依靠仿制先进国家低端产品为主,自主设计的产品也主要依靠半经验化设计,研发投入严重不足,这类产品也主要以低端产品为主,目前国内的高中端生物反应器产品市场几乎完全被国外生物反应器制造企业所占领3, 6

42、, 26。由此可见,当前我国发展自有知识产权生物反应器已然非常迫切,这就需要我国的科研人员迅速投入到生物反应器相关基础技术的研究中去。随着生物技术产业化的发展,出于不同的目的,在不同系统中表达各种重组蛋白需求很大,特别是用于治疗时,可能需要成吨的产量规模。由于动物细胞的重组蛋白更加利于人体吸收,但是动物细胞没有细胞壁,只有一层细胞膜保护,抗剪切力能力低,对外部环境要求严苛,所以研究动物细胞生物反应器相关技术显得非常迫切,CHO(中国仓鼠卵巢细胞是动物细胞里用得最多的基因工程主细胞,1957年建株,上皮细胞型,一般需要贴壁生长,但并不严格,控制的好可以悬浮培养。动物细胞的规模化培养作为现代生物技

43、术体系中的一项重要技术,是实现生物技术向产业化转化的关键技术27,本文以CHO细胞为基础,来研究动物细胞生物反应器设计及其相关技术。本章结合本文的研究背景和内容,首先介绍搅拌式生物反应器的研究现状和发展趋势,然后介绍生物反应器物料的传递与混合,再论述物料混合的基础上探讨细胞损伤的来源,然后对本课题应用的相关技术现状进行概述,最后介绍课题的来源、意义和主要研究内容。1.2搅拌式生物反应器研究概述当前国外生物反应器的设计制造销售已经完全实现产业化,规模日新月异,适合各类生物培养的商品化生物反应器门类齐全。美国属于生物反应器研究的先行者,持续保持世界生物反应器设计制造销售领域的领头羊的角色,许多著名

44、高校及国际化公司在生物反应器研制项目中投入巨大,并取得优异的成绩28。美国NBS(New Brauswich Scientific它是世界上较早开发出哺乳动物细- 2 - 3 -填充床反应器29。其生物反应器产品涵盖了CO2培养箱,实验室规模以及600L 以上的生产规模生物反应器如图1-1,其代表性的系列产品有CelliGen BLU 系列(容量为5L ,14L 、BioFlo/CelliGen 115系列(容量为1.3-14L 、CelliGen 310系列(容量为2.5-14L 、CelliGen 510系列(容量为19.5L ,40L 、BioFlo Pro 系列(容量为75-650L

45、等。其中CelliGen BLU 系列主要突出了一次性技术的使用, 结合所有一次性使用技术的便利性及可靠性,用户可以不用考虑使用后消毒清理等工作,其高级流程控制系统和可称量的搅拌罐设计,是科研用户的理想选择。BioFlo/CelliGen 115系列如图1-1(a 是一款操作简易的入门级生物反应系统,是一类多用途的生物反应器,反应器的结构配置可以根据需要自由配置,不仅使用在微生物的发酵而且可作为哺乳类及动物细胞的培养。只需一个主控制台就可以操控多达三个独立罐体,因此多被前期研发的实验室、高校教学及检验中心等科研人员所使用。CelliGen 310系列如图1-1(b 能够经过高压灭菌后重复使用的

46、高性能生物反应器,由于可调节的参量多,用户可以不受约束进行实验研究。CelliGen 510系列如图1-1(c 虽然培养容量增大,但是应用了模块化的设计,使得反应器的功能应用上更具弹性。BioFlo Pro 系列如图1-1(d 具有CelliGen 510系列模块化的优点,容量增大主要应用于产业规模的细胞培养30, 31。a CelliGen115 b CelliGen 310 c CelliGen 510d BioFlo Pro图1-1美国新布朗斯威克系列产品Fig. 1-1New Brauswich Scientific series of products 美国惠顿(Wheaton公司是

47、美国另外一家世界著名的实验器材公司,它的产品涉及的面很广,但主要以生物技术方面为主,主要有医药领域、细胞培养领域、食品发酵领域以及环境监测等32,在细胞培养方面主要产品包括各类生物反应器如图1-2,图1-2(a为该公司10L Mini-Pilot Plant 细胞培养系统,通过Control Tower 控制单元可以控制温度,pH 和溶解氧;支持单元包括一个加热/泵单元和一个四气体混合单元;10L 的培养罐带有六个侧臂,含温度、PH 和溶解氧传感器,气泡分布器,加热套,过滤器和1L 的试剂瓶(储存碱液。该套设备的配有一个标准电极适配器(最多配7个。同系列还提供19L ,45L 的细胞培养系统。

48、图2(b 为该公司的细胞培养优化系统,是一个套装型- 4 -小量细胞培养系统。该系统可以快速精确测定细胞生长的最适条件参数。培养瓶有250 mL 、500 mL 、1 L 及3L 四种工作体积,内置搅拌器,带3个侧臂。a 10L Mini-Pilot Plant 细胞培养系统 b 小量细胞培养生物反应器图1-2 Wheaton 公司系列产品欧洲在生物领域的研究一直领先,其在生物反应器的研究方面投入很大,在多个国家及地区发展壮大了一大批专业的生物反应器研发及制造公司。瑞士的比欧生物工程 (Bioengineering AG 33公司是专业制造实验研究到生产规模的生物反应器系统,能提供从实验研究到

49、产业规模生产的特大系统;在哺乳动物细胞培养方面已经为国际著名制药企业Novartis (诺华制药设计制造了15立方米的哺乳动物细胞培养系统,这是目前世界该领域最大规模系统之一。如图1-3(a 为瑞士比欧L1523反应器可以进行微生物发酵及动物植物细胞培养,容量可以选择5.5升到19升,图1-3(b 为瑞士比欧NLF 系列也应用于微生物发酵及动物/植物细胞培养,可选择的容量从19L 到30L 26, 34。a 瑞士比欧L1523系列 b 瑞士比欧NLF 系列图1-3瑞士比欧系列产品Fig. 1-3 Bioengineering AG series of products 德国贝朗(B.Braun

50、国际生物工程公司是全球著名的发酵罐专业生产厂商, 主要提供各种微生物发酵、动植物细胞培养系统,主要产品包含从实验室到中试规模的全系列的细胞培养生物反应器及微生物发酵罐。图1-4为该公司BIOSTAT B-DCU II反应器,属于设计紧凑的高质量的实验室规模台式生物反应器26。 图1-4 BIOSTAT B-DCU II反应器Fig. 1-4 BIOSTAT B-DCU II reactor由于欧洲在生物技术领域的的投入巨大,比起亚洲国家起步较早,这一地区在生物反应器的研究水平不管是基础理论还是设计制造都属于领先地位。生物反应器的设计制造在亚洲起步较晚,生物反应器的研发及制造商也主要集中在日本和

51、韩国。日本丸菱以及日本东京理化器械提供各种型号的发酵系统。韩国发酵机株式会社可根据需要提供不同性能不同类型的发酵罐35,从实验室用2.5L到大规模生产用105L发酵罐,图1-5 该公司KF系列发酵罐。 图1-5韩国发酵机株式会社KF系列发酵罐Fig. 1-5 South Korea fermentation machine corporation KF series目前我国规模动物细胞培养技术还比较落后,产业化的动物细胞反应器技- 5 -术研究还不全面,一般反应器制造企业以仿制国外低端产品为主,缺乏自主知识产权的反应器设计的理论研究,到目前为止还没有达到规模化的生产36, 37。生物反应器研发

52、可以划分为以下几个技术阶段,早期的生物反应器主要以发酵培养为主,如啤酒酿造等;接着人们逐渐掌握微生物反应器的设计,它的技术难点主要是解决高效混合与传氧;随着科学技术的发展,由于动植物细胞培养技术发展成熟,适合动植物细胞培养的生物反应器也研制成功,特别是适用于动物细胞培养的生物反应器相比发酵罐、细菌罐具有更高的技术含量,它不但需要有较好的溶氧、混合效果,还具有低剪切的流场环境以及精确的控制系统9, 38, 39。国外对于规模化动物细胞培养用生物反应器的相关关键技术严禁出口,这样造成许多制药企业进行生产时多采用产能低下的中低端小体积生物反应器,对于规模化生产的动物细胞生物反应器国内几乎是空白,这样

53、不但增加了制药企业的生产成本,而且使得生产小批量化,不同批次间质量不好控制。国内生产的生物反应器主要是以模仿国外同类低端产品为主,对于高端产品特别是产业化规模的动物细胞生物反应器几乎是空白3, 40, 41。华东理工大学生物反应器国家重点实验室也展开了对动物细胞生物反应器的研究工作,华东理工大学张嗣良教授、谭文松教授对动物细胞大规模培养生物反应器开展了研究,提出了一些设计规律,张嗣良教授提出了反应器多尺度的研究方法3。华东理工大学与美国联合开展研究,研制了一种激流式动物细胞反应器20,该反应器的罐体底部采用锥体结构,通过在摇床提供动力,如图1-6 所示。可控摇床1.培养液出口2.出口过滤器3.

54、喷雾器4.培养液入口5.入口过滤器6.转子流量计7.空气泵图1-6激流式生物反应器示意图Fig. 1-6 The bottom of the cone biological reactor schemes中科院等有关科研院所也开始对动物细胞培养反应器研究及应用,但基本停留在实验室研究阶段,一直都未能实现商品化生产。哈药集团也展开了激流式生物反应器的研究,开发了6L到300L的系列产品,控制系统采用基于PLC上下位机结构,针对中国仓鼠卵巢细胞培养,- 6 -构建了细胞培养控制系统。该反应器采用电热毯加热保温,液面上通气,摇床提供动力,反应器内部采用一次性生物用塑料袋为细胞生长环境,免去了蒸汽灭菌

55、的复杂程序,而且塑料袋内壁经过特殊处理,可以明显提高整个培养环境的溶氧;但是也存在缺点,动力装置能耗高,当培养容积到达200L以上时,存在放大困难。图1-7为分别为哈药集团开发的6L和300L的激流式生物反应器及其控制系统42。 图1-7哈药集团激流式生物反应器Fig. 1-7 HPGC Stream type bioreactor1.3反应器流场环境的研究概述生物反应器就是模拟生物的体内环境,达到稳定的细胞高密度增长的目的,而且也可以高效地产出目标产物,细胞体外培养的根本方法就是要无限接近模拟细胞生长或繁殖的体内环境。在生物反应器上要模拟体内环境达到细胞的自然生长,可以控制的参数主要有:pH

56、值、温度、溶氧(DO、培养基的流变性、力学环境、场效应、以及其他营养物或代谢产物的浓度等43, 44。其力学环境的构成因素最为复杂,另外细胞反应是对温度变化十分敏感的放热反应。因此,生物反应器的设计对温度控制的要求也较高45。特别是随着反应器体积的增大,其热量传递和温度控制将成为反应器设计的一项重要内容。生物反应器内的流体动力主要由搅拌器、通气用的气泡分布器等装置提供,而温度环境的控制就需要综合考虑46, 47,现本文对它们的研究现状进行分别综述。搅拌式生物反应器内影响细胞培养的一个关键因素是反应器内流体混合的不均匀性。随着反应器罐体尺寸的改变,反应器内部的流体环境的力学性能以及营养物质的混合的均匀性也发生随着改变。营养物浓度、流体混合强度等在- 7 -反应器内不同位置就会存在较大差别。现今工业级的细胞培养都是基于搅拌悬浮式的培养,培养基的液体动力主要由搅拌器提供,然而动物细胞只有一层很薄的细胞膜保护,对施加在其上面的力非常敏感,这样对于搅拌式生物反应器中搅拌器的研究就显得非常重要了12, 34, 48。反应器的混合过程是一个多尺度上同时进行的过程,