免疫学技术在科研中的应用

1、免疫学技术在科研免疫学技术在科研中的应用中的应用 概概 述述免疫学技术发展进程的主要阶段免疫学技术发展进程的主要阶段自然自然的肉眼观察的抗原抗体反应（沉淀反应、凝集反应）的肉眼观察的抗原抗体反应（沉淀反应、凝集反应）加速加速的肉眼观察的抗原抗体反应（电泳技术、分离技术）的肉眼观察的抗原抗体反应（电泳技术、分离技术）标记性标记性免疫技术提高抗原抗体反应的特异性、敏感性免疫技术提高抗原抗体反应的特异性、敏感性半自动、自动半自动、自动化检验仪器与免疫反应原理结合，加快了化检验仪器与免疫反应原理结合，加快了反应过程反应过程标记技术、单克隆技术、高智能自动化技术的标记技术、单克隆技术、高智能自动化技术的

2、最佳组合最佳组合免疫细胞相关实验技术：免疫细胞相关实验技术：单核巨噬细胞、树突状细胞、单核巨噬细胞、树突状细胞、NKNK细胞、细胞、T T细胞、细胞、B B细胞，细胞，以及这些细胞亚群；以及这些细胞亚群；免疫分子相关实验技术：免疫分子相关实验技术：抗原（包括抗原肽）、抗体（包括单抗、多抗、基因工抗原（包括抗原肽）、抗体（包括单抗、多抗、基因工程抗体）、补体、细胞因子及其受体、程抗体）、补体、细胞因子及其受体、HLAHLA、TLRTLR等；等；免疫学相关标记技术：免疫学相关标记技术：荧光、酶、放射、磁珠标记技术和发光分析原理；荧光、酶、放射、磁珠标记技术和发光分析原理；免疫学相关蛋白质技术：免疫

3、学相关蛋白质技术：蛋白质电泳、印迹技术（如蛋白质电泳、印迹技术（如 SDS-PAGESDS-PAGE、双向电泳、双向电泳、Western Western 印迹和斑点印迹）、免疫共沉淀技术等；印迹和斑点印迹）、免疫共沉淀技术等；免疫学相关检测技术：免疫学相关检测技术：流式细胞分析和分选技术、细胞凋亡和细胞周期检测技术、流式细胞分析和分选技术、细胞凋亡和细胞周期检测技术、免疫组织化学技术、免疫细胞信号转导研究技术、激光扫描共聚焦显微镜技术等；免疫组织化学技术、免疫细胞信号转导研究技术、激光扫描共聚焦显微镜技术等；免疫学实验相关动物模型：免疫学实验相关动物模型：自身免疫病动物模型（如自身免疫性脑脊髓

4、炎、自身自身免疫病动物模型（如自身免疫性脑脊髓炎、自身免疫性甲状腺炎、系统性红斑狼疮等）、感染性疾病动物模型（如利什曼原虫、免疫性甲状腺炎、系统性红斑狼疮等）、感染性疾病动物模型（如利什曼原虫、弓形虫、巨细胞病毒、李斯特菌等）、肿瘤动物模型、器官移植动物模型等；弓形虫、巨细胞病毒、李斯特菌等）、肿瘤动物模型、器官移植动物模型等；免疫学技术主要相关内容免疫学技术主要相关内容5免疫的类型免疫的类型固有免疫固有免疫 innate immunity innate immunity 适应性免疫适应性免疫 adaptive immunity adaptive immunityOverview of Imm

5、unity病原微生物病原微生物固有（固有（innate)/innate)/天然天然(natural)(natural)非特异性（非特异性（non-specific)non-specific)免疫免疫（immunityimmunity） * * 种群在长期进化过程中逐渐形种群在长期进化过程中逐渐形成的防御功能，乃经遗传而获得，成的防御功能，乃经遗传而获得，并非针对特定抗原。并非针对特定抗原。固有免疫固有免疫 innate immunity innate immunity机体接受病原体等抗原（决定基）异物刺激后所产生、仅针对相应病原体等抗原机体接受病原体等抗原（决定基）异物刺激后所产生、仅针对相应

6、病原体等抗原异物发挥效应、使之从体内被清除的防御功能。异物发挥效应、使之从体内被清除的防御功能。* * 个体接触特定抗原（决定基）而产生。个体接触特定抗原（决定基）而产生。* * 仅针对该特定抗原（决定基）而发生反应。仅针对该特定抗原（决定基）而发生反应。* * 后天获得；有特异性；有记忆性；作用慢而强。后天获得；有特异性；有记忆性；作用慢而强。 抗原抗原刺激机体刺激机体适应性免疫适应性免疫可刺激机体产生特异性免疫可刺激机体产生特异性免疫应答的物质应答的物质抗原决定簇抗原决定簇产生抗体产生抗体致敏淋巴致敏淋巴细胞细胞适应性免疫（适应性免疫（adaptive immunityadaptive i

7、mmunity）8 固有免疫固有免疫 适应性免疫适应性免疫细胞组成细胞组成 粘膜和上皮细胞、粘膜和上皮细胞、 T T淋巴细胞、淋巴细胞、B B淋巴细胞、淋巴细胞、 吞噬细胞、吞噬细胞、 NK NK细胞、细胞、 抗原提呈细胞抗原提呈细胞 NK1.1 NK1.1+ +T T细胞、细胞、TT细胞细胞 B-1 B-1细胞细胞产生产生 先天具有先天具有 后天经抗原刺激而获得后天经抗原刺激而获得作用时效作用时效 即刻即刻9696小时内小时内 96 96小时后小时后作用特点作用特点 非特异性非特异性 特异性特异性 无增殖分化，作用迅速无增殖分化，作用迅速 特异性细胞克隆增殖、分化特异性细胞克隆增殖、分化 无

8、免疫记忆无免疫记忆 有免疫记忆有免疫记忆作用时间作用时间 作用时间短作用时间短 作用时间长作用时间长固有免疫与适应性免疫的特点固有免疫与适应性免疫的特点OutlinePart I Part I 抗原或抗体的检测抗原或抗体的检测Part II Part II 免疫细胞的检测免疫细胞的检测Part III Part III 自身免疫病及实验研究举例自身免疫病及实验研究举例PartI PartI 抗原或抗体的检测抗原或抗体的检测抗原抗体反应的特点抗原抗体反应的特点抗原抗体反应的影响因素抗原抗体反应的影响因素常用的抗原抗体反应常用的抗原抗体反应11抗原抗体反应的特点抗原抗体反应的特点高度的特异性高度的

9、特异性可逆性可逆性 抗原抗体结合除了空间构象互补外，主要以氢键、静抗原抗体结合除了空间构象互补外，主要以氢键、静电引力、范德华力和疏水键等分子表面的化学基团之电引力、范德华力和疏水键等分子表面的化学基团之间的非共价方式结合。这种非共价键不如共价键结合间的非共价方式结合。这种非共价键不如共价键结合稳定，极易受温度、酸碱度和离子强度的影响而解离。稳定，极易受温度、酸碱度和离子强度的影响而解离。抗原抗体比例影响免疫复合物的大小抗原抗体比例影响免疫复合物的大小抗原抗体反应的两个阶段抗原抗体反应的两个阶段12抗原抗体反应的影响因素抗原抗体反应的影响因素抗原抗体浓度与比例抗原抗体浓度与比例电解质电解质 *

10、 * 抗原抗体特异性结合后，亲水性降低，易受电解抗原抗体特异性结合后，亲水性降低，易受电解 质的影响而使表面失去较多的负电荷。质的影响而使表面失去较多的负电荷。温度温度 * * 适当的温度可增加抗原与抗体分子的碰撞机会，适当的温度可增加抗原与抗体分子的碰撞机会， 加速抗原抗体复合物的形成。加速抗原抗体复合物的形成。酸碱度酸碱度 * * 抗原抗体反应的最适抗原抗体反应的最适pHpH在在6868之间，之间，pHpH过高或过过高或过 低，即过碱或过酸，均可影响抗原、抗体的理化低，即过碱或过酸，均可影响抗原、抗体的理化 性质。性质。13常用的抗原抗体反应常用的抗原抗体反应凝集反应沉淀反应免疫标记技术一

11、、凝集反应一、凝集反应 细菌、螺旋体和红细胞等颗粒抗原，在适当电解细菌、螺旋体和红细胞等颗粒抗原，在适当电解质参与下可直接与相应抗体结合出现凝集，称为凝集反质参与下可直接与相应抗体结合出现凝集，称为凝集反应（应（agglutinationagglutination）是最经典的免疫学检测技术。）是最经典的免疫学检测技术。 直接凝集反应直接凝集反应间接凝集反应间接凝集反应间接凝集抑制试验间接凝集抑制试验微粒捕获酶免疫分析技术微粒捕获酶免疫分析技术间接凝集反应间接凝集反应 将可溶性抗原或抗体吸附在与免疫无关的颗将可溶性抗原或抗体吸附在与免疫无关的颗粒载体上，形成致敏颗粒，再与相应抗体或抗原粒载体上，

12、形成致敏颗粒，再与相应抗体或抗原进行反应产生的凝集反应，称为间接凝集反应。进行反应产生的凝集反应，称为间接凝集反应。 颗粒载体有红细胞、聚苯乙烯乳胶颗粒、活颗粒载体有红细胞、聚苯乙烯乳胶颗粒、活性炭颗粒，而相应的凝集现象分别称为间接血球性炭颗粒，而相应的凝集现象分别称为间接血球凝集、间接乳胶凝集、间接炭粒凝集反应。凝集、间接乳胶凝集、间接炭粒凝集反应。 将已知特异性抗体致敏的免疫微粒与生物将已知特异性抗体致敏的免疫微粒与生物素素亲和素亲和素酶放大系统相结合，最后酶作用于酶放大系统相结合，最后酶作用于荧光底物，使之发荧光，通过检测荧光强度判断荧光底物，使之发荧光，通过检测荧光强度判断待测抗原的含

13、量。待测抗原的含量。 检测肿瘤标记物检测肿瘤标记物CAl99CAl99、CEACEA、CAl25CAl25、AFPAFP、性激素、甲状腺素性激素、甲状腺素T3T4T3T4、叶酸、叶酸、HIVHIV抗体、抗体、HCGHCG等等微量可溶性抗原。微量可溶性抗原。微粒捕获酶免疫分析技术微粒捕获酶免疫分析技术二、沉淀反应二、沉淀反应免疫沉淀反应免疫沉淀反应: (precipitation): (precipitation) 可溶性抗原与相应抗体，在适宜条件下发生结合，出现的沉淀现象。免疫沉淀液体内沉淀反应凝胶内沉淀反应免疫电泳技术免疫浊度技术絮状沉淀试验环状沉淀试验单向扩散试验双向扩散试验免疫电泳对流免

14、疫电泳火箭免疫电泳免疫固定电泳透射免疫比浊 turbidimetermeasure 散射免疫比浊 nephelomitermeasure 20沉淀反应沉淀反应速率散射比浊法免疫比浊法速率散射比浊法免疫比浊法琼脂扩散法琼脂扩散法 单向琼脂扩散单向琼脂扩散 双向琼脂扩散双向琼脂扩散 火箭电泳火箭电泳 对流免疫电泳对流免疫电泳 免疫印迹技术免疫印迹技术速率散射比浊法免疫比浊法速率散射比浊法免疫比浊法将已知抗体与相应抗原在液相中按一定比例混合形成可溶性免疫复合物，这些复合物微小粒子对一定波长的光照射发生散射，可通过光路系统测定光散射(OD)值。抗体含量固定并处于抗体过剩时，免疫复合物的多少直接取决于抗

15、原的浓度，抗原的终浓度通过标准品绘出的标准曲线查出。提高了灵敏度，通过自动化，可同时检测多个样品并进行精确的定量分析。检测前白蛋白、酸性蛋白酶、巨球蛋白、转铁蛋白、尿微量蛋白及IgG、IgM、IgA及补体，药物含量分析。22免疫比浊技术原理免疫比浊技术原理 当当可溶性抗原可溶性抗原与相应抗体特异结合，二者与相应抗体特异结合，二者比例合适比例合适时，时，在在特殊的缓冲液特殊的缓冲液中它们快速形成一定大小的中它们快速形成一定大小的抗原抗体复合抗原抗体复合物物，使反应液体出现，使反应液体出现浊度浊度。利用现代。利用现代光学测量仪器光学测量仪器对浊度对浊度进行测定从而检测抗原含量。进行测定从而检测抗原

16、含量。 检测器检测器光源光源 透镜透镜 滤光片滤光片散射光散射光透射光透射光23原原 理理 将一定量的抗将一定量的抗体混入琼脂凝胶中，体混入琼脂凝胶中，使待测抗原在凝胶使待测抗原在凝胶中自由扩散，与相中自由扩散，与相应抗体结合形成沉应抗体结合形成沉淀环，沉淀环大小淀环，沉淀环大小与抗原浓度呈正相与抗原浓度呈正相关。关。1.1.测定沉淀环直径测定沉淀环直径2.2.在标准曲线上查找相应抗原浓度在标准曲线上查找相应抗原浓度单向琼脂扩散实验单向琼脂扩散实验 （single immunodiffusion） 双向琼脂扩散实验（双向琼脂扩散实验（ double immunodiffusion ）原原 理理

17、 将可溶性抗将可溶性抗原和抗体置于琼原和抗体置于琼脂凝胶板的对应脂凝胶板的对应孔中，两者各自孔中，两者各自在凝胶中向四周在凝胶中向四周自由扩散，当抗自由扩散，当抗原与抗体相遇，原与抗体相遇，在比例合适时形在比例合适时形成沉淀线。成沉淀线。火箭免疫电泳火箭免疫电泳（rocket immunoelectrophoresis）原原 理理 是将单向扩散与电泳是将单向扩散与电泳技术相结合的一种方法。技术相结合的一种方法。将含有已知抗体的琼脂制将含有已知抗体的琼脂制成琼脂板。待检样品加入成琼脂板。待检样品加入阴极侧进行电泳。抗原带阴极侧进行电泳。抗原带负电荷向阳极移动，并与负电荷向阳极移动，并与抗体结合。

18、在抗原、抗体抗体结合。在抗原、抗体比例适当部位形成锥形沉比例适当部位形成锥形沉淀峰，该峰的高度与抗原淀峰，该峰的高度与抗原量成正比。可快速测出标量成正比。可快速测出标本中抗原的含量。本中抗原的含量。对流免疫电泳对流免疫电泳（counter immunoelectrophoresis）原原 理理 是将双向扩散与是将双向扩散与电泳技术相结合的一电泳技术相结合的一种方法。将抗原和抗种方法。将抗原和抗体在琼脂凝胶孔中电体在琼脂凝胶孔中电泳，带负电荷的抗原泳，带负电荷的抗原向正极运动，带正电向正极运动，带正电荷的抗体向负极运动，荷的抗体向负极运动，二者在琼脂凝胶中相二者在琼脂凝胶中相互作用而形成沉淀线。

19、互作用而形成沉淀线。免疫印迹技术免疫印迹技术 蛋白免疫印迹杂交（蛋白免疫印迹杂交（Western BlotWestern Blot，WB WB ）是将蛋白样）是将蛋白样本通过聚丙烯酰胺电泳按分子量大小分离，再转移到杂交本通过聚丙烯酰胺电泳按分子量大小分离，再转移到杂交膜上，然后通过一抗膜上，然后通过一抗/ /二抗复合物对靶蛋白进行特异性定性二抗复合物对靶蛋白进行特异性定性及定量检测的方法。其鉴定蛋白质的敏感性为及定量检测的方法。其鉴定蛋白质的敏感性为15ng15ng。 WB WB是进行蛋白质分析时最常用技术之一。是进行蛋白质分析时最常用技术之一。 检测可溶性抗原、细胞成分的鉴定与分析，检测与自

20、检测可溶性抗原、细胞成分的鉴定与分析，检测与自身变性细胞核成分结合的抗体身变性细胞核成分结合的抗体( (抗核抗体抗核抗体) )，HIVHIV的明确诊断。的明确诊断。28WBWB电泳、转膜装置电泳、转膜装置流流程程图图常见问题及解决方案常见问题及解决方案注意事项注意事项:1. 1. 免疫印迹杂交的敏感与检测系统有关. 因此, 凝胶电泳时的蛋白上样量应该保证被检测抗原量不至于太低, 如果过低应该重新纯化和浓缩使用,或者建议做一次梯度稀释, 上样电泳后, 直接考马斯亮蓝染色选择最佳上样量.2. 2. 形成凝胶的试剂要有足够的纯度, 激活剂的浓度适当,不仅可以决定凝胶聚合的速度, 也将影响凝胶的质量,

21、聚胶时的温度也将影响凝胶聚合的速度. 因此,建议要根据不同温度下适量增减激活剂的用量以保证分离胶从加入激活剂起至开始出现凝胶凝聚的时间为15-20分钟最佳, 对于浓缩胶最佳聚合时间为8-10分钟开始可见聚合.灌完分离胶加水封闭分离胶与外界氧气的结合.3. 3. 未聚合的丙烯酰胺具有神经毒性,操作时应该戴手套口罩防护.梳子插入浓缩胶时,应确保没有气泡,可将梳子稍微倾斜插入以减少气泡的产生,梳子拔出来时应该小心,不要破坏加样孔,如有加样孔上的凝胶歪斜可用针头插入加样孔中纠正但要避免针头刺入胶内.4. 4. 电泳槽内加入电泳缓冲液冲洗清除黏附在凝胶底部的气和未聚合的丙烯酰胺,同时建议低电压短时间的预

22、电泳,清除凝胶内的杂质,疏通凝胶孔径以保证电泳过程中电泳的畅通(恒压10-20V, 20-30min)5. 5. 加样前样品应先离心,尤其是长时间放置的样品,以减少蛋白质带的拖尾现象6. 6. 为避免边缘效应,可在未加样的孔中加入等量的样品缓冲液7. 7. 样品缓冲液中煮沸的样品可在-20存放数月,但是反复冻融会使蛋白质降解. 8. 8. 为减少蛋白质条带的扩散,上样后应尽快进行电泳,电泳结束后也应尽快转印.9. 9. 上样时,小心不要使样品溢出而污染相临加样孔 .10. 10. 取出凝胶后应注意分清上下,可用刀片切去凝胶的一角作为标记(如左上角)转膜时也应用同样的方法对PDVF膜做上标记(如

23、左上角)以分清正反面和上下关系.11. 11. 转膜时应依次放好PDVF膜与凝胶所对应的电极,即凝胶对应负极, PDVF膜对应正极.免疫共沉淀免疫共沉淀 （Co-Immunoprecipitation） 免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation）是以抗体和抗原之间的专一性作用为基础的用于研究蛋白质相互作用研究蛋白质相互作用的经典方法。是确定两种蛋白质在完整细胞内生理性相互作用的有效方法。 其原理是：当细胞在非变性条件下被裂解时，完整细胞内存在的许多蛋白质蛋白质间的相互作用被保留了下来。如果用蛋白质a a的抗体免疫沉淀a a，那么与a a在体内结合的蛋白质b b也能沉淀下来。这种

24、方法常用于测定两种目标蛋白质是否在体内结合；也可用于确定一种特定蛋白质的新的作用搭档。原原 理理Co-IPCo-IP工作示意图工作示意图bindingwashelutionbaYYYYYabaabb41利用western blot 确定捕获蛋白收获细胞，加入适量细胞裂解缓冲液（含蛋白酶抑制剂），冰上裂解30min, 细胞裂解液于40C 10,000 rpm 离心10 min后取上清；取少量裂解液以备 western blot分析，剩余裂解液加1g相应的抗体加入到细胞裂解液，40C缓慢摇晃孵育过夜；取10l protein A琼脂糖珠，用适量裂解缓冲液洗 3 次，每次3,000 rpm 离心3

25、min；将预处理过的10l protein A琼脂糖珠加入到和抗体孵育过夜的细胞裂解液中40C缓慢摇晃孵育2-4h，使抗体与protein A琼脂糖珠偶连；免疫沉淀反应后，在40C以3,000 rpm 速度离心3 min，将琼脂糖珠离心至管底；将上清小心吸去，琼脂糖珠用1ml裂解缓冲液洗 610次；最后加入15l的2SDS上样缓冲液，沸水煮5分钟；SDS-PAGE, Western blotting或质谱仪分析。实实 验验 步步 骤骤注意事项注意事项: :（1）细胞裂解采用温和的裂解条件，不能破坏细胞内存在的所有蛋白质蛋白质相互作用，多采用非离子变性剂（NP40或Triton x-100)。每

26、种细胞的裂解条件是不一样的，通过经验确定。不能用高浓度的变性剂（SDS)，细胞裂解液中要加各种酶抑制剂，如商品化的Cocktailer。（2）使用明确的抗体，可以将几种抗体共同使用（3）使用对照抗体： 单克隆抗体-正常小鼠的IgG或另一类单抗; 兔多克隆抗体-正常兔IgG(4) 确保共沉淀的蛋白是由所加入的抗体沉淀得到的，而并非外源非特异蛋白，单克隆抗体的使用有助于避免污染的发生；(5) 要确保抗体的特异性，即在不表达抗原的细胞溶解物中添加抗体后不会引起共沉淀；(6) 确定蛋白间的相互作用是发生在细胞中，而不是由于细胞的溶解才发生的，这需要进行蛋白质的定位来确定。44实验的关键实验的关键实验最

27、需要注意点就是抗体的性质。抗体不同和抗原结合能力也实验最需要注意点就是抗体的性质。抗体不同和抗原结合能力也不同，免疫染色能结合未必能用在不同，免疫染色能结合未必能用在IPIP反应。建议仔细检查反应。建议仔细检查抗体抗体的的说明书。特别是多克隆抗体的特异性问题。说明书。特别是多克隆抗体的特异性问题。为防止蛋白的分解，修饰，溶解抗原的缓冲液必须加蛋白酶抑制为防止蛋白的分解，修饰，溶解抗原的缓冲液必须加蛋白酶抑制剂，低温下进行实验。剂，低温下进行实验。考虑抗体考虑抗体/ /缓冲液的比例。抗体过少就不能检出抗原，过多则就不缓冲液的比例。抗体过少就不能检出抗原，过多则就不能沉降在能沉降在beadsbea

28、ds上，残存在上清。缓冲剂太少则不能溶解抗原，过上，残存在上清。缓冲剂太少则不能溶解抗原，过多则抗原被稀释。多则抗原被稀释。优点优点: :相互作用的蛋白质都是经翻译后修饰的，处于天然状态；相互作用的蛋白质都是经翻译后修饰的，处于天然状态；蛋白的相互作用是在自然状态下进行的，可以避免人为蛋白的相互作用是在自然状态下进行的，可以避免人为的影响；的影响；可以分离得到天然状态的相互作用蛋白复合物。可以分离得到天然状态的相互作用蛋白复合物。缺点缺点: :可能检测不到低亲和力和瞬间的蛋白质蛋白质相互作可能检测不到低亲和力和瞬间的蛋白质蛋白质相互作用；用；两种蛋白质的结合可能不是直接结合，而可能有第三者两种

29、蛋白质的结合可能不是直接结合，而可能有第三者在中间起桥梁作用；在中间起桥梁作用；如用如用western blotwestern blot检验，必须在实验前预测目的蛋白是检验，必须在实验前预测目的蛋白是什么，以选择最后检测的抗体，若预测不正确，实验就什么，以选择最后检测的抗体，若预测不正确，实验就得不到结果。得不到结果。 免疫标记技术免疫标记技术免疫标记技术= =抗原抗体反应抗原抗体反应示踪物标记示踪物标记灵敏性灵敏性特异性特异性标记免疫技术的主要特点：高特异性、高灵敏性免疫技术+ +标记技术酶免疫技术酶免疫技术荧光免疫技术荧光免疫技术放射免疫技术放射免疫技术化学发光技术化学发光技术金免疫技术金

30、免疫技术生物素生物素- -亲和素免疫放大术亲和素免疫放大术分类分类常用的免疫标记物质常用的免疫标记物质类别类别 标记物标记物 用途用途荧光素 FITC、RB200、TRITC 免疫组化 镧系元素螯合物 免疫分析测定放射性核素 3H、14C、32P、57Gr 免疫分析测定 125I、131I酶 HRP、AP 免疫组化 免疫分析测定化学发光物 Luminol、lucigenin 免疫分析测定金属颗粒 胶体金、铁蛋白 免疫组化 免疫分析测定 51酶免疫技术酶免疫技术 基本原理 利用酶催化底物反应的生物放大作用,提高特异性抗原-抗体免疫学反应的检测敏感性的一种标记免疫技术。 基本特点基本特点 标记后保

31、留酶和抗原(抗体)的活性； 酶促反应专一性，保证特异性； 底物反应放大作用，提高敏感性。 酶标试剂保存稳定； 操作简便、安全易行。一、酶免疫技术的分类一、酶免疫技术的分类 酶免疫组化 用于检测组织切片或细胞涂片中用于检测组织切片或细胞涂片中酶免疫技术 的抗原或抗体检测的抗原或抗体检测 均相酶免疫测定 酶免疫测定 固相酶免疫测定 异相酶免疫测定 （ELISAELISA） 液相酶免疫测定二、酶免疫实验的技术要点二、酶免疫实验的技术要点 （一）固相载体 基本要求 结合容量高，结合稳定；可与抗原抗体复合物等大分子蛋白结合；生物大分子固化后仍保持活性；固化方法简便易行、快捷经济。种类与选择1.塑料制品2

32、.微颗粒3.膜载体56（二）酶与酶作用底物（二）酶与酶作用底物1.用于标记酶的要求：酶活性高标记后酶活性稳定，且不影响标记抗原与抗体的免疫反应性酶催化底物后信号易判定或测定酶活性不受样品中其他成分的影响酶、辅助因子及底物理化性质稳定，安全无害，价廉2. 常用酶及其底物（1）辣根过氧化物酶 （horseradish peroxidasehorseradish peroxidase ，HRP） 常用底物：常用底物：邻苯二胺（OPD）：反应显橙黄色，应避光，致癌性。四甲基联苯胺（TMB）：反应后呈蓝色，无需避光，无致癌性，但水溶性差。（2 2） 碱性磷酸酶碱性磷酸酶（Alkaline phospha

33、taseAlkaline phosphatase，APAP） 常用底物为对硝基苯磷酸酯（常用底物为对硝基苯磷酸酯（p-NPPp-NPP），产物为黄色。），产物为黄色。 * * APAP稳定性及灵敏性高于稳定性及灵敏性高于HRPHRP，但不易获得纯品，酶标记物，但不易获得纯品，酶标记物 回收率低，且价高，故应用不如回收率低，且价高，故应用不如HRPHRP普及。普及。59（三）酶标记抗体或抗原（三）酶标记抗体或抗原 基本要求： 酶标记抗原纯度要高，抗原性完整；抗体的特异性好，效价高，亲和力强，比活性高以及易于批量生产和分离纯化。酶标记方法 1.交联法 以双功能交联剂为“桥”，分别与酶和抗体（抗原）

34、连接形成结合物。如戊二醛交联法。2.直接法 用过碘酸钠活化酶蛋白分子后，再与抗体（抗原）结合。仅适用于含糖蛋白分子的酶（如HRP）标记物制备。（四）标记抗体鉴定（四）标记抗体鉴定（五）免疫吸附剂（五）免疫吸附剂（六）试剂最佳工作浓度的选择（六）试剂最佳工作浓度的选择62三、酶联免疫吸附试验三、酶联免疫吸附试验 ( enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)(一)基本原理：v使抗原或抗体结合到某种固相载体表面，并保使抗原或抗体结合到某种固相载体表面，并保持其免疫活性持其免疫活性（固相抗原抗体的形成）（固相抗原抗体的形成） v在测定时，把受检标本（测定其中的

35、抗体或抗在测定时，把受检标本（测定其中的抗体或抗原）和酶标抗原或抗体按不同的步骤与固相载原）和酶标抗原或抗体按不同的步骤与固相载体表面的抗原或抗体起反应体表面的抗原或抗体起反应（抗原抗体反应）（抗原抗体反应）v用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与其他物质分开，最后结合在固相载体上合物与其他物质分开，最后结合在固相载体上的酶量与标本中受检物质的量成一定的比例。的酶量与标本中受检物质的量成一定的比例。（酶标抗原抗体复合物的分离）（酶标抗原抗体复合物的分离） v加入底物后，底物被酶催化变为有色产物，产加入底物后，底物被酶催化变为有色产物，产物的量与标

36、本中受检物质的量直接相关，故可物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据颜色反应的深浅进行定性或定量分析。根据颜色反应的深浅进行定性或定量分析。 （显色反应）（显色反应）（二）（二）ELISAELISA技术类型：技术类型： ELISAELISA可用于测定抗原，也可用于测定抗体。在可用于测定抗原，也可用于测定抗体。在这种测定方法中有这种测定方法中有3 3种必要的试剂：种必要的试剂：v固相的抗原或抗体固相的抗原或抗体v酶标记的抗原或抗体酶标记的抗原或抗体v酶作用的底物酶作用的底物 酶 联 试 剂 阳 性 对 照 酶 标 记 物 显 色 液 A 终 止 液 反 应 板 显 色 液 B 浓 缩 洗

37、涤 液 加 样 枪 与 吸 头 阴 性 对 照 1 1双抗体夹心法双抗体夹心法特点：特点：v非竞争结合反应非竞争结合反应v常用于抗原的检测常用于抗原的检测（Cytokines DeterminationCytokines Determination）v适用于分子中具有至少两个抗原决定簇的多价抗原，适用于分子中具有至少两个抗原决定簇的多价抗原，而不能用于小分子半抗原的检测而不能用于小分子半抗原的检测v所用两种抗体分别针对同一个抗原分子的不同抗原决所用两种抗体分别针对同一个抗原分子的不同抗原决定簇定簇 2 2间接法间接法3.3.竞争法竞争法原原特点：特点：v用于抗原和半抗原的定量测定，也可对抗体进

38、行测定。用于抗原和半抗原的定量测定，也可对抗体进行测定。v酶标酶标AgAg（AbAb）与样品或标准品中的非标记）与样品或标准品中的非标记AgAg（AbAb）具有）具有相同的与固相相同的与固相Ab(Ag)Ab(Ag)结合的能力。结合的能力。v反应体系中，固相反应体系中，固相AbAb（AgAg）和酶标）和酶标AgAg（AbAb）是固定限量）是固定限量的，且前者的结合位点少于酶标记与非标记的，且前者的结合位点少于酶标记与非标记AgAg（AbAb）的）的分子数量和。分子数量和。v反应后，结合与固相载体上复合物中被测定的酶标反应后，结合与固相载体上复合物中被测定的酶标 Ag Ag（AbAb）的量（酶活性

39、）与样品中非标记）的量（酶活性）与样品中非标记AgAg（AbAb）的浓度）的浓度成反比。成反比。注意事项：注意事项：加样加样 应将所加物加在ELISA板孔的底部，避免加在孔壁上部，并注意不可溅出，不可产生气泡。保温保温 1、一般均采用水浴箱，使温度迅速平衡。 2、为避免蒸发，板上应加盖，也可用塑料贴封纸或保鲜膜覆盖板孔。洗涤： 决定着实验的成败决定着实验的成败! ! 目的：目的：洗去反应液中没有与固相抗原或抗体结合的物质以及在反应过程中非特异性吸附于固相载体的干扰物质。 洗涤的方式：洗涤的方式：除某些ELISA仪器配有特殊的自动洗涤仪外，手工操作有浸泡式和流水冲洗式两种。比色：比色：比色前应先

40、用洁净的吸水纸拭干板底附着的液体，然后比色前应先用洁净的吸水纸拭干板底附着的液体，然后将板正确放入酶标比色仪的比色架中。用特定的波长测将板正确放入酶标比色仪的比色架中。用特定的波长测读吸光值。读吸光值。比色结果的表达以往通用光密度（比色结果的表达以往通用光密度（optical densityoptical density，ODOD），现按规定用吸光度（），现按规定用吸光度（absorbenceabsorbence，A A），两者含），两者含义相同。义相同。 通常的表示方法是，将吸收波长写于通常的表示方法是，将吸收波长写于A A字母的右下角，如字母的右下角，如OPDOPD的吸收波长为的吸收波长为

41、492nm492nm，表示方法为，表示方法为AA492nm492nm 或或ODOD492nm492nm 四、固相膜免疫测定四、固相膜免疫测定 固相膜免疫测定与ELISA相类似,其特点是以微孔膜作为固相.标记物可用酶和各种有色微粒子,如彩色乳胶、胶体金等。常用固相膜为硝酸纤维素（NC）膜。类型：类型：斑点酶免疫吸附试验斑点酶免疫吸附试验（dot-ELISA） 酶联免疫斑点试验酶联免疫斑点试验（ELISPOT） 免疫印迹法免疫印迹法 （Western blot）酶联免疫斑点试验酶联免疫斑点试验(enzymelinked immunospot assay，ELISPOT)用已知细胞因子的抗体包被固相

42、载体，加入待检效应用已知细胞因子的抗体包被固相载体，加入待检效应细胞，温育一定时间后洗去细胞，如待检效应细胞产细胞，温育一定时间后洗去细胞，如待检效应细胞产生相应细胞因子，则与已包被的抗体结合，再加入酶生相应细胞因子，则与已包被的抗体结合，再加入酶标记抗该细胞因子抗体，加底物显色。标记抗该细胞因子抗体，加底物显色。一般选择硝酸纤维素膜一般选择硝酸纤维素膜(NC)(NC)或聚偏二氟乙烯或聚偏二氟乙烯(PVDF)(PVDF)膜膜覆盖微量反应板作为固相，在分泌相应细胞因子的细覆盖微量反应板作为固相，在分泌相应细胞因子的细胞所在局部呈现有色斑点，一个斑点表示一个分泌相胞所在局部呈现有色斑点，一个斑点表

43、示一个分泌相应细胞因子的细胞，通过计数可推算出分泌某种细胞应细胞因子的细胞，通过计数可推算出分泌某种细胞因子细胞的频率。因子细胞的频率。注意事项注意事项: :荧光免疫技术荧光免疫技术 免疫荧光技术免疫荧光技术(immunofluorescence technique) 是标记免疫技术中发展最早的一种。是将是标记免疫技术中发展最早的一种。是将抗原抗体反应的特异性与荧光物质检测的敏感抗原抗体反应的特异性与荧光物质检测的敏感性和直观性结合起来的一种方法。性和直观性结合起来的一种方法。基本原理基本原理 利用荧光素标记抗体，使之在涂片上或组利用荧光素标记抗体，使之在涂片上或组织切片上与标本中的待检抗原特

44、异结合，采用织切片上与标本中的待检抗原特异结合，采用高发光效率的点光源，透过滤色板发出一定波高发光效率的点光源，透过滤色板发出一定波长的光，使结合在标本上的荧光素被激发而产长的光，使结合在标本上的荧光素被激发而产生荧光，借助荧光显微镜观察底物片上荧光染生荧光，借助荧光显微镜观察底物片上荧光染色形态，来判断有无待检抗原或抗体。色形态，来判断有无待检抗原或抗体。一、免疫荧光显微技术一、免疫荧光显微技术（一）原理：（一）原理： 使荧光抗体与标本切片中组织或细胞表面使荧光抗体与标本切片中组织或细胞表面的抗原进行反应，洗涤除去游离的荧光抗体后的抗原进行反应，洗涤除去游离的荧光抗体后，于荧光显微镜下观察，

45、在黑暗背景上可见明，于荧光显微镜下观察，在黑暗背景上可见明亮的特异荧光。亮的特异荧光。（二）荧光抗体的制备（二）荧光抗体的制备（1 1）荧光抗体的标记）荧光抗体的标记 作为标记的荧光素应符合以下要求作为标记的荧光素应符合以下要求： 应具有能与蛋白质分子形成共价健的化学基团，与应具有能与蛋白质分子形成共价健的化学基团，与蛋白质结合后不易解离，而未结合的色素及其降解产蛋白质结合后不易解离，而未结合的色素及其降解产物易于清除。物易于清除。 荧光效率高荧光效率高, ,与蛋白质结合后，仍能保持较高的荧与蛋白质结合后，仍能保持较高的荧光效率。光效率。 荧光色泽与背景组织的色泽对比鲜明。荧光色泽与背景组织的色泽对比鲜明。 与蛋白质结合后不影响蛋白质原有的生化与免疫性与蛋白质结合后不影响蛋白质原有的生化与免疫性质，与蛋白质的结合物稳定，易于保存。质，与蛋白质的结合物稳定，易于保存。 标记方法简单、安全无毒。标记方法简单、安全无毒。荧光抗体是将荧光素与特异性抗体以化学方式共价结合而成荧光抗体是将荧光素与特异性抗体以化学方式共价结合而成常用于标记的荧光素常用于标记的荧光素: : 异硫氰酸荧光黄异硫氰酸荧光黄（FITCFITC） 四乙基罗丹明四乙基罗丹明（RB200RB200） 四甲基异硫氰酸罗