第五章第二、三节凝胶过滤与高效液相色谱

1、1第二节第二节 凝胶过滤层析凝胶过滤层析是本世纪是本世纪6060年代发展起来的一种分离纯化方法。年代发展起来的一种分离纯化方法。又叫又叫分子筛层析分子筛层析，其原因是，凝胶具有网状结构，其原因是，凝胶具有网状结构，小分子物质能进入其内部，而大分子物质却被排小分子物质能进入其内部，而大分子物质却被排阻在外部。当一混合溶液通过凝胶过滤层析柱时，阻在外部。当一混合溶液通过凝胶过滤层析柱时，溶液中的物质就按不同分子量筛分开。溶液中的物质就按不同分子量筛分开。234优点：设备简单、操作方便、重复性好和样品优点：设备简单、操作方便、重复性好和样品回收率高等特点。回收率高等特点。适用于：适用于：a.a.分离

2、纯化蛋白质分离纯化蛋白质( (包括酶类包括酶类) )、核酸、多糖、核酸、多糖、激素、氨基酸和抗生素等物质激素、氨基酸和抗生素等物质b.b.测定蛋白质的分子量测定蛋白质的分子量c.c.样品的浓缩和脱盐等方面。样品的浓缩和脱盐等方面。5性质：性质： 凝胶不溶于水，但在水中有较大的膨胀度和较好凝胶不溶于水，但在水中有较大的膨胀度和较好的分子筛功能。的分子筛功能。分类：分类： 葡聚糖凝胶、天然琼脂糖和交联琼脂糖、聚丙烯葡聚糖凝胶、天然琼脂糖和交联琼脂糖、聚丙烯酰胺凝胶酰胺凝胶( (生物胶生物胶) )和交联葡聚糖与双丙烯酰胺共和交联葡聚糖与双丙烯酰胺共聚的凝胶等。聚的凝胶等。67商品名商品名：Sepha

3、dexSephadex，它是由葡聚糖，它是由葡聚糖 右旋糖酐右旋糖酐(G(G型型) )；和；和3-3-氯氯-1,2-1,2-环氧丙烷（交联剂环氧丙烷（交联剂) )以醚链相以醚链相互交联而成的。在交联葡聚糖互交联而成的。在交联葡聚糖G-25G-25和和G-50G-50中分中分别加入羟丙基基团反应，即可构成别加入羟丙基基团反应，即可构成LHLH型烷基化型烷基化葡聚糖凝胶。葡聚糖凝胶。8910葡聚糖凝胶：白色珠状颗粒，在显微镜下可见葡聚糖凝胶：白色珠状颗粒，在显微镜下可见其表面的网状皱纹。它带有大量的羟基，亲水其表面的网状皱纹。它带有大量的羟基，亲水性好，在水溶液或电解质溶液中极易膨胀。不性好，在水

4、溶液或电解质溶液中极易膨胀。不同型号的葡聚糖凝胶的交联度同型号的葡聚糖凝胶的交联度( (交联剂在葡聚糖交联剂在葡聚糖凝胶中占的百分数凝胶中占的百分数) )不同，使其在水中的膨胀度不同，使其在水中的膨胀度( (床体积床体积) )、吸水量、吸水量( (每克干凝胶在水中充分膨胀每克干凝胶在水中充分膨胀时所需的水量。但不包括颗粒间所带的水量时所需的水量。但不包括颗粒间所带的水量) )、筛孔的大小和分组范围有明显的差异筛孔的大小和分组范围有明显的差异。1112例如，例如，SephadexSephadex G-25 G-25比比G-100G-100交联度大。而交联度大。而膨胀度、吸水量和筛孔直径前者小于后

5、者。膨胀度、吸水量和筛孔直径前者小于后者。另外，前者对球形蛋白质的分级范围较窄，另外，前者对球形蛋白质的分级范围较窄，即在即在1000(1000(下限下限)-5000()-5000(上限上限) )之间，而后者的之间，而后者的分级范围较宽，即分级范围较宽，即在在4000-1500004000-150000之间。之间。13葡聚糖凝胶置盐溶液或清洁剂中引起的膨胀程葡聚糖凝胶置盐溶液或清洁剂中引起的膨胀程度并不影响样品的分级效果。但盐溶液或清洁度并不影响样品的分级效果。但盐溶液或清洁剂能改变分离物质的结构时，则会影响分级效剂能改变分离物质的结构时，则会影响分级效果。果。葡聚糖凝胶的型号不同，其性质亦不

6、同葡聚糖凝胶的型号不同，其性质亦不同。1415葡聚糖凝胶在水溶液、盐溶液、碱溶液、弱酸溶液和葡聚糖凝胶在水溶液、盐溶液、碱溶液、弱酸溶液和有机溶剂中稳定，不溶解，很少产生化学降解。有机溶剂中稳定，不溶解，很少产生化学降解。在中性条件下，葡聚糖凝胶悬浮液可置高温在中性条件下，葡聚糖凝胶悬浮液可置高温(120)(120)消毒消毒3030分钟，其性质并不改变。在分钟，其性质并不改变。在0.1mol/L HCl0.1mol/L HCl溶液溶液中浸泡中浸泡1-21-2小时，甚至在小时，甚至在0.02mol/L HCl0.02mol/L HCl溶液中浸泡溶液中浸泡6 6个月以上，对分离效果无明显的影响。个

7、月以上，对分离效果无明显的影响。耐酸、耐碱、耐高温耐酸、耐碱、耐高温1617葡聚糖凝胶系弱酸性物质葡聚糖凝胶系弱酸性物质, ,由于其每克干胶中含由于其每克干胶中含10-2010-20微克当量的羧基基团所致。该基团能与分微克当量的羧基基团所致。该基团能与分离物中电荷基团离物中电荷基团( (尤其是碱性蛋白质尤其是碱性蛋白质) )发生吸附作发生吸附作用。但这种吸附作用可用提高洗脱液的离子强度用。但这种吸附作用可用提高洗脱液的离子强度解决。当离子强度大于解决。当离子强度大于0.050.05时，一般对弱碱性蛋时，一般对弱碱性蛋白质就无吸附力了。因此葡聚糖凝胶层析时白质就无吸附力了。因此葡聚糖凝胶层析时,

8、 ,常常用含有用含有NaClNaCl的缓冲液作洗脱液。的缓冲液作洗脱液。18新葡聚糖凝胶对蛋白质往往有不可逆的吸附力新葡聚糖凝胶对蛋白质往往有不可逆的吸附力了。虽然吸附的数量较少，但是在制作测定蛋了。虽然吸附的数量较少，但是在制作测定蛋白质分子量的标准曲线时，或者分离纯化极难白质分子量的标准曲线时，或者分离纯化极难得到的物质时，需先用易得到的蛋白质进行预得到的物质时，需先用易得到的蛋白质进行预层析，以便消除其影响。层析，以便消除其影响。19此外，葡聚糖凝胶对芳香族化合物或杂环化合此外，葡聚糖凝胶对芳香族化合物或杂环化合物以及某些凝集素具有较强的吸附作用，若采物以及某些凝集素具有较强的吸附作用，

9、若采用凝胶过滤层析分离它们时，往往利用的是用凝胶过滤层析分离它们时，往往利用的是吸吸附原理附原理，而不是排阻原理。，而不是排阻原理。20琼脂糖的商品名称是因生产厂家不同而异：瑞典琼脂糖的商品名称是因生产厂家不同而异：瑞典称称SepharoseSepharose, ,美国称美国称Bio-gel ABio-gel A；英国；英国称称SegavacSegavac；丹麦丹麦GelaroseGelarose, ,我国的同类产品与瑞典相同，这我国的同类产品与瑞典相同，这些琼脂糖中些琼脂糖中除除SegavacSegavac外，都是以珠状琼脂糖凝外，都是以珠状琼脂糖凝胶形式出售。胶形式出售。21琼脂糖凝胶按其

10、浓度分：琼脂糖凝胶按其浓度分：SepharoseSepharose 2B(2 2B(2浓浓度度) )、4B(44B(4) )和和6B(66B(6) )。SepharoseSepharose 6B 6B的机械的机械强度大于强度大于2B2B，但是筛孔小于，但是筛孔小于2B2B。琼脂糖凝胶的机械强度和筛孔的稳定性都比葡聚琼脂糖凝胶的机械强度和筛孔的稳定性都比葡聚糖凝胶好，用琼脂糖凝胶进行柱层析时，流速可糖凝胶好，用琼脂糖凝胶进行柱层析时，流速可以快些。以快些。22商品名商品名Bio-gelBio-gel。是以甲撑双丙烯酰胺（双体）。是以甲撑双丙烯酰胺（双体）作为交联剂，以过硫酸胺为催化剂，作为交联剂

11、，以过硫酸胺为催化剂，N,N,N,N-N,N,N,N-四甲基乙二胺（四甲基乙二胺（TEMEDTEMED）为加速剂，）为加速剂，将丙烯酰胺（单体）聚合而成的。当改变单体浓将丙烯酰胺（单体）聚合而成的。当改变单体浓度时，就可得吸水率不同的产物，商品型号有度时，就可得吸水率不同的产物，商品型号有Bio-gel P-2Bio-gel P-2到到P-300P-300。23一般聚丙烯酰胺凝胶均制成珠状颗粒，以干凝一般聚丙烯酰胺凝胶均制成珠状颗粒，以干凝胶形式出售，使用前必须溶胀。胶形式出售，使用前必须溶胀。特点：不溶于水和普通有机溶剂，特点：不溶于水和普通有机溶剂，能在浓盐、能在浓盐、尿素和胍盐等溶液中浸

12、泡尿素和胍盐等溶液中浸泡：在：在pH l-10pH l-10或短时或短时问超过此问超过此pHpH值的溶液中较稳定；要避免长期与值的溶液中较稳定；要避免长期与强酸和强碱接触，否则，酰胺基将迅速发生分强酸和强碱接触，否则，酰胺基将迅速发生分解（高温条件）。解（高温条件）。缺点：缺点：对芳香族的、酸性和碱性的化合物稍有对芳香族的、酸性和碱性的化合物稍有吸附吸附现象，使用离子强度略高的洗脱液操作可现象，使用离子强度略高的洗脱液操作可以克服以克服242526SephacrylSephacryl由烷基葡聚糖与甲撑双丙烯酰胺被共由烷基葡聚糖与甲撑双丙烯酰胺被共价交联制成的。属硬性凝胶，具有一定大小的价交联制

13、成的。属硬性凝胶，具有一定大小的筛孔和少量的羧基基团。筛孔和少量的羧基基团。SephacrylSephacryl吸水时，其吸水时，其珠状颗粒直径平均值珠状颗粒直径平均值为为7070m m。通常是用于水相。通常是用于水相系统中。若在有机相系统使用时，其孔径大小系统中。若在有机相系统使用时，其孔径大小略有变化。略有变化。272829SephacrylSephacryl能用于分离蛋白质、核酸，多糖和蛋白聚能用于分离蛋白质、核酸，多糖和蛋白聚糖糖(Proteoglycans(Proteoglycans) )。也可用硕大的病毒颗粒。也可用硕大的病毒颗粒( (直径直径300-400) 300-400) 的

14、分离。层析时，用细颗粒凝胶分辨率高。的分离。层析时，用细颗粒凝胶分辨率高。30凝胶过滤层析的基质是具有凝胶过滤层析的基质是具有立体网状结构、筛立体网状结构、筛孔直径一致孔直径一致，且呈珠状颗粒的物质。这种物质，且呈珠状颗粒的物质。这种物质可以完全，或者部分排阻某些大分子化合物于可以完全，或者部分排阻某些大分子化合物于筛孔之外。而对某些小分子化合物则不能排阻。筛孔之外。而对某些小分子化合物则不能排阻。但可让其在筛孔中自由地但可让其在筛孔中自由地扩散、渗透扩散、渗透。任何一。任何一种被分离的化合物在凝胶层析柱被排阻的范围种被分离的化合物在凝胶层析柱被排阻的范围均在均在0-1000-100之间。之间

15、。313233因此，在同一凝胶过滤柱上分离分子量不同的因此，在同一凝胶过滤柱上分离分子量不同的物质时，由于流动相的作用，这些分离物质将物质时，由于流动相的作用，这些分离物质将发生发生排阻和扩散排阻和扩散效应。若缓冲液连续的倾入柱效应。若缓冲液连续的倾入柱中，柱中物质的排阻和扩散效应也将连续的发中，柱中物质的排阻和扩散效应也将连续的发生，其级终结果是生，其级终结果是分子量大的物质先从柱中流分子量大的物质先从柱中流出，分子量小的物质则后从柱中流出出，分子量小的物质则后从柱中流出，流出物，流出物用部分收集器分管等量或等时的收集起来，检用部分收集器分管等量或等时的收集起来，检测后分段合并相同组分的各管

16、流出物，即等于测后分段合并相同组分的各管流出物，即等于把分于量不同的物质相互筛分开了。把分于量不同的物质相互筛分开了。341 1）操作条件操作条件：如基质的颗粒大小、均匀度、筛：如基质的颗粒大小、均匀度、筛孔直径和床体积的大小、洗脱液的流速以及样孔直径和床体积的大小、洗脱液的流速以及样品的种类等；品的种类等；2 2）KavKav值的差异性值的差异性。KavKav值差异性大，分离效值差异性大，分离效果好；果好；KavKav值差异性小，乃至等于值差异性小，乃至等于1 1或等于零或等于零( (即即使样品个各组分的分子量相使样品个各组分的分子量相差很大差很大)，则分离效，则分离效果相差，或根本不能分开

17、。果相差，或根本不能分开。35分配系数分配系数(Kav(Kav) )既是判断分离效果的一个参数，既是判断分离效果的一个参数，又是测定蛋白质分子量的一个依据。从公式又是测定蛋白质分子量的一个依据。从公式Kav=Kav=（Ve-VoVe-Vo）/ /（VtVt-Vo-Vo）看出，只要测出床）看出，只要测出床体积体积VtVt和外水体积和外水体积VoVo以及洗脱体积以及洗脱体积VeVe。即可计。即可计算出算出KavKav，而凝胶床总体积，而凝胶床总体积VtVt可用二种方法得可用二种方法得到。到。361 1）计算法，即根据层析柱体积计算其总体积。）计算法，即根据层析柱体积计算其总体积。公式表示：公式表示

18、：VtVt=r=r2 2 h h 式中式中r r为层析柱半径，为层析柱半径， h h为凝胶床高度；为凝胶床高度；为圆周率。在用此公式计算为圆周率。在用此公式计算凝胶床总体积时，须精确的分段测量，以防内凝胶床总体积时，须精确的分段测量，以防内径不均匀造成误差，另外还须注意到，在层析径不均匀造成误差，另外还须注意到，在层析过程中，尤其是软胶操作压力要小，以防凝胶过程中，尤其是软胶操作压力要小，以防凝胶床的高度降低。床的高度降低。37由凝胶床的组成可知，床体积由凝胶床的组成可知，床体积VtVt等于外水体体等于外水体体积积VoVo、内水体积、内水体积Vi,Vi,与凝胶颗粒实际占有体积与凝胶颗粒实际占有

19、体积VgVg之和。之和。即即 VtVt=Vo+Vi+Vg =Vo+Vi+Vg 因因VgVg与与VtVt相比是很小的。可忽略不计，故相比是很小的。可忽略不计，故 VtVtVoVo十十ViVi38VoVo和和ViVi可通过实验测得：分子量不同的混合液在凝胶中可通过实验测得：分子量不同的混合液在凝胶中的内水体积和外水体积中的分布不同。溶液中的分子大的内水体积和外水体积中的分布不同。溶液中的分子大于凝胶孔径上限者，不能进入凝胶网孔内，而被排阻在于凝胶孔径上限者，不能进入凝胶网孔内，而被排阻在外水体积的溶液中。外水体积的溶液中。凝胶床的洗脱体积凝胶床的洗脱体积VeVe刚好等于外水刚好等于外水体积。体积。

20、即即Ve=Vo(KavVe=Vo(Kav=0)=0)。溶液中的分子小于凝胶孔径下。溶液中的分子小于凝胶孔径下限者，能自由进入凝胶网孔内，限者，能自由进入凝胶网孔内，凝胶床的洗脱体积凝胶床的洗脱体积VeVe应应等于凝胶床总体积、即等于凝胶床总体积、即Ve=Vt=VoVe=Vt=Vo十十Vi(KavVi(Kav=1)=1)。而溶液。而溶液中的分子大小介于凝胶孔径上限和下限之间者，则中的分子大小介于凝胶孔径上限和下限之间者，则有一有一部分能进入凝胶网孔部分能进入凝胶网孔、故其洗脱体积、故其洗脱体积VeVe是在是在VoVo和和VtVt之间之间(Kav(Kav在在0-10-1之间之间) )。39常选用：

21、蓝色葡聚糖常选用：蓝色葡聚糖20002000作为测定外水体积的物作为测定外水体积的物质。质。其理由：其理由：1 1）分子量大）分子量大( (为为200200万万) )，呈蓝色，在各种型号的，呈蓝色，在各种型号的葡聚糖凝胶中都被完全排阻；葡聚糖凝胶中都被完全排阻；2 2）借助本身的颜色，采用肉眼或分光光度仪检）借助本身的颜色，采用肉眼或分光光度仪检测（在测（在210nm210nm或或260nm260nm及及620nm)620nm)洗脱体积洗脱体积( (即即Vo)Vo)。4041以床体积以床体积VtVt（公式算）和测得值（公式算）和测得值VoVo来计算分配系来计算分配系数的值为数的值为KavKav

22、（计算法计算法）。）。 若以床体积若以床体积VtVt( (等于等于VoVo十十Vi)Vi)和测得值和测得值VoVo来计算分来计算分配系数的值配系数的值为为KdKd（测量法测量法）。）。 同一层析条件下、对同一物质计算出同一层析条件下、对同一物质计算出的的KavKav和和KdKd仅尽管有一定的差异性，但那是有效的。只仅尽管有一定的差异性，但那是有效的。只因因KavKav计算方便，所以目前使用计算方便，所以目前使用KavKav较多。分离物在较多。分离物在凝胶过滤层析时的行为，还可用凝胶过滤层析时的行为，还可用VeVeVoVo或或VoVoVeVe(R(R值值) )表示。表示。42（一）凝胶的选择和处

23、理（一）凝胶的选择和处理1 1凝胶的选样凝胶的选样(1)(1)型号型号 凝胶型号很多。型号不同，筛分范围也不同。凝胶型号很多。型号不同，筛分范围也不同。市售的市售的SephadexSephadex的分离范围，常用的分离范围，常用高聚糖或球蛋高聚糖或球蛋白测定白测定。SephadexSephadex G G型一般适宜于分离蛋白质。型一般适宜于分离蛋白质。如果用于分离核酸时、则限于其空间结构和所带如果用于分离核酸时、则限于其空间结构和所带基团的影响，选用基团的影响，选用高于它们分子量范围的型号高于它们分子量范围的型号，或者或者选用适当型号的生物胶和选用适当型号的生物胶和S Sephacryleph

24、acryl。4344凝胶的粒度有粗有细凝胶的粒度有粗有细( (与交联度无关与交联度无关) )。细颗粒。细颗粒凝胶之间空间小、装柱易均一，因此分离效果凝胶之间空间小、装柱易均一，因此分离效果好好( (与粗颗粒凝胶相比、但是由于细颗粒凝胶与粗颗粒凝胶相比、但是由于细颗粒凝胶流速慢，故宜流速慢，故宜用大直径的层析柱用大直径的层析柱。这类凝胶用。这类凝胶用于小型试验，能得到满意结果；而粗颗粒凝胶于小型试验，能得到满意结果；而粗颗粒凝胶流速快宜流速快宜用小直径的层析柱用小直径的层析柱，如操作得当可得，如操作得当可得到较满意的结果。到较满意的结果。4546根据层析柱的体积和干凝胶的膨胀度，公式可根据层析柱

25、的体积和干凝胶的膨胀度，公式可计算出所需干凝胶的用量：计算出所需干凝胶的用量：干凝胶用量（干凝胶用量（g g）= =r r2 2 h / h / 膨涨度（床体积膨涨度（床体积/ /克克干胶）干胶）用此法计算出的干凝胶用量还需增加用此法计算出的干凝胶用量还需增加10%10%- -2020，因为凝胶在处理过程会有一部分损失。因为凝胶在处理过程会有一部分损失。47将所用的干凝胶缓慢的将所用的干凝胶缓慢的倾入倾入5-105-10倍的蒸馏水中，根据凝倍的蒸馏水中，根据凝胶溶涨所需的时间进行充分浸泡，用倾斜法除去表面悬胶溶涨所需的时间进行充分浸泡，用倾斜法除去表面悬浮的小颗粒，浮的小颗粒， 再用再用0.5

26、mol/L NaOH-0.5mol NaCl0.5mol/L NaOH-0.5mol NaCl溶液在室温下浸泡半溶液在室温下浸泡半个小时，以抽滤法除去碱液，用蒸馏水洗至中性，为了个小时，以抽滤法除去碱液，用蒸馏水洗至中性，为了除去凝胶颗粒中空隙中的气泡，可把处理过的凝胶浸泡除去凝胶颗粒中空隙中的气泡，可把处理过的凝胶浸泡于蒸馏水和平衡液中用抽气方法实现。有时采用加热煮于蒸馏水和平衡液中用抽气方法实现。有时采用加热煮沸方法，不仅能达到此目的，而且还能加快凝胶的溶胀沸方法，不仅能达到此目的，而且还能加快凝胶的溶胀速度。但是，必须避免置于酸或碱溶液中加热。速度。但是，必须避免置于酸或碱溶液中加热。4

27、81.1.柱的选择柱的选择 层析柱重要组成部分。对层析柱（包括体积和长度层析柱重要组成部分。对层析柱（包括体积和长度等）的选择，将直接影响分离效果。等）的选择，将直接影响分离效果。 当用同样直径的层析柱分离两种以上的物质时。当用同样直径的层析柱分离两种以上的物质时。长层长层析柱比短的分辨率高析柱比短的分辨率高；当用同样长度的层析柱分离两；当用同样长度的层析柱分离两种以上的物质时，种以上的物质时，层析柱直径大的比小的分辨率高层析柱直径大的比小的分辨率高；当用同样体积的层析柱分离两种以上的物质时，仍是当用同样体积的层析柱分离两种以上的物质时，仍是层析柱长的比短的分辨率高层析柱长的比短的分辨率高。一

28、般理想的层析柱之直。一般理想的层析柱之直径与长度之比径与长度之比是是1 1: :25-125-1: :100100。层析柱最好有夹套，可。层析柱最好有夹套，可以控制温度，重复性好。以控制温度，重复性好。495051装柱前要先将层析柱垂直固定在支架上。装柱前要先将层析柱垂直固定在支架上。分类：干装法和湿装法两种。分类：干装法和湿装法两种。干装法干装法直接加凝胶到柱中，然后倒入溶剂，直接加凝胶到柱中，然后倒入溶剂，此法不易将此法不易将气泡排尽气泡排尽。52湿装法湿装法先加适量溶剂到柱内，排走其中的先加适量溶剂到柱内，排走其中的空气，然后把预先用溶剂浸泡好的凝胶搅匀，空气，然后把预先用溶剂浸泡好的凝

29、胶搅匀，随即将此悬浮液连续倾入到柱中，待其自然沉随即将此悬浮液连续倾入到柱中，待其自然沉降至柱高的降至柱高的1/4-1/31/4-1/3时打开柱下端出口，让溶时打开柱下端出口，让溶剂慢慢流出，使柱上端悬浮液徐徐下降至需要剂慢慢流出，使柱上端悬浮液徐徐下降至需要的高度。凝胶表面要平整的高度。凝胶表面要平整, ,应使其一直浸没在应使其一直浸没在溶剂中，严防气泡产生溶剂中，严防气泡产生。这一种装。这一种装柱法对各种柱法对各种基质都适用。基质都适用。53新装的凝胶柱用适当缓冲液平衡后，将蓝色葡新装的凝胶柱用适当缓冲液平衡后，将蓝色葡聚糖聚糖-2000-2000，或红色葡聚糖或细胞色素，或红色葡聚糖或细

30、胞色素C C或血红或血红蛋白等配成蛋白等配成2 2毫克毫克/ /毫升的溶液过柱，观察色带毫升的溶液过柱，观察色带是否均匀下降是否均匀下降。如均匀下降，则表明柱中凝胶。如均匀下降，则表明柱中凝胶是均匀的、柱中没有是均匀的、柱中没有裂缝和气泡裂缝和气泡，否则须重新，否则须重新装柱。如果凝胶柱鉴定时采用的是蛋白质类物装柱。如果凝胶柱鉴定时采用的是蛋白质类物质进行，除能起到鉴定柱子的作用外，还可起质进行，除能起到鉴定柱子的作用外，还可起到克服对到克服对某些分离物有不可逆吸附某些分离物有不可逆吸附的作用。的作用。541 1加样加样 加样量与加样量与测定方法和层析柱大小有测定方法和层析柱大小有关关。测定样

31、品含量的方法灵敏或床体积小时，。测定样品含量的方法灵敏或床体积小时，加样量可少。否则反之加样量可少。否则反之。例如，例如，般测定蛋白质的含量多用紫外分光光般测定蛋白质的含量多用紫外分光光度法。当采用度法。当采用280nm280nm观察消光读数时，加样量需观察消光读数时，加样量需5 5毫克左右毫克左右( (柱体积柱体积2 260cm)60cm)；当采用；当采用220nm220nm观察观察消光读数时，加样量只需消光读数时，加样量只需1.21.2毫克左右，加样量毫克左右，加样量掌握得当，可提高分离效果。掌握得当，可提高分离效果。55一般来说，一般来说，加样量越少，或加样体积越小加样量越少，或加样体积

32、越小( (样品样品浓度高时浓度高时) )，分辨率越高，分辨率越高。但是，当用于样品的。但是，当用于样品的制备和脱盐时，加样量应在不影响分辨率的前制备和脱盐时，加样量应在不影响分辨率的前提下增大。究竟加样体积多少为宜？提下增大。究竟加样体积多少为宜？这要视被这要视被分离物在层析柱的分配系数分离物在层析柱的分配系数(Kav(Kav) )或洗脱体积或洗脱体积(Ve(Ve) )来决定来决定。56假设，假设，A A、B B两个被分离物在层析柱中的洗脱体两个被分离物在层析柱中的洗脱体积分别为积分别为VeVeA A 、VeVeB B，分配系数分别为分配系数分别为KavKav，KavKav。A A、B B两物

33、洗脱体积之差称为分离体积，两物洗脱体积之差称为分离体积，以以VsVs表示。则表示。则VsVsVeVeA A -Ve -VeB B。57当样品体积当样品体积(Vp(Vp) )正好与正好与VsVs相等时，理论上的洗相等时，理论上的洗脱图形是两种物质恰好分开。但实际情况并非脱图形是两种物质恰好分开。但实际情况并非如此，由于样品流过柱时的扩散作用，其体积如此，由于样品流过柱时的扩散作用，其体积会逐渐增大，致使其洗脱体积远比原来大。因会逐渐增大，致使其洗脱体积远比原来大。因此，此，当当VpVp等于或大于等于或大于VsVs时，时，A A、B B两种物质就不两种物质就不能完全分开；而当能完全分开；而当VpV

34、p小于小于VsVs时，时，A A、B B两种物质两种物质就能分开就能分开。 根据根据VeVeVoVo十十KavKav（VtVt-Vo)-Vo)，则，则 VsVsVeVeA A -Ve -VeB B (Kav-Kav(Kav-Kav)(VtVo)(VtVo)58分离效果是与加样体积、被分离样品在层析柱分离效果是与加样体积、被分离样品在层析柱中的洗脱体积或分配系数，以及凝胶床的体积中的洗脱体积或分配系数，以及凝胶床的体积有关有关。所以，为了提高分离效果，在一定范围。所以，为了提高分离效果，在一定范围内，内，加样体积越小越好加样体积越小越好。例如在蛋白质溶液中。例如在蛋白质溶液中脱盐时，因加样量过大

35、会产生分离不完全的现脱盐时，因加样量过大会产生分离不完全的现象。而加样量减少时，则产生良好的分离效果。象。而加样量减少时，则产生良好的分离效果。通常通常加样体积为床体积的加样体积为床体积的1-5%,1-5%,最好不超过最好不超过10%10%。5960所有的洗脱液均以能溶解被洗脱物质和不使其所有的洗脱液均以能溶解被洗脱物质和不使其变性或失活为原则变性或失活为原则。除个别特殊情况外。一般。除个别特殊情况外。一般都以单一缓冲液都以单一缓冲液( (如磷酸缓冲如磷酸缓冲液、液、Tris-HClTris-HCl缓缓冲液等冲液等) )，或者盐溶液作为洗脱液。有时甚至，或者盐溶液作为洗脱液。有时甚至也可以用蒸

36、馏水作洗脱液。也可以用蒸馏水作洗脱液。61洗脱时的流速要严格控制洗脱时的流速要严格控制。否则收集的每一部。否则收集的每一部分洗脱体积就不会恒定，理想的分配系数就难分洗脱体积就不会恒定，理想的分配系数就难以测出。控制流速的最好装置是恒流泵以测出。控制流速的最好装置是恒流泵( (微量微量泵泵) )，它不仅可以使流速恒定，而且还可以使，它不仅可以使流速恒定，而且还可以使其在较大范围内选择。若无此装置，可用控制其在较大范围内选择。若无此装置，可用控制操作压的办法进行。事实上，大多数实验室是操作压的办法进行。事实上，大多数实验室是采用后一种方法进行控制流速的。采用后一种方法进行控制流速的。流流 速速62

37、流速除与柱长度有关外，还与柱直径大小有关。流速除与柱长度有关外，还与柱直径大小有关。为了防止层析柱中洗脱液流干，可按图为了防止层析柱中洗脱液流干，可按图5-105-10装置装置进行操作。进行操作。636465 峰洗脱体积：是指被分离物质通过凝胶柱所需洗脱峰洗脱体积：是指被分离物质通过凝胶柱所需洗脱液有体积，常用液有体积，常用VeVe 表示。表示。l当使用样品的体积很少时，当使用样品的体积很少时，( (与洗脱体积比较可以忽与洗脱体积比较可以忽略不计略不计) )，在洗脱图中，从加样到峰顶位置所用洗脱，在洗脱图中，从加样到峰顶位置所用洗脱液体积为液体积为VeVe。 l当样品体积与洗脱体积比较不能忽略

38、时，洗脱体积当样品体积与洗脱体积比较不能忽略时，洗脱体积计算可以从样品体积的一半到峰顶位置。计算可以从样品体积的一半到峰顶位置。l当样品很大时，洗脱体积计算可以从应用样品开始当样品很大时，洗脱体积计算可以从应用样品开始到洗脱峰升高的弯曲点到洗脱峰升高的弯曲点( (或半高处或半高处) )。66在凝胶分离范围之内，蛋白质分子量与洗脱位在凝胶分离范围之内，蛋白质分子量与洗脱位置之间存在线性对应关系。置之间存在线性对应关系。 在一定分子量范围内洗脱体积对分子量的对数在一定分子量范围内洗脱体积对分子量的对数为为线性关系线性关系，即，即分子量的标准曲线分子量的标准曲线。 671 1再生再生 仅使用一次的凝

39、胶柱，通常进行重仅使用一次的凝胶柱，通常进行重新平衡后即可使用。但使用过多次后，由于凝新平衡后即可使用。但使用过多次后，由于凝胶床体积变小，流动速度降低或污染杂质过多胶床体积变小，流动速度降低或污染杂质过多等原因，致使其正常性能受到影响。在此情况等原因，致使其正常性能受到影响。在此情况下，再生方法是：先用水反复进行逆向冲洗。下，再生方法是：先用水反复进行逆向冲洗。再用缓冲液进行平衡。平衡毕，即可重复使用；再用缓冲液进行平衡。平衡毕，即可重复使用；另一种方法是，把凝胶倒出，用低浓度的另一种方法是，把凝胶倒出，用低浓度的酸酸或或碱按其预处理方法进行，处理后重新装柱即可碱按其预处理方法进行，处理后重

40、新装柱即可再行使用。再行使用。68使用过的凝胶柱，若要短时间保存，则需进使用过的凝胶柱，若要短时间保存，则需进行反复洗涤除去蛋白质等杂质，并加入适当的行反复洗涤除去蛋白质等杂质，并加入适当的防霉剂；防霉剂；若要长时间保存，则需将凝胶从柱中取出，若要长时间保存，则需将凝胶从柱中取出，进行洗涤、脱水和干燥。其方法：将凝胶用低进行洗涤、脱水和干燥。其方法：将凝胶用低浓度的酸或碱溶液短时间浸泡后，再用水反复浓度的酸或碱溶液短时间浸泡后，再用水反复洗涤过滤抽干，并浸泡在浓度稍高的乙醇溶液洗涤过滤抽干，并浸泡在浓度稍高的乙醇溶液中。中。69如此依次提高乙醇浓度进行反复处理，待乙醇如此依次提高乙醇浓度进行反

41、复处理，待乙醇浓度增加至浓度增加至9595时，将凝胶抽干。置时，将凝胶抽干。置6060烘箱烘箱中烘干，可装瓶保存。在此过程中，溶胀的凝中烘干，可装瓶保存。在此过程中，溶胀的凝胶不能直接用高温烘烤，否则会粘结成块胶不能直接用高温烘烤，否则会粘结成块( (机械机械捣碎会破坏珠状结构捣碎会破坏珠状结构) )。交联度越小的葡聚糖凝。交联度越小的葡聚糖凝胶，越难以脱水。一般可采用将其较长时间浸胶，越难以脱水。一般可采用将其较长时间浸泡在的泡在的6060- -7070乙醇溶液中的作法来达到这一乙醇溶液中的作法来达到这一目的。目的。7071核酸蛋白检测仪及记录仪（正面）核酸蛋白检测仪及记录仪（正面）72核酸

42、蛋白检测仪及记录仪（背面）核酸蛋白检测仪及记录仪（背面）73返回74返回75返回76部分收集器部分收集器返回77返回7879返回80返回81高效液相色谱高效液相色谱 (High Performance (High Performance Liguid Liguid Chromatograph Chromatograph 简称简称HPLC)HPLC)又称又称高高速或高压液相色谱。速或高压液相色谱。特点：三高：特点：三高： 高效（高效（高分辨率和高灵敏度高分辨率和高灵敏度）、）、高速、高压高速、高压82吸收了普通液相层析和气相色谱的优点；吸收了普通液相层析和气相色谱的优点；它既有普通液相层析的功能

43、它既有普通液相层析的功能( (可在常温下分离可在常温下分离制备水溶性的物质制备水溶性的物质) )，又有气相色谱的特点，又有气相色谱的特点( (即即高压、高速、高分辨率和高灵敏度高压、高速、高分辨率和高灵敏度) )；适用于很多不易挥发，难热分解物质适用于很多不易挥发，难热分解物质( (如金属如金属离子、蛋白质、肽类、氨基酸及其衍生物、核离子、蛋白质、肽类、氨基酸及其衍生物、核苷、核苷酸、核酸、单糖、寡糖和激素等苷、核苷酸、核酸、单糖、寡糖和激素等) )的的定性和定量分析定性和定量分析，及其制备和分离。，及其制备和分离。8384特别是近年来出现一种与特别是近年来出现一种与HPLCHPLC相近的相近

44、的快速蛋白快速蛋白液相色谱液相色谱(Fast Protein Liquid (Fast Protein Liquid Chromatograph Chromatograph FPLCFPLC) )，能在惰性条件下，以极，能在惰性条件下，以极快的速度把复杂的混合物通过成百上千次层析快的速度把复杂的混合物通过成百上千次层析分开。如果连续进样，一天内可制出大量的欲分开。如果连续进样，一天内可制出大量的欲纯化物质纯化物质。851.1.高效凝胶色谱高效凝胶色谱2.2.疏水性高效液相色谱疏水性高效液相色谱反相高效液相色谱反相高效液相色谱3.3.高效离子交换液相色谱高效离子交换液相色谱4.4.高效亲和液相色

45、谱高效亲和液相色谱5.5.高效聚焦液相色谱等类型。高效聚焦液相色谱等类型。它们的原理基本上与相对应的普通液相层析的原理相似。它们的原理基本上与相对应的普通液相层析的原理相似。其不同之处是高效液相色谱灵敏、快速、分其不同之处是高效液相色谱灵敏、快速、分辨率高、重复辨率高、重复性好，且须在色谱仪中进行。性好，且须在色谱仪中进行。按其固定相的性质可分：按其固定相的性质可分：861.1. 进样系统进样系统2.2. 输液系统输液系统3.3. 分离系统分离系统4.4. 检测系统检测系统5.5. 数据处理系统数据处理系统。878889一般采用隔膜注射进样器或高压进样阀（一般采用隔膜注射进样器或高压进样阀（六

46、通六通阀阀）完成进样操作，进样量是恒定的。这对提）完成进样操作，进样量是恒定的。这对提高分析样品的重复性是有益的。高分析样品的重复性是有益的。90包括包括高压泵、流动相贮存器和梯度仪高压泵、流动相贮存器和梯度仪三部分。三部分。高压泵的压强高压泵的压强为为1.47-4.41.47-4.410107 7 PaPa，流速可调且，流速可调且稳定，高压流动相通过柱层析，可降低样品在稳定，高压流动相通过柱层析，可降低样品在柱中的扩散效应，可加快其在柱中的移动速度，柱中的扩散效应，可加快其在柱中的移动速度，这对提高分辨率、回收样品、保持样品的生物这对提高分辨率、回收样品、保持样品的生物活性等都是有利的。活性

47、等都是有利的。91（1 1）高压泵）高压泵92流动相贮存器和梯度仪，可使流动相随固定相流动相贮存器和梯度仪，可使流动相随固定相和样品的性质而改变，包括改变洗脱液的和样品的性质而改变，包括改变洗脱液的极性、极性、离子强度、离子强度、pHpH值、或改用竞争性抑制剂或变性值、或改用竞争性抑制剂或变性剂剂等。这就可使各种物质等。这就可使各种物质( (即使仅有一个基团的即使仅有一个基团的差别或是同分异构体差别或是同分异构体) )都能获得有效分离。都能获得有效分离。93外梯度外梯度: 利用两台高压输液利用两台高压输液泵，将两种不同极性的泵，将两种不同极性的溶剂按一定的比例送入溶剂按一定的比例送入梯度混合室

48、，混合后进梯度混合室，混合后进入色谱柱。入色谱柱。内梯度内梯度: 一台高压泵一台高压泵, 通通过比例调节阀过比例调节阀,将两将两种或多种不同极性的种或多种不同极性的溶剂按一定的比例抽溶剂按一定的比例抽入高压泵中混合。入高压泵中混合。94包括色谱柱、连接管和恒温器等。包括色谱柱、连接管和恒温器等。色谱柱长度为色谱柱长度为10-50cm(10-50cm(需要两根连用时，可在需要两根连用时，可在二者之间加一连接管二者之间加一连接管) )。内径为。内径为2-5mm2-5mm。由优质。由优质不锈钢或厚壁玻璃管或钛合金等材料制成，柱不锈钢或厚壁玻璃管或钛合金等材料制成，柱内装有直径为内装有直径为5-10m

49、5-10m粒度的固定相粒度的固定相( (由基质和由基质和固定液构成固定液构成) )。95 柱体为直型不锈钢管，内径柱体为直型不锈钢管，内径16 mm，柱，柱长长540 cm。发展趋势是减小填料粒度和柱径。发展趋势是减小填料粒度和柱径以提高柱效。以提高柱效。96固定相中的基质是由机械强度高的树脂或硅胶构成。固定相中的基质是由机械强度高的树脂或硅胶构成。特点：特点：惰性惰性( (如硅胶表面的硅醇基团基本已除去如硅胶表面的硅醇基团基本已除去) ) 多孔性多孔性( (孔径可达孔径可达1000A)1000A)和比表面积大和比表面积大加之其表面经过加之其表面经过机械涂渍机械涂渍( (与气相色谱中固定相的制

50、与气相色谱中固定相的制备一样备一样) )或用或用化学法偶联化学法偶联各种各种基团基团( (如磺酸基、季胺基、如磺酸基、季胺基、羟甲基、苯基、氨基或各种长度碳链的烷基等羟甲基、苯基、氨基或各种长度碳链的烷基等) )或或配配体体的有机化台物。的有机化台物。这类这类固定相对结构不同的物质有良好的选择性。固定相对结构不同的物质有良好的选择性。97另外，固定相基质另外，固定相基质粒度小粒度小，柱床极易达到均匀、致密，柱床极易达到均匀、致密状态，极易降低涡流扩散效应。基质粒度小，微孔浅，状态，极易降低涡流扩散效应。基质粒度小，微孔浅，样品在微孔区内传质短。这些对编小谱带宽度、提高样品在微孔区内传质短。这些

51、对编小谱带宽度、提高分辨率是有益的。根据分辨率是有益的。根据柱效理论柱效理论( (即即塔板理论数塔板理论数N N与理与理论塔板高度论塔板高度H H成反比，而成反比，而H H与颗粒度的平方成正比与颗粒度的平方成正比) )分分析，基质粒度越小，塔板理论数析，基质粒度越小，塔板理论数N N就越大。这也进一就越大。这也进一步证明基质粒度小，会提高分辨率的道理。步证明基质粒度小，会提高分辨率的道理。 高效液相色谱的恒温器可使温度从室温调到高效液相色谱的恒温器可使温度从室温调到6060，通，通过改善过改善传质速度、缩短分析时间传质速度、缩短分析时间。就可增加层析柱的。就可增加层析柱的效率效率98高效液相色谱常用的检测器有高效液相色谱常用的检测器有紫外检测器、示差折光紫外检测器、示差折光检测器和荧光检测器检测器和荧光检测器三种。三种。 （1)1)紫外检测器紫外检测器 适用于对紫外光适用于对紫外光( (或可见光或可见光) )有吸收性能样品的检测。有吸收性能样品的检测。其特点：使用面广其特点：使用面广( (如蛋白质、核酸、氨基酸、核苷酸、如蛋白质、核酸、氨基酸、核苷酸、多肽、激素等均可使用多肽、激素等均可使用) )；灵敏度高