基因工程主要知识点整理

1、第一章 基因克隆基因工程的基本技术有哪些？答：对核算分子的分离、纯化、回收、分析和检测、切割、连接和修饰，以及序列测定、诱变、扩增和转移等基因操作技术。构建基因文库一般使用什么作为载体？答：一般使用大肠杆菌作为载体克隆与亚克隆？答：克隆在一等程度上等同于基因的分离。亚克隆是将目的基因所对应的小段的DNA片段找出来。PCR对基因克隆有什么作用？答：现在基因克隆可以不用通过构建基因文库来实现，可以通过理性设计和PCR扩增获得大多数所需要的基因。但是尽管如此，在不知道基因序列的情况下，如相互作用的基因，表达调控因子，新基因等，还需要构建基因文库来进行基因克隆。第二章 分子克隆工具酶限制与修饰系统？答

2、：限制系统可以排除外来DNA。限制的作用实际就是降解外源DNA，维护宿主稳定的保护机制。甲基化是常见的修饰作用，宿主通过甲基化来达到识别自身遗传物质和外来遗传物质的作用。并且能够保证自身的DNA不被降解。使用最广泛的限制酶？答：EcoR I是应用最广泛的限制性内切酶限制性内切酶的命名？答：宿主属名第一字母、种名头两个字母、菌株号+序列号。如： H in d III限制与修饰系统分类？答：至少可分为3类。II类所占比例最大，其酶分子为内切酶与甲基化分子不在一起，识别位点为4-6bp的回文序列，切割位点为识别位点中或者靠近识别位点。其限制反应与甲基化反应是分开的反应。不需要ATP的参与。限制酶识别

3、的序列长度？结构？答：一般为4-6个bp，即每256和每4096个碱基中存在一个识别位点。回文序列，不对称序列，多种不同序列，间断对称序列限制酶产生的末端？答：1、黏末端2、平末端3、非对称突出末端什么是同裂酶？分类？答：识别相同序列的限制酶称为同裂酶。但他们的切割位点有可能不同。分为：1、同位同切酶2、同位异切酶3、同工多位酶4、其他限制性内切酶的作用是什么？它的反酶是什么？答：什么是同尾酶？答：许多不同的限制酶切割DNA产生的末端是相通的，切实对称的，即他们可产生相同的黏性突出末端。酶切的缓冲液中一般含有什么？作用是？答：调控pH的缓冲剂：稳定溶液的pHMg2+：稳定酶的作用，提高酶的活性

4、，提高酶的特异性DDT（二硫苏糖醇）：防止DNA二聚化，影响酶切结果BSA（小牛血清蛋白）：防止了酶的贴壁效应（可使酶变形），同时减少非特异性吸附，对酶有稳定和促进的作用。酶切的反应温度？反应时间？中止酶切的方法?答：反应温度大多为37，时间一般为2-3h。中止的方法是在65下反应20min。什么星星活性？抑制其发生的办法？答：在极端非标准条件下，限制酶能够切割与识别序列相似的序列，这个改变的特性称为星星活性。抑制星星活性的措施有很多，如减少酶的用量（可避免过分酶切）、减少甘油浓度、保证反应体系中唔有机溶剂或乙醇、提高离子强度到100-150mmol/L（如果不会抑制酶活性的话）和降低反应pH

5、至pH7.0以及保证使用Mg2+作为2价阳离子。影响酶活性的因素有？答：可分为内因和外因外因是可预见的，可控的：反应条件、底物的纯度（是否有杂质、是否有盐离子和苯酚的污染）、何时加酶、操作是否恰当、反应提及的选择以及反应时间的长短等。内因有：星星活性、底物甲基化和底物构象（线性还是超螺旋）原核细胞有几种DNA聚合酶？其特点是什么？答：DNA聚合酶I是单链多肽，可催化单链或者双链DNA的延长；DNA聚合酶II则与低分子脱氧核苷酸链的延长有关；DNA聚合酶III在细胞中存在的数目不多，是促进DNA链延长的主要酶。DNA聚合酶I的三种活性?答：4、置换反应，若体系中只含有一种dNTP，那么会一直重复

6、3过程，直至漏出与该dNTP互补的碱基。总之在没有dNTP的情况下，外切酶活性占主导地位，而当存在足够的dNTP时，外切活性和合成活性将处在平衡状态中，结果使得双链DNA称为平末端。切口平移法是什么？答：切口平移法是作为DNA聚合酶I 的一个应用，Klenow DNA 聚合酶是什么？有什么特征？有什么应用？答：Klenow DNA聚合酶是DNA聚合酶I去掉了5-3外切酶活性的一种聚合酶。但其3-5端的外切酶活性保留。因此应用更为广泛：T4噬菌体DNA聚合酶是怎么得到的？有什么活性？应用？答：来源于T4噬菌体感染的大肠杆菌。其活性与KlenowDNA聚合酶相似，但是其3-5端外切核酸酶活性要强2

7、00倍。且不从单链模板上置换引物，应用：耐热DNA聚合酶有那些？特征是？作用？答：耐热DNA聚合酶是指在高温下具有活性的DNA聚合酶，来自噬高温的细菌，主要用于PCR反应。有TaqDNA聚合酶、Pfu DNA聚合酶等等。DNA连接酶和DNA聚合酶作用方法相同吗？应用相同吗？答：作用方法都是催化磷酸二酯键的形成，但DNA连接酶是连接两个DNA片段，可以是环状DNA可以是单链DNA，而DNA聚合酶是作用一个一个的核苷酸，在复制中发挥作用。反转录酶的来源和活性？答：来源于AMV（禽成髓细胞瘤病毒），含有两条多肽链，具有5-3DNA聚合酶活性和很强的RNase H活性。后者的活性可以用于反转录后降解掉

8、原RNA。末端转移酶来源？活性？答：来源于小牛胸腺，是一种不寻常的DNA聚合酶，是一种不依赖于模板的DNA聚合酶。在2价阳离子存在下，末端转移酶催化dNTP加于DNA分子的3羟基端，改变DNA分子的末端序列。连接酶有哪些？T4连接酶的作用过程？答：有T4 DNA连接酶、大肠杆菌连接酶、Taq连接酶、T4 RNA连接酶T4连接酶的作用过程：催化DNA 5磷酸基与3羟基之间形成磷酸二酯键。反应物为黏末端、切口、平末端的RNA（效率低）或DNA。低浓度的PEG和单价阳离子可以提高平末端连接速度。T4多核苷酸激酶是什么？有什么活性？T4多核苷酸激酶是一种磷酸化酶，可将ATP上的磷酸基团转移到DNA分子

9、5上。具有两种活性：1、正反应：使本来没有磷酸基团的DNA5磷酸化。2、交换反应：使DNA分子5的磷酸基团转移到ADP上，再让ATP上的磷酸基团转移到该DNA分子的5上，发生交换反应。将ATP上的磷酸基团标记，应用广泛。此酶在高ATP浓度是发挥最佳，NH4+是其强烈抑制剂。碱性磷酸酶的用途？答：他们均能催化除去DNA或RNA5的磷酸的反应，通过去除5磷酸基团，可以防止DNA片段发生自连，或标记（5）前除去DNA或RNA5磷酸。核糖核酸酶A的作用？作用方式?答：广泛用来除去DNA样品中的RNA。除去DNA：RNA中未杂交的RNA区，可用来确定DNA或RNA中单碱基突变的位置。核糖核酸酶H 的作用

10、？答：特异性水解与DNA杂交的RNA上的磷酸二酯键，产生带有3羟基和5磷酸末端的产物。主要用于cDNA克隆合成第二链之前，除去RNA。脱氧核糖核苷酸酶I的作用？应用？答：DNase I 来源于牛胰，是内切核苷酸酶，优先从嘧啶核苷酸的位置水解双链或者单链DNA。在Mg2+作用下，独立作用于每条DNA链，其切割位点随机。有Mg2+切割ds DNA同一位置，产生平末端或者12个核苷酸突出的DNA片段。其用途广泛：切口平移标记时在ds DNA上随机产生切口；在闭环DNA上引入单切口，将分子截短；除去RNA样品中的DNA。第三章 分子克隆载体什么是载体？应具备有什么特征？答：将外源DNA或基因片段携带入

11、宿主细胞的工具称为载体。应具备以下特征：1、在宿主细胞内必须能够自主复制（具备复制原点）2、必须具备合适的酶切位点，供外源DNA片段插入，同时不影响其复制3、有一定的标记基因，用于筛选4、最好有较高的拷贝数，便于载体的制备。基因克隆指什么？基因文库是怎样得到的？答：利用重组DNA技术分离目的基因的过程，称为基因克隆。由大量的含有基因组DNA（即某一生物的全部DNA序列）的不同DNA片段的所克隆构成的特殊群体，称之为基因文库。大肠杆菌载体的复制与什么有关？答：其载体上一般带有Pmb1质粒与ColE1质粒的复制起始位点。其RNAII的和成，与RNase H的作用有利于RNAII形成三叶草二级结构，

12、从而引导质粒的复制。而RNAI的合成能够阻断RNAII的二级结构的形成，ROP能够增强RNAI的作用。因此削弱RNAI 与RNAII之间的作用有利于增加复制子的拷贝数严谨性质粒和松弛型质粒表示什么？答：严谨性质粒在每个细胞中的拷贝数有限，大约1几个，而松弛型的拷贝数较多，可达几百。氯霉素可以提高质粒拷贝数的原理？答：氯霉素或者壮观霉素能够抑制蛋白质合成并阻断细菌染色体复制，而质粒能够继续复制，最终每个细胞中可以积聚2000-3000个质粒。从而提高质粒的拷贝数质粒的不相容性和不相容群的定义？答：质粒的不相容性指的是，两个质粒不能够同时在同一个宿主中共存的现象。它是指在第二个质粒导入后，在不涉及

13、DNA限制系统时出现的现象。不相容质粒一般都利用同一复制机制，从而导致不能共存于同一宿主中。不相容群指那些由不相容质粒组成的一个群体，一般有相同的复制子。那么质粒的拷贝数和质粒的不相容性相互矛盾吗？答：复制机制一样可理解为复制量受到的调控是一样的，但由于质粒长短和结构不一样，复制速率是不同的，所以在达到质粒复制量饱和时，复制快的必定占有更多比例，细胞分裂分配后，复制快的质粒就多一点。细胞繁殖几代后，复制速率慢的质粒就接近于消失，这就是不相容原理。1. 如果两种复制机制（复制起点附近区域序列）一样的质粒，复制速率也完全一样，那么它们是能一直共存的（但是要平分拷贝数，比如拷贝数是60，那么各自只有

14、30）2. 复制机制不一样，也就是他们的质粒复制饱和量受不同因子调控，那么各自达到饱和量后再分配，互不影响，可以共存（不平分拷贝数，比如一个是60一个是20，那么总共有80）什么是质粒的转移性？答：质粒具有转移性。在自然条件下，很多质粒可以通过称为细菌接合的作用转移到新宿主细胞内。标记基因分为哪几类？答：按用途可分为、选择标记基因2、筛选标记基因选择标记基因用于鉴别目的DNA（载体）的存在，将成功转化了载体的宿主挑选出来：抗生素抗性基因是目前使用最广泛的标记基因，有：1、氨苄青霉素抗性基因2、四环素抗性基因3、氯霉素抗性基因筛选标记基因可以用于携带了外源DNA片段的的重组子挑选出来。有：1、互

15、补（蓝白板筛选）2、插入失活蓝白板筛选（互补）的原理是？答：质粒载体的种类有？作用？答：1、克隆载体：扩增DNA片段，保存DNA片段。PUC18和PUC19是最常用的质粒载体，只有2686bp，结构组成紧凑，几乎不含多余的DNA片段。PBR322.目前是使用广泛的许多质粒载体几乎都是由此发展而来的2、表达载体：在克隆载体的基础上衍生而来，主要添加了强启动子，以及有利于表达产物分泌、分离或纯化的原件。噬菌体的溶原周期？答：感染敏感细菌后不增殖，不引起宿主菌裂解，而是噬菌体的基因整合于细菌染色体中，这样的噬菌体称为温和噬菌体。此过程称为溶原周期。噬菌体的裂解周期？答：烈性噬菌体（virulent

16、phage）感染宿主细胞后就进入裂解反应，使宿主细胞裂解。整个过程包括：吸附、侵入、脱壳、生物合成、装配和释放。这个过程称为裂解周期。噬菌体基因组的大小的范围是多杀，上下限是？答：当基因组DNA长度为野生型噬菌体基因组DNA的78%105%时，不会影响其存活能力。野生噬菌体的基因组DNA为48kb，若使用的外源DNA片段能够完全替换可取代区域，外源DNA片段的大小将在923kb范围内。第五章 表达载体表达载体的组成？答：表达载体是在克隆载体的基础上增加了表达元件，就构成了表达载体。各种表达载体的不同就在于表达元件的不用。表达原件包括什么？答：1、启动子2、终止子3、核糖体结合位点（SD序列）表

17、达载体的表达形式有？答：分为两种。1、直接转录并翻译出目的基因开放阅读框对应的氨基酸序列，即表达出完整的目的蛋白。2、目的基因可以以融合蛋白的形式表达。T7噬菌体启动子的表达载体的表达机制？答：首先，T7启动子必须结合T7RNA聚合酶才能使目的基因的到表达。宿主的调控系统：当没有诱导物诱导时，lacI基因能够表达，产生阻抑物质，组织T7RNA聚合酶的产生，但可能有渗漏表达。、载体系统的调控（三级调控）：A、宿主细胞染色体上lac基因对T7TNA聚合酶合成的调控吧B、T7RNA聚合酶的活性受T7溶菌酶的限制C、收到在载体上装载的lacI基因的调控。表达载体融合蛋白的分离？答：用作分离的载体蛋白被

18、称为标签蛋白或标签多肽，常用的有谷胱甘肽S转移酶（GST）、六聚组氨酸太，蛋白质A，和纤维素结合域(CBD)等。如图所示，GST基因与多克隆位点的外源基因相连接，可以达到分离的目的。表达产物的纯化？答：1、包含体蛋白的纯化：目的基因表达后的产物在细胞内可以累积并形成颗粒状的的包含体。通过破碎细胞，离心，洗涤可以得到目的蛋白高达90%的包含体，再通过盐酸孤、尿素和SDS等溶解包含体，在通过一定的办法使蛋白质折叠。2、可溶性蛋白的纯化：从细胞碎液上清液中纯化的可溶性表达产物，一般可展现应有的蛋白质活性。也正是表达的目的蛋白。蛋白质表达纯在的问题？答：常规蛋白质的表达大肠杆菌能够满足，但对于某个蛋白

19、质的来说，是否能大量表达，表达的蛋白是否有活性，是否能高效纯化，会受到很多因素的影响。蛋白质自身的属性会影响表达或活性？答：会影响表达和活性的因素：1、蛋白质的相对分子质量，越大则可溶性蛋白越少。2、目的蛋白对细胞生长是否有毒性3、蛋白质的糖基化和二硫键的形成等修饰4、膜蛋白表达是一个问题。宿主与载体的关系？答：宿主与载体一般都都是配套使用的。但不排除更换了宿主能够是目的基因得到更好的表达。什么是穿梭载体？答：穿梭载体就是能够在两类不同宿主中复制、增殖和选择的载体。如有些载体能够在原核细胞中复制又能在真核细胞中复制。这类载体主要是质粒载体。大肠杆菌的质粒载体是最简单的，所以只要涉及到大肠杆菌以

20、外的细胞，绝大多数装有大肠杆菌质粒载体的基本元件，他们都可以看作是穿梭载体。因此，穿梭载体主要是突出其在非大肠杆菌中的操作。用来表达外源基因。第六章 基因操作中大分子的分离和检测质粒碱裂法的原理？答：高pH使质粒DNA和染色体DNA变性，同时沉淀蛋白质。再将pH值调至中性，质粒DNA较小，很容易复性成双链。而染色体DNA较大，缠结成网状不溶物质，从而可以通过离心除去。提取质粒各溶液的作用？答：2、溶液I（Tris-HCl EDTA）：重悬菌体，提供缓冲环境。溶液II（SDS NaOH）：氢氧化钠和SDS裂解菌体细胞壁，在细胞膜上穿孔释放细胞内的质粒。溶液III（KAc 冰醋酸）：中和氢氧化钠、

21、SDS中的钠被钾替换，吸附菌体沉淀，并且高盐溶液使蛋白质沉淀。试剂盒回收原理？答：试剂盒的胶回收柱采用特殊硅基质材料在一定的高盐缓冲系统下高效、专一地吸附DNA、RNA的原理，配备设计独特的离心吸附柱式结构，使用常规台式高速离心机，在几分钟之内即可以高效回收核酸片段。Binding Buffer是为了增加洗脱柱对核酸的结合活性，Wash Solution 是洗掉柱子里除核酸物质以外的杂质，Elution Buffer则是最后把DNA从柱子上洗脱下来使用的溶液。聚丙烯酰胺凝胶电泳？答：为，垂直电泳其分辨率较高，可达到1bp，在DNA序列测定中发挥重要作用。可用于蛋白质的电泳。脉冲场凝胶电泳？答：

22、脉冲场电泳可以有效地分离大相对分子质量的DNA片段。脉冲场凝胶电泳是琼脂糖凝胶电泳的改进方式，是专门针对大片段DNA的分析检测方法。紫外吸收法检测DNA与RNA的浓度和纯度？答：OD260/280od260是核酸吸收的最高峰，od280是蛋白吸收的最高峰。当od260/280处于1.8-2.0时，核酸的纯度较高。由于rna是单链，所以紫外吸收会比dna高一些，所以双链dna的od260/280一般在1.8左右，而rna的od260/280在2.0左右。OD260/230 （你写反了）od230是某些有机试剂和多糖的吸收峰，要是这个值很高，说明你的核酸很纯，要是这个值很低，说明有有机试剂或多糖污

23、染。一般高于2就很好了。DNA浓度（ug/ml ）=OD260/0.02×L×稀释倍数DNA的纯化？答：低熔点琼脂糖凝胶电泳RNA的分离、检测和纯化答：RNA的分离主要是对mRNA的分离。1、控制潜在的RNA酶活性2、RNA的抽提和纯化3、RNA的纯化：由于真核生物mRNA3端的poly(A)尾可与oligo（dT）-纤维素吸附，因此可以利用亲和层析法分离mRNA分子杂交的类型有？1、southern 杂交： a、southern 印记转移：即把琼脂糖凝胶电泳上的单链DNA片段转移到滤膜上b、用基因探针与滤膜上的单链DNA进行分子杂交，如果能够形成杂交带，则说明有目的基因的

24、存在。还能检测DNA片段的大小。这种方法的要求就是一定要有基因探针。2、northern 杂交：与southern 杂交完全相同，只是转移的是RNA，杂交的也是RNA。可以用来开判断在转录水平上某基因是否表达。3、western 杂交：与southern 杂交类似，只不过转移的是蛋白质，杂交的也是蛋白质。用于检测细胞或组织样品中是否存在被没抗体是别的蛋白质，从而判断在翻译水平上某基因是否表达。4、菌落杂交：将细菌菌落影印到滤膜上，或将菌种点到滤膜上，然后再生长出可见的菌落，对滤膜上的菌体进行原位裂解，使DNA释放出来，并使之固定在滤膜上。然后通过分子杂交，判断哪个或哪些菌落含有与探针同源的DN

25、A.DNA微阵列分析？答：是一种高通量的斑点杂交技术。探针标记？答：采用同位素标记和非同位素标记。探针为有一定长度的DNA、RNA或寡核苷酸单链。使用之前要进行标记。随机引物标记：1、制作随机引物：利用由6个核苷酸组成的序列随机的寡核苷酸为引物，在klenowDNA聚合酶的作用下，对待标记的DNA进行随机扩增。这样便拥有了由该6中核苷酸组成的所有序列，采用已经标记的dNTP，便制成随机引物。什么是感受态细胞？答：细胞处于能够吸收DNA的状态称感受态细胞，处于感受态的细胞称作感受态细胞。氯化钙制备感受态细胞原理？答：细菌处于 0,CaCl2 的低渗溶液中,菌细胞膨胀成球形,转化混合物中的 DNA

26、 形成抗DNase 的羟基-钙磷酸复合物粘附于细胞表面,经 42短时间热冲击处理,促使细胞吸收 DNA 复合物.钙离子的作用是结合于细胞膜上,是细胞膜呈现一种液晶态.在冷热变化刺激下液晶态的细胞膜表面会产生裂隙,使外源DNA进入.流程：电转化法？答：也称作电穿孔法，是一种将极性分子穿过细胞膜导入细胞的一种物理方法，在这个过程中一个较大的电脉冲短暂破坏细胞膜的脂质双分子层，从而允许DNA等分子进入进入细胞。转化、转导与转染？答：转化(transformation)指将质粒或其他外源DNA导入处于感受态的宿主细胞，并使其获得新的表型的过程。转导(transduction)由噬菌体和细胞病毒介导的遗

27、传信息转移过程也称转导。转染是通过病毒实现基因转移。PCR扩增原理？答：1、DNA模板的变性（9296）：双链变单链。2、复性（退火）（3742）：引物与模板结合3、延伸（72）：DNA聚合酶将dNTP连续加到引物的3端，合成DNA。退火温度尽可能高，防止非特异性结合。PCR的反应体系？答：缓冲液， CaCl2、上游引物、下游引物、模板DN、dNTP、Taq酶、A/T克隆法？答：TA克隆方法（Original TA Cloning Kit）把PCR片段与一个具有3-T突出的载体DNA连接起来的方法。因为PCR反应中所使用的聚合酶具有末端转移的活性，通常在3'加上A。例如：Taq聚合酶同

28、时具有的末端连接酶的功能，PCR反应时在每条PCR扩增产物的3端自动添加一个3-A突出端。只有用经过特殊处理的具有3-T突出末端的DNA片断才能通过T/A配对进行连接。通过PCR的方法扩增目的基因片断的过程中，由于往往不清楚目的基因的DNA序列，获得的目的片断通常需要通过TA克隆的方法，重组到T-载体中，通过序列测定清楚DNA序列。达到高效克隆的目的。染色体步查法？答：染色体步查采用一段分离自某一重组体一端的非重复DNA片段作为探针以鉴定含有相邻序列的重组克隆。其中包含有反向PCR：反转录PCR的步骤？答：第九章 DNA序列分析第一代测序技术与第二代测序技术的区别？答：第一代测序技术为先合成后

29、测序。第二代测序技术为边合成边测序。Sanger双脱氧链终止法？答：DNA片段序列测定的策略有？答：1、通用引物指导未知序列的测定：将待测的未知序列DNA片段装载到载体上，再通过通用引物来测定待测片段的末端序列。2、引物步移：知道了未知序列中的一小段DNA序列，可以根据该序列来设计引物，从而测定该已知序列周围的片段。并可以以此类推，引物步移3、随机克隆测序：第十一章 DNA文库的构建和目的基因的筛选基因文库定义？答：也称DNA文库，是指某一生物体全部或部分基因的集合，像一个没有目录的“图书馆”。将含有某种生物不同基因的DNA片段，导入受体菌的群体中储存，各菌分别含有这种生物不同的基因，称为基因文库。基因文库的组成？答：有三部分组成。1、外源DNA片段2、载体3、宿主构建基因文库的基本程序？答：1、提取研究对象基因DNA，制备合适大小的DNA片段，或提取组织或器官的mRNA并反转录成cDNA；2、DNA片段或cDNA与经过特殊处理的载体连接形成重组DNA；3、重组DNA转化宿主细胞或体外包装后侵染受体菌；4、阳性重组菌落或噬菌斑的选择基因文库分类？答：按照外源DNA片段来源，可将基因文库分为基因组DNA文库和cDN