第二章+基因工程载体和工具酶

1、第二章第二章 基因工程载体和工基因工程载体和工具酶具酶湖南师范大学生命科学学院湖南师范大学生命科学学院袁婺洲袁婺洲本章目录本章目录l2.1 2.1 载体载体l2.1.1 2.1.1 质粒载体质粒载体l2.1.2 2.1.2 噬菌体载体噬菌体载体l2.1.3 2.1.3 其他载体其他载体l2.2 2.2 工具酶工具酶l2.2.1 2.2.1 限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶l2.2.2 DNA2.2.2 DNA聚合酶和聚合酶和KlenowKlenow大片段大片段l2.2.3 DNA2.2.3 DNA连接酶连接酶l2.2.4 2.2.4 碱性磷酸酶碱性磷酸酶 l2.2.5 2.2.5 末端脱氧核苷

2、酸转移酶末端脱氧核苷酸转移酶第二章第二章 基因工程载体和工具酶基因工程载体和工具酶第一节第一节 载体载体载体的功能及特征载体的功能及特征运送外源基因高效转入受体细胞运送外源基因高效转入受体细胞为外源基因提供复制能力或整合能力为外源基因提供复制能力或整合能力为外源基因的扩增或表达提供必要的条件为外源基因的扩增或表达提供必要的条件克隆载体应具备的条件克隆载体应具备的条件具有针对受体细胞的亲缘性或亲和性（可转移性）具有针对受体细胞的亲缘性或亲和性（可转移性） 具有合适的筛选标记具有合适的筛选标记 具有较具有较高的外源高的外源DNA的装载能力的装载能力 具有多种单一的核酸内切酶识别切割位点具有多种单一

3、的核酸内切酶识别切割位点 具有与特定受体细胞相适应的复制位点整合位点具有与特定受体细胞相适应的复制位点整合位点 1. 1. 质粒质粒 plasmidplasmidl细菌染色体外的遗传因子，闭合环状双链细菌染色体外的遗传因子，闭合环状双链DNADNAl大小：大小：1-200kb1-200kbl能自主复制，但要利用寄主细胞复制染色体的同能自主复制，但要利用寄主细胞复制染色体的同一组酶系一组酶系l复制分松弛型和严谨型两种复制分松弛型和严谨型两种 松弛型：松弛型：10-200 10-200 拷贝（加氯霉素扩增）拷贝（加氯霉素扩增） 严谨型：严谨型： 1-10 1-10 拷贝拷贝l有某些基因，如抗药性基

4、因，对寄主的生长是有有某些基因，如抗药性基因，对寄主的生长是有利的利的天然质粒天然质粒PcopcopP/OrepreporiCopRep1.质粒的自主复制性：ColE1、pMB1、 pSC101等不同启动子等不同启动子pMB1质粒DNA复制启动控制松弛型质粒启动子的突变质粒的基本特征质粒的基本特征2. 质粒的不相容性质粒的不相容性任何两种含有相似复制子结构的不同质粒，不能同时存在于任何两种含有相似复制子结构的不同质粒，不能同时存在于一个细胞中，这种现象称为一个细胞中，这种现象称为质粒的不相容性。质粒的不相容性。质粒的基本特征质粒的基本特征以大肠杆菌的质粒为例：以大肠杆菌的质粒为例：lColE1

5、ColE1、pMB1 pMB1 拥有相似的复制子结构，彼此不相容拥有相似的复制子结构，彼此不相容lpSC101pSC101、F F、RP4 RP4 拥有相似的拥有相似的复制子结构复制子结构，彼此不相容，彼此不相容3.携带特殊的遗传标记：抗生素标记基因携带特殊的遗传标记：抗生素标记基因1) 氨苄青霉素抗性基因氨苄青霉素抗性基因 2)2)四环素抗性基因四环素抗性基因 3)3)氯霉素抗性基因氯霉素抗性基因 4)4)卡那霉素和新霉素抗性基因卡那霉素和新霉素抗性基因 5 5）lacZlacZ基因基因质粒的基本特征质粒的基本特征3.携带特殊的遗传标记：抗生素标记基因携带特殊的遗传标记：抗生素标记基因1)

6、氨苄青霉素抗性基因氨苄青霉素抗性基因 2)2)四环素抗性基因四环素抗性基因 3)3)氯霉素抗性基因氯霉素抗性基因 4)4)卡那霉素和新霉素抗性基因卡那霉素和新霉素抗性基因 5 5）lacZlacZ基因基因Lac Z基因的显色原理：基因的显色原理：OHHHOHHOHHOHCH2OHONClBrClBrClBrONNLacZLacZ基因表基因表达的蓝白斑达的蓝白斑菌落菌落基因工程质粒：基因工程质粒：Plasmid pBR322Plasmid pBR322松驰型质粒松驰型质粒AmpAmpr r， TetTetr r多种限制性酶切位点多种限制性酶切位点全长全长 4362 4362 bpbpPlasmi

7、d pBR322Plasmid pBR322结构图结构图4363bppBR322pBR322质粒结构来源质粒结构来源Plasmid plink 322l在pBR322基础上改建，增加了一个多接头（polylinker），即增加了多克隆位点。l全长 3.8 kbPlasmid plink 322 pUCpUC 质粒质粒(University of California)(University of California) lpUCpUC 质粒质粒 是由大肠杆菌是由大肠杆菌 pBR322 pBR322 质粒质粒 与与M13 M13 噬菌体改建噬菌体改建而成的双链而成的双链DNADNA质粒载体质粒载

8、体l pUCpUC 18/pUC 19 18/pUC 19 全长全长 2674 2674 bpbp ，有有 Amp Amp 抗性基因，一个抗性基因，一个复制起点复制起点oriori。带有带有laclac Z Z的的N N端端 标记序列；因在复制起点标记序列；因在复制起点oriori区域内缺失区域内缺失 roprop 基因（改进的基因（改进的pMB1pMB1复制子），细胞即使复制子），细胞即使生长在无氯霉素环境中也可形成高拷贝数（生长在无氯霉素环境中也可形成高拷贝数（500-700500-700）。）。l宿主菌携带宿主菌携带半乳糖苷酶半乳糖苷酶C C端序列。重组子菌落是白色，端序列。重组子菌落是

9、白色，空转化子是蓝色。空转化子是蓝色。Plasmid pUC 18/pUC 19 结构结构 改建质粒的要求：改建质粒的要求：l尽可能使质粒缩小，以便插入更大的外源DNA片段；l增加多种酶切位点；l增加标记基因；l提高外源DNA的表达水平；l增加质粒在受体细胞中的拷贝数转化子的筛选方法转化子的筛选方法l遗传标记筛选（载体与目的基因本身）遗传标记筛选（载体与目的基因本身）lDNADNA片段大小检测片段大小检测l核酸分子杂交核酸分子杂交l目的基因表达产物检测目的基因表达产物检测pBR322 pBR322 质粒克隆外源基因的过程质粒克隆外源基因的过程 载体遗传标记检测载体遗传标记检测l抗药性筛选法抗药

10、性筛选法ROPROISal IBamH ITcrPvu IPst IPst IEcoR ICla IHind IIIHind IIBal IAprpBR3224363 bporil将外源将外源DNA片段插在片段插在EcoRI位点：位点： l非重组子呈非重组子呈 Apr、Tcr l重组子呈重组子呈 Apr、Tcr l将外源将外源DNA片段插在片段插在BamHI位点：位点： l非重组子呈非重组子呈 Apr、Tcr l重组子呈重组子呈 Apr、Tcs l载体遗传标记检测载体遗传标记检测l显色筛选法显色筛选法pUC18AprlacZorilApr + X-gall重组子（重组子（Apr + lacZ-

11、） l将外源基因克隆在将外源基因克隆在pUC18的的lacZ标标记记基因内部，使之灭活，此时重组基因内部，使之灭活，此时重组子呈子呈Apr、lacZ-，白色菌落；而非白色菌落；而非重组子则呈重组子则呈Apr、lacZ+，蓝色菌落蓝色菌落 lDNADNA片段大小检测片段大小检测l全酶解图谱法：全酶解图谱法：pUC18 2.7 kblHindIII SphI PstI SalI BamHI SmaI KpnI EcoRIAprlacZorilBlBlElPl4.0 kbl1.0 kbl0.8 kbl用用BamHI酶切转化子质粒酶切转化子质粒DNAl电泳观察酶解产物片段：电泳观察酶解产物片段：l重组

12、子：重组子： 2.7 kb + 4.0 kbl非重组子：非重组子： 2.7 kblDNADNA片段大小检测片段大小检测l全酶解图谱法：全酶解图谱法：pUC18 2.7 kblHindIII SphI PstI SalI BamHI SmaI KpnI EcoRIAprlacZoriBP4.0 kb1.0 kb0.8 kbl用用EcoRI酶切转化子质粒酶切转化子质粒DNAl目的重组子：目的重组子： 3.0 kb + 3.7 kbl 或者：或者： 1.0 kb + 5.7 kbl用用PstI酶切转化子质粒酶切转化子质粒DNAl目的重组子：目的重组子： 3.2 kb + 3.5 kbl 或者：或者：

13、 0.8 kb + 5.9 kb质粒质粒DNADNA提取的策略提取的策略l质粒质粒DNADNA的提取的提取细菌细胞破碎细菌细胞破碎-碱使染色体碱使染色体DNADNA变性变性-离心分离离心分离-收集质粒收集质粒DNA-DNA- -纯化纯化-保存保存l真核细胞真核细胞DNADNA的提取的提取研磨使细胞破碎研磨使细胞破碎-蛋白酶蛋白酶K K去核蛋白去核蛋白-分离蛋白质与分离蛋白质与DNA-DNA-纯化纯化- -沉淀沉淀-纯度检测纯度检测质粒质粒DNADNA的纯化的纯化lRNA酶去RNAlSDS-蛋白复合物l蛋白酶K去蛋白质l酚-氯仿抽提l纯化试剂盒l紫外分光光度计测A260与A280值：18 或20

14、质粒质粒DNADNA沉淀沉淀l二倍体积的无水乙醇与DNA相混合。使乙醇的终含量占67%左右。室温静置30分钟。l乙醇沉淀时，加NaAc or NaCl至终浓度为01-025M，是为了中和DNA分子在碱性条件下所带的负电荷，减少DNA分子同性电荷的相斥力。l06倍体积的异丙醇沉淀，-20C半小时。DNADNA分离分离l琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳l聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳l氯化铯密度梯度离心氯化铯密度梯度离心DNADNA浓度检测浓度检测l琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳 0.05-0.10.05-0.1g glEB-EB-标准标准DNADNA浓度比较浓度比较: 1 : 1 ngngl紫外

15、分光光度计测紫外分光光度计测A260: 0.1-1 ideal, 0.05-1.5 acceptedA260: 0.1-1 ideal, 0.05-1.5 acceptedl纯度纯度: :分光光度计不但能确定核酸的浓度，还可以通过分光光度计不但能确定核酸的浓度，还可以通过A260/A280A260/A280估计核酸纯度。纯估计核酸纯度。纯DNADNA其比值为其比值为1.81.8，纯，纯RNARNA为为2.02.0。如比值高于如比值高于1.81.8，说明，说明DNADNA样品中含样品中含RNARNA，而样品中的酚和蛋而样品中的酚和蛋白质将会导致比值降低。白质将会导致比值降低。EB与与DNADNA

16、DNA大小测量大小测量l凝胶上与标准分子量比较lHindIIIl100bp ladderl自己的marker在紫外透射仪下看在紫外透射仪下看DNADNA时，时，DNADNA亮度与哪些因素有亮度与哪些因素有关？关？lDNADNA浓度浓度lDNADNA大小大小l波长波长l纯度纯度lEBEB量等有关量等有关DNADNA电泳结果分析电泳结果分析2. 2. 噬菌体噬菌体l 噬菌体噬菌体DNA DNA 是线性双链是线性双链DNADNA分子，分子，48.5kb48.5kbl噬菌体噬菌体粒子，粒子，DNADNA线性双链，带有线性双链，带有12bp12bp的粘性末端，称为的粘性末端，称为coscos位点。位点。

17、 噬菌体感染细菌以后，双链噬菌体感染细菌以后，双链DNADNA分子通过分子通过COSCOS位点成环状位点成环状l基因组三个区域：基因组三个区域： 左侧：包括外壳蛋白基因，左侧：包括外壳蛋白基因，20kb20kb 中间区：中间区：18kb18kb 右侧：复制及裂解基因，右侧：复制及裂解基因，12kb 12kb DNA+DNA+外源外源DNADNA之和必须在之和必须在39-53kb39-53kb之间，所以可插入之间，所以可插入7-21kb7-21kb的外源的外源片段片段 5 TCCAGCGGCGGGG33CCCGCCGCTGGA 5 COSCOScos头部合成基因头部合成基因尾部合成基因尾部合成基

18、因溶菌控制基因溶菌控制基因晚期控制基因晚期控制基因DNA合成控制合成控制基因基因阻遏基因阻遏基因早期控制基因早期控制基因阻遏基因阻遏基因重组基因重组基因删除与整合基因删除与整合基因l - DNA噬菌体的基因组结构噬菌体的基因组结构-DNA-DNA载体的构建：载体的构建：删除重复的酶切位点删除重复的酶切位点野生型的野生型的l l-DNA链上有链上有5个个EcoRI位点和位点和7个个HindIII位点，位点， 不利于重组操作，必须删除至不利于重组操作，必须删除至1 - 2个个同时，为了便于各种来源的同时，为了便于各种来源的DNA片段的克隆，还需要增片段的克隆，还需要增 加一些单一的酶切位点加一些单

19、一的酶切位点除了简单的切割外，还需要采用定点突变技术去除或增除了简单的切割外，还需要采用定点突变技术去除或增加酶位点加酶位点-DNA-DNA载体的构建：载体的构建：加装选择标记加装选择标记 与质粒不同，野生型与质粒不同，野生型-DNA-DNA上缺少合适的选择标记，上缺少合适的选择标记，因此因此加装加装选择标记是选择标记是l l-DNA-DNA克隆载体构建的重要内克隆载体构建的重要内容容ll l-DNA克隆载体上的选择标记主要有下列两类：克隆载体上的选择标记主要有下列两类：l免疫功能类标记免疫功能类标记l颜色反应类标记颜色反应类标记-DNA-DNA载体的构建：载体的构建：加装选择标记加装选择标记

20、 lacZllacZ基因编码基因编码b b-半乳糖苷酶，能催化半乳糖苷酶，能催化l无色的无色的X-gal生成蓝色化合物。当外源基生成蓝色化合物。当外源基l因插入到因插入到lacZ基因中，基因灭活，不能基因中，基因灭活，不能l合成蓝色化合物；而空载体合成蓝色化合物；而空载体l l-DNA则产则产l生蓝色透明斑生蓝色透明斑( (一一) )插入型载体插入型载体在在Charon4Charon4载体中克隆载体中克隆外源外源DNADNA3. M133. M13单链噬菌体单链噬菌体lM13噬菌体的生物学特性：噬菌体的生物学特性： 生物结构生物结构lM13噬菌体的外型呈丝状噬菌体的外型呈丝状lM13 噬菌体噬

21、菌体由外壳包装蛋白和由外壳包装蛋白和正正链链DNA组成组成 lM13 DNA全长全长6407个核苷酸个核苷酸lM13 DNA上上至少有至少有10个基因个基因2700个外壳蛋白分子个外壳蛋白分子lM13 噬菌体噬菌体不裂解宿主细胞，但抑制其生长不裂解宿主细胞，但抑制其生长 大肠杆菌的大肠杆菌的M13M13单链噬菌体单链噬菌体DNADNAlM13 DNA载体的构建：载体的构建：lIII VI I IV II X V VII IX VIII野生型野生型M13RF-DNAlIII VI I IV II X V VII IX VIIIM13mp系列载体系列载体lacZpolylinkerDNADNA测序

22、测序片段的片段的扩增扩增4. 4. 柯柯斯斯质粒质粒cosmidcosmidl19781978年由年由CollinsCollins和和 HohnHohn改建改建l正常的质粒与噬菌体的正常的质粒与噬菌体的coscos位点构成位点构成l有有AmpAmp，TetTet 抗性基因抗性基因 lCosCos位点可识别噬菌体的外壳蛋白，可被包装位点可识别噬菌体的外壳蛋白，可被包装 柯柯斯质粒（斯质粒（cosmid）的结构的结构pHC796400 bpTcrl l fragmentcosoriAprPstIBamHISalI1.8 kb的的l l-DNA片段片段 + pBR322片段片段装载范围为装载范围为3

23、1 - 45 kb柯斯质粒斯质粒载体的特点：载体的特点：能像能像l l-DNA那样进行体外包装，并高效转染受体细胞那样进行体外包装，并高效转染受体细胞 装载量大（装载量大（45 kb）且克隆片段具有一定的大小范围且克隆片段具有一定的大小范围能像质粒那样在受体细胞能像质粒那样在受体细胞中自主复制中自主复制重组操作简便，筛选容易重组操作简便，筛选容易不能体内包装，不裂解不能体内包装，不裂解受体细胞受体细胞柯斯质粒的克隆过程5.5.人工微小染色体人工微小染色体 lYAC, yeast artificial chromosomelBAC, bacteria artificial chromosomel

24、PAC, P1 artificial chromosomelMAC,mammal cell artificial chromosomelFosmid, F因子因子 改建改建 而来而来 酵母人工染色体（酵母人工染色体（YACYAC）YAC载体应含有下列元件：载体应含有下列元件： 酵母染色体的端粒序列酵母染色体的端粒序列 pYAC4CEN4EcoRIURA3TELBamHITELoriAprTRP1ARS1酵母染色体的复制子酵母染色体的复制子 酵母染色体的中心粒序列酵母染色体的中心粒序列 酵母系统的酵母系统的选择标记选择标记大肠杆菌的复制子大肠杆菌的复制子 大肠杆菌的大肠杆菌的选择标记选择标记YA

25、C载体的装载量为载体的装载量为350 - 400 kbYACYAC的构建的构建酵母人工染色体的应用酵母人工染色体的应用克隆载体的发展历史：克隆载体的发展历史：l第一代：环状质粒，装载几个到十几个第一代：环状质粒，装载几个到十几个kbkb片段片段; ;l第二代：经过改建的病毒，装载能力第二代：经过改建的病毒，装载能力kbkb左右左右; ;l第三代：第三代：cosmidcosmid, ,装载能力装载能力30-40kb;30-40kb;l第四代第四代: YAC, : YAC, 装载能力装载能力1-2 Mb;1-2 Mb;l第第 五代五代: : 新型载体新型载体: BAC, PAC, MAC, : B

26、AC, PAC, MAC, FosmidFosmid 等等, ,装载能力装载能力80-200kb80-200kb6.6.穿梭质粒载体穿梭质粒载体 （shuttle plasmid vectorshuttle plasmid vector） 是一类由人工构建的具有两种不同复制是一类由人工构建的具有两种不同复制起点和选择记号，因而可在两种不同的寄主起点和选择记号，因而可在两种不同的寄主细胞中存活和复制的质粒载体。细胞中存活和复制的质粒载体。大肠杆菌大肠杆菌- -酿酒酵母酿酒酵母穿梭质粒穿梭质粒载体载体7. 7. 表达载体表达载体l表达载体是将目的基因在人工控制下置于生物宿主中大量生产表达载体是将目

27、的基因在人工控制下置于生物宿主中大量生产的载体的载体. .l表达载体三个系统表达载体三个系统: :1. DNADNA复制及质粒复制及质粒DNADNA的筛选的筛选: : 有有DNADNA复制起点复制起点oriori, , 及及Amp, Amp, TetTet抗抗性基因性基因2. 2. 目的基因的转录目的基因的转录: :这一系统包括启动子这一系统包括启动子, ,抑制物基因和转录终止子抑制物基因和转录终止子. .启动子位于目的基因的上游启动子位于目的基因的上游, ,常用的如常用的如PlaczPlacz等等. .3. 3. 蛋白质的翻译蛋白质的翻译: :包括核糖体识别位点包括核糖体识别位点SD,SD,

28、翻译起始密码子和终止密翻译起始密码子和终止密码子码子. . pQE30载体l属于PDS质粒家族l大肠杆菌T5启动子 和转录终止信号l表达的蛋白带有一个六聚组氨酸接头GEX-4T-1原核表达载体：l具有可高效诱导表达的tac启动子；l采用温和洗脱条件可将融合蛋白从亲和介质中洗脱下来，最大限度减少对蛋白活性的影响；l具有专一性的凝血酶识别位点，可从融合产物中得到纯化的目标蛋白 含有氨苄青霉含有氨苄青霉素抗性的素抗性的pDNA3.1(-)pDNA3.1(-)真真核表达质粒核表达质粒 吉欧霉素吉欧霉素第二章第二章 基因工程载体和工具酶基因工程载体和工具酶第二节第二节 工具酶工具酶l用于核酸操作的工具酶

29、用于核酸操作的工具酶l限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶lDNA连接酶连接酶lDNA聚合酶聚合酶l碱性磷酸酯酶碱性磷酸酯酶l末端转移酶末端转移酶1. 1. 限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶识别双链识别双链DNA分子中的特定序列，并切割分子中的特定序列，并切割DNA双链双链主要存在于原核细菌中，细菌的限制与修饰作用主要存在于原核细菌中，细菌的限制与修饰作用，帮助细菌限制外来帮助细菌限制外来DNADNA的入侵的入侵19681968年，年，SmithSmith等人首先从流感嗜血杆菌等人首先从流感嗜血杆菌d d株中分离出株中分离出 Hind IIHind II和和Hind IIIHind III 限制性

30、核酸内切酶的命名限制性核酸内切酶的命名属名属名 种名种名 株名株名lH i n d III E co R IlHaemophilus influenzae d 嗜血流感杆菌嗜血流感杆菌d株株l同一菌株中所含的多个不同的限制性核酸内切酶同一菌株中所含的多个不同的限制性核酸内切酶Escherichia coli R限制性核酸内切酶的种类限制性核酸内切酶的种类l1986 1986 年年 , ,615615 种限制酶种限制酶, 98 , 98 种甲基化酶；种甲基化酶；l 1998 1998 年年 ,10000 ,10000 种细菌或古细菌中存在种细菌或古细菌中存在 3000 3000 种酶种酶; ;l

31、2005 2005 年年 1 1 月，共发现月，共发现 4342 4342 种限制酶和甲基化酶，其中限制酶种限制酶和甲基化酶，其中限制酶有有 36813681 种，种，l商业化的限制酶有商业化的限制酶有 588588 种，在种，在 型限制酶中共有型限制酶中共有 221 221 种特异种特异性。性。 限制性核酸内切酶的分类限制性核酸内切酶的分类主要特性主要特性 I 型型 II 型型 III 型型限制修饰限制修饰多功能多功能单功能单功能双功能双功能蛋白结构蛋白结构异源三聚体异源三聚体同源二聚体同源二聚体异源二聚体异源二聚体辅助因子辅助因子ATP Mg2+ SAMATP Mg2+ SAMMg2+识别

32、序列识别序列TGAN8TGCT回文对称序列回文对称序列GAGCCAACN6GTGCCAGCAG切割位点切割位点距识别序列距识别序列1kb处处识别序列内或附近识别序列内或附近距识别序列下游距识别序列下游随机性切割随机性切割特异性切割特异性切割24-26bp处处II II 型限制性核酸内切酶的基本特性型限制性核酸内切酶的基本特性识别双链识别双链DNA分子中分子中4 - 8对碱基对碱基的特定序列的特定序列大部分酶的大部分酶的切割位点切割位点在识别序列内部或两侧在识别序列内部或两侧识别切割序列呈典型的旋转对称型识别切割序列呈典型的旋转对称型回文结构回文结构5 G C T G A A T T C G A

33、 G 33 C G A C T T A A G C T C 5EcoR I的识别序列的识别序列EcoR I的切割位点的切割位点EcoRIEcoRI等产生的等产生的55粘性末粘性末端端5 G-C-T-G-A-A-T-T-C-G-A-G 33 C-G-A-C-T-T-A-A-G-C-T-C 5EcoRI 37 5 G-C-T-G-OH P-A-A-T-T-C-G-A-G 33 C-G-A-C-T-T-A-A-P OH-G-C-T-C 5 退火退火 4-7 5 G-C-T-G A-A-T-T-C-G-A-G 33 C-G-A-C-T-T-A-A G-C-T-C 5OH POHPPstIPstI等产生

34、的等产生的33粘性末粘性末端端5 G-C-T-C-T-G-C-A-G-G-A-G 33 C-G-A-G-A-C-G-T-C-C-T-C 5PstI 37 5 G-C-T-C-T-G-C-A-OH P-G-G-A-G 33 C-G-A-G-P OH-A-C-G-T-C-C-T-C 5 退火退火 4-7 5 G-C-T-C-T-G-C-A G-G-A-G 33 C-G-A-G A-C-G-T-C-C-T-C 5OHOHPPPvuIIPvuII等产生的平头末端等产生的平头末端5 G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G 33 C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C 5PvuII 37

35、5 G-C-T-C-A-G-OH P-C-T-G-G-A-G 33 C-G-A-G-T-C-P OH-G-A-C-C-T-C 5 限制性核酸内切酶酶切位点出现频率限制性核酸内切酶酶切位点出现频率44256464096同裂酶（同切点酶）： 来源不同，识别顺序相同或相近，切割序列相同，产生相同来源不同，识别顺序相同或相近，切割序列相同，产生相同或不同的粘性末端。或者说：不同来源的限制酶可以切割相或不同的粘性末端。或者说：不同来源的限制酶可以切割相同的序列。同的序列。 lSau3A I : 5-GATC-3l 3-CTAG-5lBamH I: 5-GGATCC-3l 3-CCTAGG-5同尾酶： 来

36、源各异，识别靶序列各不相同，但产生相同的粘性末端。 lBgl II : 5-AGATCT-3l 3-TCTAGA-5lBamH I: 5-GGATCC-3l 3-CCTAGG-5影响限制性核酸内切酶活性的因素影响限制性核酸内切酶活性的因素lDNADNA的纯度的纯度( (蛋白质、酚、氯仿、蛋白质、酚、氯仿、EDTAEDTA、SDSSDS、高浓度的盐、高浓度的盐离子等离子等) )lDNADNA的甲基化程度的甲基化程度l酶切消化反应的温度酶切消化反应的温度lDNADNA的分子结构的分子结构l限制性核酸内切酶的缓冲液限制性核酸内切酶的缓冲液影响限制性核酸内切酶活性的因素1.DNA样品的纯度：样品的纯度

37、：蛋白质、苯酚、氯仿、乙醇、蛋白质、苯酚、氯仿、乙醇、EDTA、SDS、NaCl等等l加大酶的用量，加大酶的用量，1 m mg DNA 用用 10U 酶酶l加大反应总体积加大反应总体积l延长反应时间延长反应时间2.2.缓冲液缓冲液Tris-HCl50 mM pH 7.5MgCl210 mMNaCl0 - 150 mMDTT1 mM0 - 50 mM 低盐酶低盐酶100 mM 中盐酶中盐酶150 mM 高盐酶高盐酶Volume20 - 100 m mlT T37 1 - 1.5 hr影响限制性核酸内切酶活性的因素:1 U 核酸内切酶的酶活性：在最佳反应条件下反应核酸内切酶的酶活性：在最佳反应条件

38、下反应 1 小时，完全水解小时，完全水解 1 mg 标准标准DNA所需的酶量所需的酶量II II 型核酸内切酶的多酶联合酶解型核酸内切酶的多酶联合酶解l对盐浓度要求不同的酶，可采取下列方法：对盐浓度要求不同的酶，可采取下列方法：l使用较贵的酶的盐浓度，加大便宜酶的用量，同时酶解使用较贵的酶的盐浓度，加大便宜酶的用量，同时酶解l低盐酶先切，然后补加盐，高盐酶再切低盐酶先切，然后补加盐，高盐酶再切l一种酶先切，然后更换缓冲液，另一种酶再切一种酶先切，然后更换缓冲液，另一种酶再切2 2、DNADNA连接酶连接酶l作用：负责双链作用：负责双链DNADNA中相邻中相邻3-OH3-OH与与5-5-磷酸基团

39、之间的磷酸二磷酸基团之间的磷酸二酯键的形成。酯键的形成。l只能连接切口（只能连接切口（nick or nick or nikenike）不能连接缺口（）不能连接缺口（gapgap）平头双链平头双链DNADNA片段的连接操作片段的连接操作l粘性末端的连接属于分子内部的连接粘性末端的连接属于分子内部的连接l平头末端的连接则属于分子间的连接平头末端的连接则属于分子间的连接l提高平头末端连接效率的方法包括：提高平头末端连接效率的方法包括： l加大连接酶用量（加大连接酶用量（10倍大于粘性末端的连接）倍大于粘性末端的连接） l加大平头末端底物的浓度，增加分子间碰撞机会加大平头末端底物的浓度，增加分子间碰

40、撞机会 平头末端人工粘性末端的连接平头末端人工粘性末端的连接C 3 GG5 G 3C5C3 GT4-DNA 连接酶TdTTdTdTTPdATPGTTTTTTTTTT 3C退火退火C3 TTTTTTTTTTGCAAAAAAAAAA 3 GG3 AAAAAAAAAAC5 5GTTTTTTTTTTGCAAAAAAAAAACCAAAAAAAAAACGTTTTTTTTTTGC3 5 5GTTTTTTTTTTGCAAAAAAAAAACCAAAAAAAAAACGTTTTTTTTTTG同种内切酶生产的粘性末端的连接同种内切酶生产的粘性末端的连接5 5GAATTCCTTAAGGAATTCCTTAAGEcoRI5

41、GCTTAAAATTCG5 5 GCTTAA 55 AATTCG5 退火退火GCTTAAAATTCG5 GCTTAA 5 AATTCGGCTTAAAATTCG5 GCTTAA 5 AATTCGT4-DNA ligaseGAATTCCTTAAG5 5GAATTCCTTAAGGAATTCCTTAAG5 5GAATTCCTTAAG同尾酶生产的粘性末端的连接同尾酶生产的粘性末端的连接BamHI5 5GGATCCCCTAGGGGATCCCCTAGG5GCCTAGGATCCG5 5 TACTAG 55 GATCAT5 退火退火GCCTAGGATCCG5 TACTAG 5 GATCATT4-DNA liga

42、seTGATCCACTAGG5 5GGATCACCTAGT5 TGATCAACTAGT5 Bcl IIGCCTAGGATCCG5 TACTAG 5 GATCATTGATCCACTAGG5 5GGATCACCTAGT不同粘性末端的连接不同粘性末端的连接BamHI5 5GGATCCCCTAGGGGATCCCCTAGG5GCCTAGGATCCG5 5 CTGCAG5 GACGTC3 T4-DNA ligaseCGATCCGCTAGG5 5GGATCGCCTAGC5 CTGCAGGACGTC5 PstI3 T4-DNA pol切平切平5 CG5 GCKlenow补平补平5GGATCCCTAGGATCC

43、5 CTAGGCGATCCGCTAGG5 5GGATCGCCTAGCDNADNA连接酶的反应条件：连接酶的反应条件：Tris-HCl50 - 100 mM pH 7.5MgCl210 mMATP0.5 - 1 mMDTT5 mMVolume10 - 20 m mlT T4 - 15 4 - 16 hr1 U DNA连接酶的酶活性：在最佳反应条件下连接酶的酶活性：在最佳反应条件下15 反应反应 1 小时，完全连小时，完全连接接 1 mg l-DNA（Hind III片段）所需的酶量片段）所需的酶量l重组率重组率l重组率的定义重组率的定义l 重组率重组率 = = 含有外源含有外源DNA的重组分子数

44、的重组分子数 / / 载体分载体分子总数子总数l 在常规实验条件下，重组率一般为在常规实验条件下，重组率一般为25 - 75%l 提高重组率的方法：提高重组率的方法：提高外源提高外源DNADNA片段与载体的分子比：片段与载体的分子比：5 : 1 - 10 : 15 : 1 - 10 : 1载体载体DNADNA分子在连接前先除去磷酸基团分子在连接前先除去磷酸基团 平头末端增加同聚物尾巴平头末端增加同聚物尾巴 l转化率转化率l转化率的定义转化率的定义l 转化率是每转化率是每微克微克载体载体DNA在最佳转化条件下进入在最佳转化条件下进入受体细胞的分子数。由于在一般的转化实验规模下，受体细胞的分子数。

45、由于在一般的转化实验规模下，每个受体细胞最多只能接受一个载体分子，因此转化每个受体细胞最多只能接受一个载体分子，因此转化率的定义也可以表征为：率的定义也可以表征为：每每微克微克载体载体DNA转化后，受转化后，受体细胞接纳体细胞接纳DNA的个数，即克隆数的个数，即克隆数l转化率的计算转化率的计算例如，pUC18对大肠杆菌的转化率为108，即每微克pUC18中只有108个分子能进入受体细胞。一微克pUC18共有3.4X1011个分子（6.02X1017 / 2686X660），也就是说，每3400个pUC18分子才有一个分子进入受体细胞。 另一方面，在实际操作过程中，转化一微克pUC18共需2ml

46、感受态细胞，大约含有2X1010个大肠杆菌细胞，也就是说，每200个细胞只有一个细胞能接纳pUC18 DNA l转化率的影响因素转化率的影响因素l（1 1） 载体及载体及DNA重组分子方面：重组分子方面： l载体本身的性质与插入片段的大小载体本身的性质与插入片段的大小l（2 2）受体细胞方面：）受体细胞方面： l 受体细胞必须与载体相匹配，例如：受体细胞必须与载体相匹配，例如：pBR322转化大肠杆菌转化大肠杆菌JM83株，转化率很低；但对大肠杆株，转化率很低；但对大肠杆菌菌ED8767株的转化率则较高株的转化率则较高 l转化率的影响因素转化率的影响因素l（3 3）转化方法方面：）转化方法方面

47、： lCa2+诱导转化诱导转化 106 - 107 / m mg DNA ll l-DNA转染转染 107 - 108 / m mg DNA l电穿孔转化电穿孔转化 106 - 109 / m mg DNA 3.3.大肠杆菌大肠杆菌DNADNA聚合酶聚合酶 I Il53的的DNA聚合酶活性聚合酶活性l53的核酸外切酶活性的核酸外切酶活性l35的核酸外切酶活性的核酸外切酶活性大肠杆菌大肠杆菌DNA聚合酶聚合酶 I的基本性质：的基本性质：3 G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G-A 55 C-G-A-G-T-OH5 ppp dN Mg2+3 G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G

48、-A 55 C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-OHDNA pol Il缺口前移标记法缺口前移标记法大肠杆菌大肠杆菌DNADNA聚合酶聚合酶 I I 的基本用途：的基本用途：5 G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G-T 33 C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C-A 5 Mg2+ 5 dNTP 5 ppp dA（a a-32P-dATP）5 G-C-T-C A-G-C-T-G-G-A-G-T 33 C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C-A 55 G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G-T 3l制备制备32P标记的探针标记的探针DNase IDNA pol I3 C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C-A 5 大肠杆菌大肠杆菌DNADNA聚合酶聚合酶 I