糖基转移酶和糖苷酶

1、会计学1糖基转移酶和糖苷酶糖基转移酶和糖苷酶第一节第一节 糖基转移酶糖基转移酶( (Glycosyltransferases)l糖基转移酶是一系列参与催化双糖、聚糖糖基转移酶是一系列参与催化双糖、聚糖和糖复合物中糖链合成的一类酶。和糖复合物中糖链合成的一类酶。l负责将活性供体负责将活性供体( (通常是通常是NDP-NDP-糖糖) )的单糖转的单糖转移到糖、蛋白质、脂类、核酸分子上，完移到糖、蛋白质、脂类、核酸分子上，完成糖基化反应。成糖基化反应。l目前发现的糖基转移酶有目前发现的糖基转移酶有100100多种，其主要多种，其主要分布在内质网和高尔基体。分布在内质网和高尔基体。一、糖基转移酶的命名

2、与分类一、糖基转移酶的命名与分类l糖基转移酶的传统分类方法是根据其所转糖基转移酶的传统分类方法是根据其所转移的单糖类型进行分类的。移的单糖类型进行分类的。l如半乳糖转移酶，唾液酸转移酶等。如半乳糖转移酶，唾液酸转移酶等。l另外一种方法是根据序列的同源性、底物另外一种方法是根据序列的同源性、底物/ /产物立体化学异构性以及供体糖进行分类产物立体化学异构性以及供体糖进行分类。l这种分类法糖基转移酶被分为这种分类法糖基转移酶被分为6666个家族及个家族及一个未分类族。一个未分类族。l所有家族只采用两种折叠方式，形成了两所有家族只采用两种折叠方式，形成了两个超家族，分别为个超家族，分别为GT-A和和G

3、T-B超家族。超家族。 糖基转移酶的命名糖基转移酶的命名lGlcNAc T-I的全称为：的全称为：lUDP-N-乙酰葡糖胺乙酰葡糖胺: : -3-甘露糖基甘露糖基 -1,2N-乙酰葡糖胺转移酶。乙酰葡糖胺转移酶。lGlcNAc T-II的全称为：的全称为：lUDP-N-乙酰乙酰葡糖胺葡糖胺: : -6-甘露甘露糖基糖基 -1,2N-乙酰葡糖胺转移酶。乙酰葡糖胺转移酶。 -1,4-Galactosyltransferase Family Fucosyltransferase Family All members of the sialyltransferase genes clonedThe E

4、volutionary History of Glycosyltransferase Genes后生动物后生动物后口动物后口动物脊椎动物脊椎动物哺乳动物哺乳动物原始昆虫原始昆虫无脊椎动物无脊椎动物非哺乳动物非哺乳动物二、糖基转移酶特性二、糖基转移酶特性l一个基一个基因因 一种转移一种转移酶酶 一种连接键一种连接键l糖链的合成不是由基因编码合成的，而是由基因编码的糖基转移酶糖链的合成不是由基因编码合成的，而是由基因编码的糖基转移酶通过糖基化作用，将糖基由其供体转移到受体上完成的。通过糖基化作用，将糖基由其供体转移到受体上完成的。l每个糖基转移酶都有自己特异供体、受体和联接键，这就保证了在每个糖基

5、转移酶都有自己特异供体、受体和联接键，这就保证了在没有模板的情况下合成特异性的糖。没有模板的情况下合成特异性的糖。l糖链可以认为是基因的次级产物糖链可以认为是基因的次级产物, , 一个基因编码一个糖基转移酶一个基因编码一个糖基转移酶, , 一个糖基转移酶专一地催化一个糖苷键的合成，一条糖链的合成就一个糖基转移酶专一地催化一个糖苷键的合成，一条糖链的合成就需要一个多酶系统需要一个多酶系统, , 也就对应了一个基因组。也就对应了一个基因组。糖基转移酶特性糖基转移酶特性l糖基转移酶绝大部分是糖基转移酶绝大部分是II型膜结合蛋白，即型膜结合蛋白，即较短的较短的N-端在胞浆，有一穿膜部分通过内端在胞浆，

6、有一穿膜部分通过内质网或高尔基体膜，长的质网或高尔基体膜，长的C-端在内质网或端在内质网或高尔基体的管腔内。高尔基体的管腔内。l有少数糖基转移酶是有少数糖基转移酶是I型膜结合蛋白，其较型膜结合蛋白，其较短的短的N-端在内质网腔，而很长的端在内质网腔，而很长的C-端则定端则定位于胞浆。位于胞浆。Biological Functions of a Soluble Form of N-acetylglucosaminyltransferase V (GnT-V) Regulation of High Branching in N-linked Oligosaccharides大鼠不同组织中三种大鼠不

7、同组织中三种-乙酰葡糖胺基转移酶乙酰葡糖胺基转移酶( (GlcNAc T) )组织组织活力活力(pmolmg蛋白蛋白h)GlcNAc T-IIGlcNAc T-IVGlcNAc T-V肾肾1840 3301.9 1.630 6脑脑660 488.7 0.738 1胃胃500 1508.2 0.725 1小肠小肠280 9917 1.568 11肺肺104 4.62.6 0.738 4脾脾100 2.520 821 2睾丸睾丸52 2.98.2 0.837 4心心11 1.19.4 1.410 1肝肝81 0.92.8 0.78.2 0.8 三、糖基转移酶的结构域三、糖基转移酶的结构域l属于属于

8、II-型膜结合蛋白的糖基转移酶分成四个型膜结合蛋白的糖基转移酶分成四个结构域。结构域。l氨基端的胞浆域，氨基端的胞浆域，一般少于一般少于2525个个( (最少最少4 4个个) )氨基酸，含正电荷的碱基氨基酸较多；氨基酸，含正电荷的碱基氨基酸较多；l穿膜域，穿膜域，有少量氨基酸残基，富含疏水氨有少量氨基酸残基，富含疏水氨基酸；基酸；l颈区域，颈区域，位于内质网或高尔基体管腔内，位于内质网或高尔基体管腔内，含甘氨酸和脯氨酸残基，有的带有含甘氨酸和脯氨酸残基，有的带有N-糖链糖链。 糖基转移酶的结构域糖基转移酶的结构域l催化域，催化域，为管腔中的最大结构域，呈球状为管腔中的最大结构域，呈球状，约含，

9、约含310-430310-430个个( (最长可达最长可达720720个左右个左右) )氨氨基酸残基，为糖基转移酶最重要的催化区基酸残基，为糖基转移酶最重要的催化区域。域。克隆的哺乳动物糖基转移酶的结构域克隆的哺乳动物糖基转移酶的结构域 四、糖基转移酶的催化特性与功能四、糖基转移酶的催化特性与功能(1)(1)底物专一性底物专一性l糖复合物中糖基的顺序和连接键是由糖基糖复合物中糖基的顺序和连接键是由糖基转移酶的底物专一性和催化特性来决定的转移酶的底物专一性和催化特性来决定的。l对对底物专一底物专一性，性，一个酶的产物常作为下一一个酶的产物常作为下一个酶的底物，这样就保证了糖链中糖基的个酶的底物，

10、这样就保证了糖链中糖基的特定顺序。特定顺序。l因合成的产物结构不同或合成的部位不同因合成的产物结构不同或合成的部位不同，所用的供体和受体也不同。，所用的供体和受体也不同。 糖基转移酶的催化特性糖基转移酶的催化特性l合成糖原时，葡萄糖的供体是合成糖原时，葡萄糖的供体是UDP-Glc，合成淀粉时，则是合成淀粉时，则是ADP-Glc，合成纤维素合成纤维素时是时是GDP-Glc。l对受体的专一性对受体的专一性，在糖蛋白的在糖蛋白的N-糖苷糖苷键连键连接的糖链的外周有接的糖链的外周有6 6种不同的方式连接的种不同的方式连接的N-乙乙酰酰葡葡糖胺糖胺( (GIcNAc),GIcNAc),它们连接在不同甘露

11、它们连接在不同甘露糖基糖基( (Man)Man)的不同的不同糖糖基上基上，分别有分别有6 6个不同个不同的的糖糖基转移酶负责基转移酶负责它它们的转移们的转移，每个酶又每个酶又对应不同的受体对应不同的受体 。不同的糖基转移酶所催化的糖基转移反应不同不同的糖基转移酶所催化的糖基转移反应不同人人B B血型的血型的 1-3半乳糖基转移酶对受体底物的专一性半乳糖基转移酶对受体底物的专一性 糖基转移酶的催化特性糖基转移酶的催化特性l唾液酸化唾液酸化Lewis X四糖抗原合成时，四糖抗原合成时，一般先生成唾液酸化的一般先生成唾液酸化的N-乙酰乳糖胺乙酰乳糖胺，再由，再由 -1,3Fuc T在在G1cNAc上

12、加入上加入Fuc，而不能先合成岩藻糖化的而不能先合成岩藻糖化的N-乙乙酰乳糖胺后再加上酰乳糖胺后再加上NeuAc。因。因 -2,3 NeuAc T不能以不能以 -1,3岩藻糖化糖链岩藻糖化糖链为底物。为底物。 糖基转移酶的催化特性糖基转移酶的催化特性l糖基转移酶也可作用于人工底物，如参与糖基转移酶也可作用于人工底物，如参与糖蛋白糖链合成的糖基转移酶也可利已除糖蛋白糖链合成的糖基转移酶也可利已除去蛋白质而还原末端标记去蛋白质而还原末端标记( (荧光和放射性核荧光和放射性核素素) )的底物。的底物。l不少糖基转移酶对底物的识别实际上只涉不少糖基转移酶对底物的识别实际上只涉及受体底物中接受糖基邻近的

13、少数糖基，及受体底物中接受糖基邻近的少数糖基，故一些人工合成的寡糖衍生物也可作为这故一些人工合成的寡糖衍生物也可作为这些酶的底物。些酶的底物。 糖基转移酶的催化特性糖基转移酶的催化特性(2)(2)二价金属离子的需求二价金属离子的需求l大多数的糖基转移酶都需二价金属离子作大多数的糖基转移酶都需二价金属离子作为辅助因子，缺乏二价金属离子时为辅助因子，缺乏二价金属离子时( (如在如在EDTA存在下存在下) )酶活力很低或丧失。酶活力很低或丧失。l二价金属离子中二价金属离子中Mn2+的激活作用最强，其的激活作用最强，其次是次是Co2+,Mg2+,Ni 2+。l糖基转移酶糖基转移酶 T- -V不需要二价

14、金属离子。不需要二价金属离子。 五、糖基转移酶同源性和抗原性五、糖基转移酶同源性和抗原性l糖基转移酶在结构上的最大特点是不糖基转移酶在结构上的最大特点是不同糖基转移酶一级结构之间的同源性同糖基转移酶一级结构之间的同源性很少，即使转移相同糖基的糖基转移很少，即使转移相同糖基的糖基转移酶也很少有同源性。酶也很少有同源性。l血型血型A抗原的抗原的GalNAc T和血型和血型B抗原抗原的的Gal T同源性达同源性达9999，在，在353353个氨基个氨基酸残基中只有酸残基中只有4 4个不同。个不同。 糖基转移酶同源性和抗原性糖基转移酶同源性和抗原性l不同种属中同一糖基转移酶的同源性不同种属中同一糖基转

15、移酶的同源性极大，其催化结构域的同源性一般均极大，其催化结构域的同源性一般均在在8080以上。以上。l如人、小鼠和兔中如人、小鼠和兔中 -1,2GlcNAc T-I四个结构域的同源性分别为四个结构域的同源性分别为100%100%、90%90%、80%80%和和95%95%。六、糖基转移酶和疾病六、糖基转移酶和疾病l -1,3 T的活性在人体内的重现会引发自身的活性在人体内的重现会引发自身免疫反应。相反，如果人体内免疫反应。相反，如果人体内 -1,4半乳糖半乳糖基转移酶的活性下降，致使正常的免疫球基转移酶的活性下降，致使正常的免疫球蛋白蛋白G (IgG)分子中的糖链半乳糖含量降低分子中的糖链半乳

16、糖含量降低。l它能诱导抗体产生，从而也会出现自身免它能诱导抗体产生，从而也会出现自身免疫，其症状是类风湿。疫，其症状是类风湿。糖基转移酶和疾病糖基转移酶和疾病l细胞癌变过程中常伴有糖链结构改变细胞癌变过程中常伴有糖链结构改变，如如糖链分支末端出现重复糖链分支末端出现重复N-乙酰半乳糖胺结乙酰半乳糖胺结构、唾液酸和岩藻糖含量增加，这些变化构、唾液酸和岩藻糖含量增加，这些变化在临床上常用作肿瘤标记物。在临床上常用作肿瘤标记物。l糖基转移酶就是通过影响糖链的改变糖基转移酶就是通过影响糖链的改变，而而间接关系到癌瘤发生和发展。间接关系到癌瘤发生和发展。糖基转移酶和疾病糖基转移酶和疾病l糖基转移酶的表达

17、和细胞周期密切相关。糖基转移酶的表达和细胞周期密切相关。l在细胞分化阶段在细胞分化阶段，如果糖基转移酶在成熟如果糖基转移酶在成熟细胞中活性很高细胞中活性很高，就会产生癌变就会产生癌变，同时出同时出现早期的分化抗原。现早期的分化抗原。l多聚多聚N-乙酰半乳糖胺链的出现被看成是肿乙酰半乳糖胺链的出现被看成是肿瘤的重要标志。瘤的重要标志。l这些糖链可以减低细胞与基质间的粘着，这些糖链可以减低细胞与基质间的粘着，有利于癌细胞的进一步侵入。有利于癌细胞的进一步侵入。糖基转移酶和疾病糖基转移酶和疾病l与肝癌发生有关的糖基转移酶与肝癌发生有关的糖基转移酶l糖基转移酶在肝癌中活性有明显改变，如糖基转移酶在肝癌

18、中活性有明显改变，如GnT-、GnT-和和 -1, 6岩藻糖基转移酶岩藻糖基转移酶。lGnT-和和GnT-能将一个能将一个N-乙酰葡糖胺转乙酰葡糖胺转移至移至N-糖链五糖核心糖链五糖核心1, 3和和1, 6臂甘露糖上臂甘露糖上,分别形成分别形成 -1,4和和1,6键，使键，使N-糖链天线数增糖链天线数增多，多， -1, 6 FucT则将岩藻糖转移至糖链最则将岩藻糖转移至糖链最内侧内侧( (与天冬酰胺相邻与天冬酰胺相邻) )的的N-乙酰葡糖胺上乙酰葡糖胺上形成核心岩藻糖。形成核心岩藻糖。糖基转移酶和疾病糖基转移酶和疾病l这些结构异常的糖链出现在肿瘤细胞的糖这些结构异常的糖链出现在肿瘤细胞的糖蛋白

19、上蛋白上，使肿瘤细胞表面性质变化使肿瘤细胞表面性质变化，导致导致细胞粘附、侵袭和迁移能力改变细胞粘附、侵袭和迁移能力改变，是造成是造成肿瘤细胞具有侵袭性和转移能力的一个重肿瘤细胞具有侵袭性和转移能力的一个重要原因。要原因。七、糖基转移酶的应用七、糖基转移酶的应用l糖基转移酶在肝癌研究中的应用糖基转移酶在肝癌研究中的应用l恶性肿瘤中糖基转移酶表达及活性改变所恶性肿瘤中糖基转移酶表达及活性改变所致肿瘤细胞表面糖链结构的变化在肿瘤的致肿瘤细胞表面糖链结构的变化在肿瘤的诊断、诊断、预防预防方面有重要意义方面有重要意义。l将糖基转移酶基因转染入肝癌细胞将糖基转移酶基因转染入肝癌细胞，过表过表达的糖基转移

20、酶使细胞内某些蛋白发生糖达的糖基转移酶使细胞内某些蛋白发生糖基化基化, ,产生不同糖型产生不同糖型，通过双向电泳和凝集通过双向电泳和凝集素免疫印迹相结合素免疫印迹相结合，比较转染组和非转染比较转染组和非转染组糖蛋白改变组糖蛋白改变，从而确定蛋白质和糖基化从而确定蛋白质和糖基化的功能关系的功能关系, ,研究研究为糖基化改变在肝癌发生为糖基化改变在肝癌发生中的作用研究奠定了基础。中的作用研究奠定了基础。糖基转移酶的应用糖基转移酶的应用l采用同样技术路线研究与乳腺癌转移相关采用同样技术路线研究与乳腺癌转移相关的糖基化改变的糖基化改变，并从结构上描述糖链并从结构上描述糖链，旨旨在将其作为乳腺癌和其他实

21、体肿瘤诊断工在将其作为乳腺癌和其他实体肿瘤诊断工具和免疫治疗靶点具和免疫治疗靶点。l糖基转移酶在糖基转移酶在糖糖类合成中的应用类合成中的应用l糖类药物在治疗炎症、用作肿瘤疫苗和抗糖类药物在治疗炎症、用作肿瘤疫苗和抗病毒等方面都有其独特的功效。病毒等方面都有其独特的功效。l现在普遍使用的糖类合成方法有两种现在普遍使用的糖类合成方法有两种： 化学合成和酶促合成化学合成和酶促合成l化学合成近年来取得一些进展化学合成近年来取得一些进展，提出了一种提出了一种全自动寡全自动寡糖糖合成法合成法，但在天然复合产物中以但在天然复合产物中以一种糖代替另一种糖仍然困难。一种糖代替另一种糖仍然困难。l酶促合成酶促合成

22、的的产量高、产物产量高、产物具有具有特异立体化学特异立体化学异构性。异构性。糖基转移酶的应用糖基转移酶的应用糖基转移酶的应用糖基转移酶的应用l糖基转移酶可作为研究糖复合物工具糖基转移酶可作为研究糖复合物工具l如研究糖蛋白糖链的结构与功能的关系以如研究糖蛋白糖链的结构与功能的关系以及细胞表面糖基化修饰等。及细胞表面糖基化修饰等。八、八、O-GlcNAc 糖基转移酶在原核糖基转移酶在原核和真核细胞中的表达和提纯和真核细胞中的表达和提纯l南通医学院生物化学教研室与美国纽约州立基础研究所神经生化系南通医学院生物化学教研室与美国纽约州立基础研究所神经生化系合作。合作。lO-GlcNAc 糖基化修饰起到调

23、节蛋白质的活性糖基化修饰起到调节蛋白质的活性，在生命过程的许多在生命过程的许多方面起作用方面起作用( (如核运输如核运输，基因转录及翻译过程基因转录及翻译过程) )。lOGT 基因敲除实验表明蛋白质基因敲除实验表明蛋白质O-GlcNAc 糖基化修饰是胚胎干细胞糖基化修饰是胚胎干细胞存活和个体发育所必需的。存活和个体发育所必需的。l蛋白质的蛋白质的O-GlcNAc 糖基化修饰还调节蛋白质磷酸化，蛋白质的糖基化修饰还调节蛋白质磷酸化，蛋白质的O-GlcNAc 糖基化与磷酸化修饰间存在相互竞争、相互补充的关系。糖基化与磷酸化修饰间存在相互竞争、相互补充的关系。l细胞质和细胞核内的蛋白质细胞质和细胞核

24、内的蛋白质O-GlcNAc糖基糖基化和去糖基化分别由化和去糖基化分别由O-GlcNAc糖基转移酶糖基转移酶( (OGT) )和和O-GlcNAc 糖苷酶催化。糖苷酶催化。l蛋白质的蛋白质的O-GlcNAc糖基化修饰及其生物学糖基化修饰及其生物学意义目前成了蛋白质翻译后修饰领域最热意义目前成了蛋白质翻译后修饰领域最热门的课题之一。门的课题之一。l其研究目的：其研究目的：l用原核和真核细胞表达用原核和真核细胞表达OGT，并用不同的并用不同的方法从这两个系统提纯重组方法从这两个系统提纯重组OGT，获得制获得制备有活性的备有活性的OGT，用于进行用于进行O-GlcNAc糖基糖基酶功能方面的研究。酶功能

25、方面的研究。研究结果研究结果l用大肠杆菌和用大肠杆菌和Hi5 昆虫细胞表达并纯化具有昆虫细胞表达并纯化具有活性的重组活性的重组OGT。l携带人携带人OGTcDNA的的PET 32a 质粒在大肠杆质粒在大肠杆菌中表达出带有菌中表达出带有1个个S-Tag 的重组人的重组人OGT 融融合蛋白，然后用与合蛋白，然后用与S-蛋白质偶联的琼脂糖蛋白质偶联的琼脂糖凝胶颗粒从细菌裂解液中亲和层析纯化得凝胶颗粒从细菌裂解液中亲和层析纯化得到到OGT 融合蛋白。融合蛋白。l其纯化的其纯化的OGT在电泳中显现单一条带并具在电泳中显现单一条带并具有生物活性有生物活性，但其活性在洗脱后丧失。但其活性在洗脱后丧失。IPT

26、G 诱导重组诱导重组OGT 在在BL 21 大肠杆菌中的表达大肠杆菌中的表达大肠杆菌中表达的重组大肠杆菌中表达的重组OGT 经经S-蛋白质凝胶纯化蛋白质凝胶纯化研究结果研究结果l在在Hi5 昆虫细胞中表达的鼠肝昆虫细胞中表达的鼠肝OGT，经镍离子螯合柱纯化后经镍离子螯合柱纯化后, 其比其比活性达到活性达到0.88 nmolmin-1mg-1OGT。Hi5 细胞中表达的重组细胞中表达的重组OGT 的纯化的纯化甜菊糖基转移酶基因的克隆及序列分析甜菊糖基转移酶基因的克隆及序列分析l利用与植物次生代谢产物糖基化相关的利用与植物次生代谢产物糖基化相关的UDPG糖基转移酶的特征性保守区域糖基转移酶的特征性

27、保守区域，设计设计了同源引物了同源引物。l以甜菊基因组以甜菊基因组DNA 为模板，为模板，PCR 扩增获得扩增获得甜菊糖基转移酶基因片段甜菊糖基转移酶基因片段。l根据获得的基因片段设计引物根据获得的基因片段设计引物GSTr 和和GSTf ，分别与分别与cDNA文库的文库的T3 和和T7 通用通用引物扩增获得全长核苷酸序列的甜菊糖基引物扩增获得全长核苷酸序列的甜菊糖基转移酶基因。转移酶基因。The level of expression of plant glycosyltransferasesTransgenic pigs with GnT-IIIRecombinant plant glyco

28、syltransferases reported recently (20012004)葡糖基转移酶多肽疫苗葡糖基转移酶多肽疫苗HDS免疫大鼠的实验研究免疫大鼠的实验研究l葡糖基转移酶葡糖基转移酶是致是致龋龋菌的重要致病因素之一菌的重要致病因素之一， 具有利用具有利用蔗糖蔗糖合成细胞外葡聚合成细胞外葡聚糖糖的催化的催化活性和活性和结合结合葡聚糖的活性葡聚糖的活性，在细菌附着和菌在细菌附着和菌斑形成的过程中起着重要作用斑形成的过程中起着重要作用。l抑制抑制GTF活性活性，减少葡聚糖的产生是控制菌减少葡聚糖的产生是控制菌震斑预防震斑预防龋龋病的重要手段之一病的重要手段之一。l目的：目的： 动物体内

29、研究葡糖基转移酶多肽疫苗动物体内研究葡糖基转移酶多肽疫苗HDS 免疫原性和防龋效果。免疫原性和防龋效果。葡糖基转移酶多肽疫苗葡糖基转移酶多肽疫苗HDS免疫大鼠的实验研究免疫大鼠的实验研究l方法：方法： 构建大鼠人工龋模型，分别用人工抗原构建大鼠人工龋模型，分别用人工抗原HDS-KLH，多肽抗原多肽抗原HDS，葡糖基转移酶葡糖基转移酶( (GTF) )免疫大鼠，酶联免疫吸附法检测大鼠免疫大鼠，酶联免疫吸附法检测大鼠血清和唾液中抗血清和唾液中抗HDS、GTF抗体；体视显抗体；体视显微镜下观察各组大鼠磨牙龋坏情况，并用微镜下观察各组大鼠磨牙龋坏情况，并用Keyes计分法计分。计分法计分。葡糖基转移酶

30、多肽疫苗葡糖基转移酶多肽疫苗HDS免疫大鼠的实验研究免疫大鼠的实验研究l结果：结果：lHDS-KLH免疫组大鼠唾液、血清中抗免疫组大鼠唾液、血清中抗HDS IgG和和IgA 水平均高于对照组水平均高于对照组(P 0.05)；HDS-KLH，HDS，GTF免疫组大鼠龋免疫组大鼠龋Keyes 计分均低于对照组计分均低于对照组( P 0101)，光光滑面防龋效果最为显著。滑面防龋效果最为显著。l结论：结论：l人工抗原人工抗原 HDS-KLH 能刺激机体产生针对能刺激机体产生针对GTF 的保护性免疫的保护性免疫，并减少实验大鼠龋齿并减少实验大鼠龋齿发生。发生。葡糖基转移酶抗体的制备与研究葡糖基转移酶抗

31、体的制备与研究l以葡糖基转移酶免疫产蛋母鸡。以葡糖基转移酶免疫产蛋母鸡。l应用酶联免疫吸附测定法测定鸡蛋黄中免应用酶联免疫吸附测定法测定鸡蛋黄中免疫球蛋白的活性。疫球蛋白的活性。l经葡糖基转移酶免疫后可以得到高效价的经葡糖基转移酶免疫后可以得到高效价的蛋黄抗体，其抗远援链球菌的效价约为一蛋黄抗体，其抗远援链球菌的效价约为一般般IgY的的1616倍。倍。 l体外模拟实验表明经远援链球菌免疫的蛋体外模拟实验表明经远援链球菌免疫的蛋黄抗体确实有抗牙菌斑形成的能力，从而黄抗体确实有抗牙菌斑形成的能力，从而具备防龋齿的功效。具备防龋齿的功效。第二节第二节 糖苷酶糖苷酶l糖糖苷苷酶酶( (G1ycosid

32、ase) )是一大类催化糖是一大类催化糖苷苷键水键水解解的酶的酶类。类。l其主要分布在动物、植物、微生物体内，其主要分布在动物、植物、微生物体内，担负着水解各种担负着水解各种糖糖苷苷、寡、寡糖糖、多、多糖糖、复杂、复杂多糖以供机体多糖以供机体利利用的生物学功能用的生物学功能。l大多数糖苷酶水解典型大多数糖苷酶水解典型O-糖苷键糖苷键，也有部，也有部分水解分水解N-糖苷键糖苷键，有一些糖苷酶水解，有一些糖苷酶水解S-糖糖苷键苷键。一、一、糖苷酶的分类糖苷酶的分类l按照酶的作用方式和水解产物可把糖苷酶按照酶的作用方式和水解产物可把糖苷酶分为两大类：分为两大类：l外切糖苷酶类（外切糖苷酶类（Exog

33、lycosidases)： 它们的作用方式是从糖链的非还原端开始它们的作用方式是从糖链的非还原端开始，逐步将糖苷键切断，所得到的水解产物，逐步将糖苷键切断，所得到的水解产物为单糖或双糖；为单糖或双糖；l内切糖苷酶类（内切糖苷酶类（Endoglycosidases)： 它们从糖链的中间打断糖苷键，水解产物它们从糖链的中间打断糖苷键，水解产物为分子量小于原来底物的寡糖。为分子量小于原来底物的寡糖。Exo-1-4-Beta-D-Glycanase二、二、糖苷酶的分布糖苷酶的分布l糖苷酶在自然界有广泛分布，几乎所有动糖苷酶在自然界有广泛分布，几乎所有动物、植物和微生物体内都能找到糖苷键。物、植物和微生

34、物体内都能找到糖苷键。l在哺乳动物中，血清、血细胞、体液、各在哺乳动物中，血清、血细胞、体液、各种组织器官中都有存在。种组织器官中都有存在。l许多软体动物也是糖苷酶的良好来源。许多软体动物也是糖苷酶的良好来源。l植物种子里有丰富的糖苷酶。植物种子里有丰富的糖苷酶。l一些细菌、酵母、霉菌的糖苷酶已有相当一些细菌、酵母、霉菌的糖苷酶已有相当的研究报道。的研究报道。三、三、糖苷酶的命名糖苷酶的命名l糖苷酶的命名与它的底物专一性密切相关糖苷酶的命名与它的底物专一性密切相关。l底物专一性包含：底物专一性包含：l糖基一侧的专一性；糖基一侧的专一性；l糖苷键的糖苷键的 - - - -异头专一性；异头专一性；

35、l糖苷配基一侧的专一性。糖苷配基一侧的专一性。l糖苷酶的命名是根据糖基一侧的专一性和糖苷酶的命名是根据糖基一侧的专一性和糖苷键的糖苷键的 - - - -异头专一性来命名的。异头专一性来命名的。l - -葡萄糖苷酶、葡萄糖苷酶、 - -葡萄糖苷酶、葡萄糖苷酶、 - -半乳糖半乳糖苷酶、苷酶、 - -甘露甘露糖苷酶等。糖苷酶等。(1)(1)糖基一侧的专一性糖基一侧的专一性(2)(2)糖苷键的糖苷键的 - - - -异头专一性异头专一性(3)(3)糖基配基一侧的专一性糖基配基一侧的专一性四、四、糖苷酶的生物学功能糖苷酶的生物学功能(1)(1)分泌到细胞外的糖苷酶，参与营养物质的分泌到细胞外的糖苷酶，

36、参与营养物质的胞外消化吸收过程。胞外消化吸收过程。(2)(2)细胞内的糖苷酶，如动物细胞内的溶酶体细胞内的糖苷酶，如动物细胞内的溶酶体中有一系列糖苷酶，它们的功能是降解胞中有一系列糖苷酶，它们的功能是降解胞内的糖复合物。内的糖复合物。(3)(3)参与糖链的合成，如在糖蛋白生物合成过参与糖链的合成，如在糖蛋白生物合成过程中，参加程中，参加N-型糖链的型糖链的“剪枝剪枝”， “修剪修剪”成较短分支成较短分支(Man3GlcNAc-Asn)结构，结构，然后再由糖基转移酶加上新的糖基，形成然后再由糖基转移酶加上新的糖基，形成不同结构的糖链。不同结构的糖链。Biological Roles of N-g

37、lycanase in Cells五、一些常见的五、一些常见的糖苷酶糖苷酶l -D-甘露糖苷酶甘露糖苷酶l -D-甘露糖苷酶甘露糖苷酶l - D-木糖苷酶木糖苷酶l , -鼠李糖苷酶鼠李糖苷酶l -D-葡萄糖苷酶葡萄糖苷酶l -D-葡萄糖苷酶：葡萄糖苷酶： 海藻糖酶、淀粉葡萄糖苷酶、葡聚糖蔗糖海藻糖酶、淀粉葡萄糖苷酶、葡聚糖蔗糖酶、淀粉麦芽糖酶。酶、淀粉麦芽糖酶。 l唾液酸酶唾液酸酶( (神经氨酸酶类神经氨酸酶类) )。一些常见的一些常见的糖苷酶糖苷酶l -D-半乳糖苷酶半乳糖苷酶l -D-半乳糖苷酶半乳糖苷酶l -D-N-乙酰半乳糖胺酶乙酰半乳糖胺酶l -D-N-乙酰己糖胺酶乙酰己糖胺酶 l

38、 -D-N-乙酰葡糖胺酶乙酰葡糖胺酶l -D-N-乙酰半乳糖胺酶乙酰半乳糖胺酶l -D-岩澡塘苷酶岩澡塘苷酶l -L-岩澡塘苷酶岩澡塘苷酶水解不同类型糖苷键的糖苷酶水解不同类型糖苷键的糖苷酶六、六、糖苷酶的制备方法糖苷酶的制备方法l黄芪皂苷糖苷酶产生菌的筛选黄芪皂苷糖苷酶产生菌的筛选l将筛选用将筛选用菌株菌株Absida sp. A9r 、A84r 、A9r 、A8r 、A38r 、Arr进行培养制备酶进行培养制备酶液液 以黄芪总皂苷为底物进行诱导以黄芪总皂苷为底物进行诱导 薄薄层层析法层层析法检测水解结果检测水解结果。l结果：结果：A bsida sp. A3r 菌所产酶液能较菌所产酶液能较

39、好的水解黄芪总皂苷中糖基较多的皂苷好的水解黄芪总皂苷中糖基较多的皂苷，进而生成糖基较少的皂苷。进而生成糖基较少的皂苷。l绿色木霉产生的外切绿色木霉产生的外切- -葡聚糖苷酶葡聚糖苷酶l从潮湿的树皮及腐烂的木块上采集样本从潮湿的树皮及腐烂的木块上采集样本 加适量的无菌水温和搅拌加适量的无菌水温和搅拌取取1 ml 悬浊液悬浊液, ,分别涂于含有滤纸的固体筛选培养基上分别涂于含有滤纸的固体筛选培养基上待长出若干菌落后，对生长良好的菌种待长出若干菌落后，对生长良好的菌种进行分离进行分离以以羧甲基纤维素钠为底物分别羧甲基纤维素钠为底物分别测定其所产酶活性。测定其所产酶活性。l菌培养液菌培养液过滤过滤上清

40、液上清液硫酸铵沉淀硫酸铵沉淀Sephadex 柱层析柱层析DEAE2纤维素纤维素52 阴阴离子交换柱层析离子交换柱层析收集洗脱纯酶液。收集洗脱纯酶液。l一株神经节苷脂内切糖苷酶产生菌的分离一株神经节苷脂内切糖苷酶产生菌的分离l采用神经节苷脂选择性培养基，从土壤微采用神经节苷脂选择性培养基，从土壤微生物中筛选得到一株产神经节苷脂内切糖生物中筛选得到一株产神经节苷脂内切糖苷酶的菌株苷酶的菌株YW2112，该酶能特异性水解该酶能特异性水解神经节苷脂中连接神经酰胺和寡糖链之间神经节苷脂中连接神经酰胺和寡糖链之间的糖苷键，是研究神经节苷脂结构与功能的糖苷键，是研究神经节苷脂结构与功能的重要工具酶。的重要

41、工具酶。l人参糖苷酶提取人参糖苷酶提取l目的目的： 用于对人参皂苷进行改造的糖苷酶。用于对人参皂苷进行改造的糖苷酶。l方法：方法： 从鲜人参根中提取人参皂苷酶从鲜人参根中提取人参皂苷酶，乙醇沉淀乙醇沉淀，离子交换层析纯化离子交换层析纯化，凝胶电泳分析凝胶电泳分析，薄薄层色谱法测酶活力。层色谱法测酶活力。l结果：结果： 经离子交换层析得到人参皂苷经离子交换层析得到人参皂苷 -葡糖苷酶葡糖苷酶。七、七、糖苷酶的分离、纯化和测定糖苷酶的分离、纯化和测定l糖苷酶的分离纯化，在原则和技术方法上糖苷酶的分离纯化，在原则和技术方法上和一般的蛋白质或酶的分离纯化没有区别和一般的蛋白质或酶的分离纯化没有区别。l

42、常用的方法：常用的方法： 盐析盐析( (硫酸铵沉淀硫酸铵沉淀) )、柱层析、柱层析( (离子交换、离子交换、凝胶过滤、亲和层析、吸附凝胶过滤、亲和层析、吸附)， 电泳等。电泳等。一些糖苷酶的分离纯化方法一些糖苷酶的分离纯化方法来来 源源酶的名称酶的名称方方 法法刀豆粉刀豆粉 -甘露糖苷酶甘露糖苷酶乙醇沉淀、凝胶过滤、离子交换乙醇沉淀、凝胶过滤、离子交换 -N-乙酰己糖胺酶乙酰己糖胺酶柱层析柱层析 -半乳糖苷酶半乳糖苷酶无花果无花果 -半乳糖苷酶半乳糖苷酶丙酮沉淀、凝胶过滤、离子交换丙酮沉淀、凝胶过滤、离子交换柱层析、等电聚胶柱层析、等电聚胶产气夹膜梭菌产气夹膜梭菌 -N-乙酰葡糖胺酶乙酰葡糖胺

43、酶 -N-乙酰半乳糖胺酶乙酰半乳糖胺酶 -半乳糖苷酶半乳糖苷酶硫酸铵沉淀、凝胶过滤、离子交硫酸铵沉淀、凝胶过滤、离子交换柱层析、制备电泳换柱层析、制备电泳猪肾猪肾 -甘露糖苷酶甘露糖苷酶硫酸铵沉淀、丙酮沉淀、热处理硫酸铵沉淀、丙酮沉淀、热处理( (60C，15分钟分钟) )、吸附、吸附柱层析、凝柱层析、凝胶过滤、制备电泳胶过滤、制备电泳亲和层析法分离纯化糖苷酶亲和层析法分离纯化糖苷酶酶的名称酶的名称所用的吸附剂所用的吸附剂 -N-乙酰己糖胺酶乙酰己糖胺酶Sepharose-ConA(刀豆凝集素刀豆凝集素) -甘露糖苷酶甘露糖苷酶 -半乳糖苷酶半乳糖苷酶 -半乳糖苷酶半乳糖苷酶葡萄糖醛酸苷酶葡萄

44、糖醛酸苷酶Sepharose- -氨基乙酰甘露糖胺氨基乙酰甘露糖胺Sepharose-6-氨基乙基氨基乙基-1-硫硫- -D-吡喃半乳糖苷吡喃半乳糖苷聚丙聚丙酰胺酰胺-对氨基苯基对氨基苯基-硫代硫代半乳糖苷半乳糖苷琼脂糖琼脂糖-糖苷酶活性测定糖苷酶活性测定l糖苷酶活性测定：糖苷酶活性测定：(1)(1)最常用的方法是以合成的对硝基苯酚糖苷化合物作为底物，在酶作最常用的方法是以合成的对硝基苯酚糖苷化合物作为底物，在酶作用下释放出的对硝基苯酚，在碱性条件下呈黄色，可用分光光度计用下释放出的对硝基苯酚，在碱性条件下呈黄色，可用分光光度计法定量测定。法定量测定。(2)(2)把伞形酮类萤光化合物把伞形酮类

45、萤光化合物(4-(4-Methyumbelliferone) )结合到神经氨酸的结合到神经氨酸的半缩醛羟基上，生成半缩醛羟基上，生成4-4-甲基伞形酮基甲基伞形酮基N-N-乙酰神经氨酸苷，用做神经乙酰神经氨酸苷，用做神经氨酸苷酸的底物。在酶作用下，释放出发萤光的氨酸苷酸的底物。在酶作用下，释放出发萤光的4-4-甲基伞形酮，用甲基伞形酮，用360360nmnm波长光作激发光，在波长光作激发光，在440440nmnm波长处测发射光，可定量地测定释波长处测发射光，可定量地测定释放的放的4-4-甲基伞形圈。甲基伞形圈。糖苷酶活性测定糖苷酶活性测定(3)(3)需要以合成的或天然的双糖需要以合成的或天然的

46、双糖、寡糖、糖肽寡糖、糖肽甚至糖脂作为底物的方法。甚至糖脂作为底物的方法。l有两种情况：有两种情况：l一是测定糖苷酶作用下从非还原端释放的一是测定糖苷酶作用下从非还原端释放的单糖。用双糖单糖。用双糖 - -O-2-L-O-2-L-吡喃岩藻糖基吡喃岩藻糖基- -D- -半半乳糖为底物。释放出来的岩藻糖，可以转乳糖为底物。释放出来的岩藻糖，可以转变为三甲基硅醚衍生物，气相色谱上测定变为三甲基硅醚衍生物，气相色谱上测定。糖苷酶活性测定糖苷酶活性测定l二是在酶作用下，非还原端的糖基释放后二是在酶作用下，非还原端的糖基释放后，测定其余下的部分。，测定其余下的部分。l采用萤光化合物采用萤光化合物( ( -

47、 -氨基吡啶氨基吡啶, 5-, 5-二甲氨基二甲氨基萘磺酰基等萘磺酰基等) )标记在底物糖链的还原末端，标记在底物糖链的还原末端，结合使用高效液相色谱分离，用萤光分光结合使用高效液相色谱分离，用萤光分光光度计检测酶活性。光度计检测酶活性。八、八、糖苷酶的应用糖苷酶的应用l在糖链结构研究中的应用在糖链结构研究中的应用l作为工具酶的糖苷酶作为工具酶的糖苷酶l -D-半乳糖苷酶半乳糖苷酶l -D-N-乙酰半乳糖胺酶乙酰半乳糖胺酶l -D-N-乙酰己糖胺酶乙酰己糖胺酶 l -D-N-乙酰葡糖胺酶乙酰葡糖胺酶l -D-N-乙酰半乳糖胺酶乙酰半乳糖胺酶l -D-岩澡塘苷酶岩澡塘苷酶l -L-岩澡塘苷酶岩澡

48、塘苷酶1 1、作为工具酶的糖苷酶作为工具酶的糖苷酶l糖蛋白、糖脂和蛋白聚糖等糖复合物在生糖蛋白、糖脂和蛋白聚糖等糖复合物在生物体内，尤其是在细胞表面携带着生物的物体内，尤其是在细胞表面携带着生物的信息，在分子识别过程中起着重要作用。信息，在分子识别过程中起着重要作用。l研究其功能，首先要研究其结构。研究其功能，首先要研究其结构。l阐明一种糖复合物的糖链结构往往需要综阐明一种糖复合物的糖链结构往往需要综合运用多种技术方法包括过碘酸氧化、甲合运用多种技术方法包括过碘酸氧化、甲基化反应、红外光谱、核磁共振以及糖苷基化反应、红外光谱、核磁共振以及糖苷酶作用等。酶作用等。l糖苷酶的使用在糖链结构研究主要

49、体现在糖苷酶的使用在糖链结构研究主要体现在以下几个方面：以下几个方面：(1)(1)外切糖苷酶的作用特点和底物专一性外切糖苷酶的作用特点和底物专一性l通过糖苷酶水解，能切下非还原末端的一通过糖苷酶水解，能切下非还原末端的一个单糖，同时提供关于糖基的组成、排列个单糖，同时提供关于糖基的组成、排列顺序以及糖苷键的顺序以及糖苷键的 - -或或 - -异头构型的信息异头构型的信息。l糖基组成，用糖链完全酸水解，加上纸色糖基组成，用糖链完全酸水解，加上纸色谱或气相色谱分析得到的结果，可以和应谱或气相色谱分析得到的结果，可以和应用糖苷酶所得到的结果相印证。用糖苷酶所得到的结果相印证。外切糖苷酶的作用特点和底

50、物专一性外切糖苷酶的作用特点和底物专一性l糖链中糖基的连接顺序分析，甲基化反应糖链中糖基的连接顺序分析，甲基化反应过碘酸氧化和核磁共振等方法，结合糖苷过碘酸氧化和核磁共振等方法，结合糖苷酶的逐步水解方法，可提供顺序的信息。酶的逐步水解方法，可提供顺序的信息。l采用核磁共振和红外光谱法分析糖苷键的采用核磁共振和红外光谱法分析糖苷键的 - -或或 - -异头构型。在不具备这些大型仪器异头构型。在不具备这些大型仪器的条件下，可采用糖苷酶水解的。的条件下，可采用糖苷酶水解的。(2)(2)打开糖肽键获得完整糖链打开糖肽键获得完整糖链l打开打开O-型糖肽键常用的方法是采用稀碱水型糖肽键常用的方法是采用稀碱

51、水解解( - -消除反应消除反应)的方法。的方法。l打开打开N-型糖肽键主要采用肼解法。型糖肽键主要采用肼解法。l可采用糖苷酶方法打开糖肽键，获得天然可采用糖苷酶方法打开糖肽键，获得天然的完整糖链。的完整糖链。l - -N- -乙乙酰葡糖胺内切酶酰葡糖胺内切酶H(Endo-H)的应用的应用，在多甘露糖型，在多甘露糖型N- -型糖链的研究中，收到型糖链的研究中，收到良好效果。良好效果。(3)(3)获得短糖链获得短糖链l有些植物或微生物来源的糖链，分子有些植物或微生物来源的糖链，分子量大，并有重复的寡糖结构单位，可量大，并有重复的寡糖结构单位，可以应用合适的内切糖苷酶，将长的糖以应用合适的内切糖苷

52、酶，将长的糖链打断成为较短的寡糖片段，有利于链打断成为较短的寡糖片段，有利于结构研究。结构研究。2 2、用于糖链结构研究的外切糖、用于糖链结构研究的外切糖苷酶苷酶l从肺炎双球菌的培养液中纯化得到从肺炎双球菌的培养液中纯化得到 -半乳半乳糖苷酶，可以水解糖苷酶，可以水解Gal- -1,4GlcNAc糖苷糖苷键，但不能水解键，但不能水解 -1,3和和 -1,6键，表现出严键，表现出严格的对取代位置的专一性要求。格的对取代位置的专一性要求。l -半乳糖苷酶常用于半乳糖苷酶常用于N-型糖链的结构分析型糖链的结构分析，因为在，因为在N-型糖链中，型糖链中，Gal-G1cNAc之间之间的连键多为的连键多为

53、 -1,4。用于糖链结构研究的外切糖用于糖链结构研究的外切糖苷酶苷酶l - -半乳糖苷酶半乳糖苷酶l - -半乳糖苷酶半乳糖苷酶l - -甘露糖苷酶甘露糖苷酶l - -甘露糖苷酶甘露糖苷酶l - -岩藻糖苷酶岩藻糖苷酶l - -N-N-乙酰己糖胺酶乙酰己糖胺酶l - -N-N-乙酰半乳糖胺酶乙酰半乳糖胺酶l唾液酸苷酶唾液酸苷酶 - -半乳糖苷酶的底物专一性半乳糖苷酶的底物专一性 -岩藻糖苷酶的底物专一性岩藻糖苷酶的底物专一性唾液酸唾液酸苷酶的底物专一性苷酶的底物专一性 - -半乳糖苷酶的底物专一性半乳糖苷酶的底物专一性3 3、用于糖链结构研究的内切糖、用于糖链结构研究的内切糖苷酶苷酶l内切糖苷

54、酶主要体现在对糖基一侧整内切糖苷酶主要体现在对糖基一侧整个寡糖链的结构有专一要求。个寡糖链的结构有专一要求。l它们它们作用于作用于糖链的中间打断糖苷键，糖链的中间打断糖苷键，水解产物为分子量小于原来底物的寡水解产物为分子量小于原来底物的寡糖。糖。用于糖链结构研究的内切糖用于糖链结构研究的内切糖苷酶苷酶l - -N-N-乙酰葡糖胺内切酶乙酰葡糖胺内切酶l - -N-N-乙酰半乳糖胺内切酶乙酰半乳糖胺内切酶l - -半乳糖苷内切酶半乳糖苷内切酶l -1,6-1,6甘露聚糖内切酶甘露聚糖内切酶l -1,4-1,4氨基半乳糖苷内切酶氨基半乳糖苷内切酶几种内切糖几种内切糖苷酶的底物专一性苷酶的底物专一性

55、(1) (1) -N-乙酰乙酰葡糖胺内切酶葡糖胺内切酶l按其来源和底物专一性的差别，共分四种。按其来源和底物专一性的差别，共分四种。(1)它们都能水解它们都能水解N- -型糖中紧挨着天冬酰胺的两个型糖中紧挨着天冬酰胺的两个N- -乙酰葡糖胺之间的乙酰葡糖胺之间的 - -1,4连接键。连接键。(2)Endo-D和和Endo-C1的底物专一性完全相同。的底物专一性完全相同。 都要求在糖基一侧有一个三碳结构。非还原末端的都要求在糖基一侧有一个三碳结构。非还原末端的 - -甘露糖残基必甘露糖残基必需没有被其他糖取代。需没有被其他糖取代。 - -N-N-乙酰葡糖胺内切酶乙酰葡糖胺内切酶(3)(3)ind

56、o-Hindo-H的底物专一性，在糖基一例要求一的底物专一性，在糖基一例要求一个四糖结构个四糖结构: : 非还原末端的非还原末端的 - -甘露糖必需是，或者不被甘露糖必需是，或者不被取代、或者是仅仅取代在取代、或者是仅仅取代在C- -2位置上。位置上。卵清蛋白糖肽的一条糖链卵清蛋白糖肽的一条糖链 - -N-N-乙酰葡糖胺内切酶乙酰葡糖胺内切酶(4)(4)Endo-C11Endo-C11的底物专一性，在糖基一侧要求的底物专一性，在糖基一侧要求一个分枝的五糖单位，并且两个处于还原一个分枝的五糖单位，并且两个处于还原末端的末端的 - -甘露糖残基都必需、或者不被别甘露糖残基都必需、或者不被别的糖基取

57、代的糖基取代，或者仅取代在或者仅取代在C-2C-2位置上。位置上。lEndo-C11Endo-C11在糖苷配基一侧的专一性要求，在糖苷配基一侧的专一性要求，和和Endo-HEndo-H一样，不容许有岩藻糖的取代。一样，不容许有岩藻糖的取代。(2) (2) - -N-N-乙酰半乳糖苷内切酶乙酰半乳糖苷内切酶l蛋白的蛋白的O-O-型糖链中最常见的一种，是由糖型糖链中最常见的一种，是由糖链还原末端的链还原末端的N-N-乙酰半乳糖胺和糖链中的乙酰半乳糖胺和糖链中的丝氨酸或苏氨酸的羟基以丝氨酸或苏氨酸的羟基以 -0-0-糖苷键连接糖苷键连接而成。而成。 - -N-N-乙酰半乳糖胺内切酶能够切开乙酰半乳糖

58、胺内切酶能够切开这个连键，把这个连键，把0-0-型糖链和肽链完全分开。型糖链和肽链完全分开。(3) (3) - -半乳糖苷内切酶半乳糖苷内切酶l糖基一侧必须是一个三糖单位，失去非还糖基一侧必须是一个三糖单位，失去非还原末端的半乳糖原末端的半乳糖- -乙酰半乳糖胺，都不能成乙酰半乳糖胺，都不能成为该酶的底物。为该酶的底物。l糖苷配基一侧必须是糖苷配基一侧必须是N-N-乙酰葡糖胺或葡萄乙酰葡糖胺或葡萄糖。糖。l被酶水解打开的糖苷键必须是被酶水解打开的糖苷键必须是 -1,4-1,4连接。连接。l这个内切酶只能用于带有血型这个内切酶只能用于带有血型A(A(或或B)B)决定决定簇的糖链，能作用于血型物质

59、簇的糖链，能作用于血型物质H H。(4) (4) 其他内切糖其他内切糖苷酶苷酶l来自灰色链霉菌发酵液的一个氨基半乳糖来自灰色链霉菌发酵液的一个氨基半乳糖苷内切酶，可以水解苷内切酶，可以水解 - -氨基半乳糖苷键。氨基半乳糖苷键。用于一种真菌所产生的氨基半乳聚糖的结用于一种真菌所产生的氨基半乳聚糖的结构研究。构研究。l来自一株土壤芽孢杆菌的来自一株土壤芽孢杆菌的 -1,-1,6 6甘露聚糖酶甘露聚糖酶，能水解无侧链取代的，能水解无侧链取代的 -1,-1,6 6甘露糖糖苷键甘露糖糖苷键，在研究酵母胞壁外层甘露聚糖结构时，在研究酵母胞壁外层甘露聚糖结构时，将大分子甘露聚糖外侧链打断，获得靠近将大分子

60、甘露聚糖外侧链打断，获得靠近天冬酰胺结合位置的内核结构。天冬酰胺结合位置的内核结构。4 4、应用中的问题、应用中的问题l在应用糖苷酶进行糖链结构研究时，在应用糖苷酶进行糖链结构研究时，所取得的实验结果，应对照其他技术所取得的实验结果，应对照其他技术方法提供的信息，小心加以解释，以方法提供的信息，小心加以解释，以免引出错误的结论。免引出错误的结论。l影响糖苷酶测定结果的因素很多，大影响糖苷酶测定结果的因素很多，大致有以下几个方面：致有以下几个方面：(1) (1) 工具酶的选择工具酶的选择l任何一助糖苷酶都可用于糖链结构研任何一助糖苷酶都可用于糖链结构研究的工具酶。究的工具酶。l一般应选择文献中常